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방법 논문

중증 환자에서 전혈 내독소 혈증 검출을 위한 내독소 활성 분석

9.4K 조회수

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DOI:

10.3791/58507

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2019년 6월 24일

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1Department of Anesthesia and Critical Care, Niguarda Hospital, 2University of Milan-Bicocca Medical School

이 논문에서

요약

우리는 인간 전혈 샘플의 내독소 활성을 침대 옆에서 측정하는 프로토콜을 제시한다. 내독소 활성 분석실험은 수행하기 위한 간단한 검사이며 패혈증을 가진 중증 환자에서 유용한 바이오마커일 수 있다.

초록

또한 내독소로 알려진 Lipopolysaccharide는, 그람 음성 박테리아의 근본적인 분대이고 패혈증과 패혈증 쇼크의 발달에 있는 결정적인 역할을 합니다. 중요한 질병으로 급속하게 진화하고 있는 전염하는 프로세스의 초기 확인은 더 빠르고 집중적인 처리를 자극할 수 있고, 그로 잠재적으로 더 나은 참을성 있는 결과로 이끌어 냅니다. 내독소 활성 (EA) 분석은 전신 내독소혈증의 신뢰할 수있는 바이오 마커로서 침대 옆에서 사용할 수 있습니다. 높은 내독소 활성 수준의 검출은 반복적으로 패혈증 및 패혈증 쇼크 환자에서 증가 된 질병 심각도와 연관되는 것으로 나타났습니다. 분석 은 빠르고 수행하기 쉽습니다. 간략하게, 샘플링 후, 전혈의 aliquot는 항 내독소 항체와 추가 된 LPS와 혼합됩니다. 내독소 활성은 화학발광에 의해 검출된 바와 같이 프라이밍된 호중구의 상대적인 산화 파열로 측정된다. 분석의 출력은 0(부재)에서 1(최대)까지의 척도로 표현되고 "낮음"(&0.4 단위), "중간"(0.4-0.59 단위) 또는 "높음"(≥0.6 단위)으로 분류됩니다. EA 분석의 구현에 대한 자세한 방법론과 근거는이 원고에보고된다.

서론

또한 내독소로 알려진 리포 폴리 당류 (LPS), 그람 음성의 막 구조의 핵심 구성 요소입니다 (GN) 박테리아. 그것은 세포벽의 대략 10%를 구성합니다, 외부 막 무결성 및 항상성에 대 한 중요 한 되 고. 더욱이, 숙주 내장 면역체계1,2의강력한 활성제이다.

LPS에 선천적인 면역 계통 세포의 생체외 노출은 다중유전자의 발현에 있는 변경으로 이끌어 냅니다 3. 건강한 인간 지원자에서 매우 소량의 LPS를 투여하면 급성 전신 염증의 폭포를 유발하는 반면 패혈증 및 패혈증 쇼크는 더 높은 내독소 농도로 발생할 수 있습니다4,5.

패혈증은 생명을 위협하는 상태이며, 즉시 인식되지 않으면 다기관 실패와 사망으로 이어질 수 있습니다. 정화조 환자는 적극적인 소생술, 적절한 항생제 치료, 최적의 소스 제어 및 신속한 장기 지원 전략으로 적시에 치료해야합니다. 패혈증의 병인학의 진단은 주로 임상 적 인식 및 배양 계병원체 검출에 기초한다 6. 그러나, 미생물 배양의 결과는 48 시간까지 걸릴 수 있고 케이스7의 30%까지에서결정적입니다. 조기 식별 및 개입은 더 나은 환자 결과로 이끌어 낼 수 있습니다. 패혈증이 의심되는 환자에서, 결정은 종종 내독증의 명확한 징후없이 생리적 및 생화학적 매개 변수에 기초하여 이루어집니다.

내독소 활성(EA)의 측정은 상업적 분석(물질 표참조)을 통해 전혈을 통해 얻을 수 있다. 특히 패혈증 쇼크 를 개발할 위험이 있는 환자에서 질병 중증도의 조기 계층화를 위한 전신 내독증의 바이오마커로서 사용될 수있다8. 상기 분석실험은 패혈증 쇼크 환자에서 최근 발표된 이중 맹검 무작위 대조 임상 시험에서 폴리믹신 B 혈류융합 요법을 안내하는 데 사용되었다9. 중증 환자에서, MEDIC 연구는 다중 기관 역기능, 중환자실 (ICU) 체류 기간 및 사망률10과연관되는 증가된 EA 수준을 보여주었습니다.

다른 세포는 내독소를 검출하기 위하여 개발되었습니다. 리물루스 아메보세포 리세이트(LAL) 분석실험은 겔 응고, 탁도또는 발색성 검사로서, 지금까지 혈청 내독소의 추정을 위해 가장 빈번하게 채택되어 왔다. 그것은 말굽 게, 리물루스 폴리페무스의헤모 림프의 응고를 유도하는 내독소의 능력에 기초한다. 그러나, 이 분석제는 특이성 면에서 몇 가지 한계가 있다. 특히, 곰팡이 세포벽의 성분과 같은 내독소 이외의 미생물 제품에 의해 활성화될 수도 있으며, 다양한 인간 혈장단백질(11)에의해 억제될 수 있다.

지난 10 년간 EA의 측정은 순환 내독증의 바이오 마커로 개발되고 검증되었습니다. LAL 테스트에 비해 EA는 임상 환경에서 더 빠르고 쉽게 구현할 수 있습니다. 더욱이, 전혈에서 LAL보다 더 정확한 것으로 나타났으며, 시험관 내 및 생체내12둘다 증가된 민감도 및 특이성을 갖는다.

패혈증 원인 에이전트로 GN 박테리아의 신속한 식별을 위한 초기 진단 도구로 그것의 초기 구현에도 불구 하 고, EA 수준 또한 질병 심각도의 바이오 마커로 공부 하고있다. 이러한 맥락에서, 패혈증 쇼크 또는 심정지 후 증후군(13)과 같은 지속적인 중대 질환으로인한 저관백 상태를 평가하는 데 특히 유용한 것으로 나타났다. 최근에는 혈정화 시스템의 개발 이후, 양성 EA 결과가 이러한 치료법(14)에 대한 잠재적 후보를정확하게 식별하기 위한 스크리닝 도구로제안되고 있다. 우리는 최근에 패혈증 쇼크를 가진 107명의 환자에 있는 EA의 초기 높은 수준의 보급 그리고 임상 중요성에 관측적인 회고적인 연구 결과, 실시했습니다. 그밖 최근 결과와 일치하여, 우리는 EA가 패혈증 쇼크15를가진 환자에 있는 질병 엄격의 유망한 마커이다는 것을 것을을 발견했습니다.

본 원고의 목적은 침대 옆이나 실험실에서 EA 분석법을 수행하는 방법을 설명하고 패혈증 쇼크의 대표적인 시나리오에서 잠재적 인 사용을 설명하는 것입니다. 이 기술은 항 내독소 항체 및 LPS의 복합체에 의해 그들의 프라이밍에 따라 호중구에서 향상된 산화 버스트를 측정하여 LPS 활성을 검출할 수 있다. 증가된 호흡 버스트는 화학루미노미터에 의해 검출되고 방출되는 빛의 양은 혈액 샘플에서 내독소의 양에 비례하는 것으로 간주됩니다. 이 분석법은 몇 가지 시약을 필요로 하며, 약 30분이 소요되며 전혈12의40 μL만큼 적게 사용한다.

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프로토콜

이 프로토콜은 인간 생물표본의 취급과 관련된 제도적 지침에 따라 수행되며 임상 실험실의 현재 표준 수술 절차에 따라 수행됩니다. EA 데이터와 테스트 중인 환자의 임상 정보의 사용은 우리 기관의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.

1. 실험실 장비 및 분석 키트 내용

  1. 사용하지 않을 때는 EA 키트를 2-8°C에 보관하십시오.
  2. 각 EA 시험은 5가지 종류의 튜브로 구성됩니다. 테스트의 다른 부분에 대해 각각을 사용합니다(섹션 2 참조).
    1. 튜브 #1("대조군" 튜브)을 사용하여 특정 항체가 없는 상태에서 환자의 호중구의 비특이적 산화 버스트의 기저 활성을 측정한다.
    2. 튜브 #2("샘플" 튜브)를 사용하여 LPS-항체 복합체에 반응하여 산화 버스트를 측정합니다.
    3. 튜브 #3 ("최대"튜브)를 사용하여 환자의 호중구의 최대 산화 파열을 측정하여 과도한 내독소에 반응합니다.
    4. 외인성 내독소의 공급원으로 튜브 #4 ("LPS" 튜브)를 사용하십시오.
    5. 혈액 저장을 위해 튜브 #5("Aliquot" 튜브)를 사용하십시오.
      참고: 시험중인 각 혈액 샘플에 사용되는 총 8 개의 튜브에 대해 #1, #2 및 #3 중복이 제공됩니다 (EA 시약 병 및 품질 관리 테스트는 파우치에 포함 된 모든 테스트에 사용할 수 있습니다).
  3. EDTA 항응고제를 함유한 멸균 튜브에서 환자 혈액 샘플을 수집합니다. EA 검사를 실행하기 전에 실온에서 혈액 샘플을 저장합니다.
  4. 테스트를 시작하기 전에 화학루미노미터와 인큐베이터 셰이커를 켭니다. 인큐베이터를 37°C의 온도로 데운다.
  5. 이상적으로는 혈액 채취로부터 30분 이내에 시료 처리를 시작하십시오.

2. 내독소 활동 분석

  1. 검사해야 하는 각 환자의 혈액 샘플에 대해 EA 시험관을 준비합니다. 튜브랙에 튜브를 넣습니다. 그런 다음 대문자를 제거합니다.
  2. 콤비파이펫을 사용하여 병에서 EA 시약의 1 mL 부피를 튜브 #1(제어 튜브), #2(샘플 튜브) 및 #3(Max tube)로 각각 복제합니다.
    참고: 용액이 다시 튀는 것을 방지하기 위해 튜브 측면 아래로 피펫을 바릅니다.
  3. 혈액 수집 튜브를 20회 부드럽게 반전시켜 환자 혈액 샘플을 혼합합니다. 이어서, 환자 혈액의 0.5 mL의 피펫을 튜브 #4(LPS max tube) 및 튜브 #5(Aliquot 튜브)로 하였다. 소용돌이 튜브는 10 초 동안 #4.
  4. 인큐베이터 셰이커에 모든 EA 테스트 튜브가 있는 튜브 랙을 넣습니다. 뚜껑을 닫고 37°C의 온도에서 10분 동안 배양합니다.
  5. 뚜껑을 열고 인큐베이터 셰이커에서 튜브 랙을 제거합니다. 소용돌이 튜브 #5 (알리쿼트 튜브). 멸균 팁을 사용하여, 피펫 40 μL의 혈액을 튜브에 #1 #2 복제합니다.
  6. 소용돌이 튜브 #4 (LPS 튜브). 동일한 파이펫 팁을 사용하여 튜브 #4 혈액 40 μL을 튜브 #3 (Max tube)로 복제합니다.
  7. 6개의 최종 시험관(#1, #2, #3 및 각각의 복제관을 소용돌이로 만들고 랙에 다시 놓습니다.
    참고: 모든 튜브가 동일한 시간 동안 소용돌이가 있는지 확인합니다.
  8. 튜브 랙을 인큐베이팅 셰이커에 다시 넣고 뚜껑을 닫습니다. 인큐베이팅 셰이커를 100rpm으로 설정한 다음 14분 동안 운동을 시작합니다.
  9. 화학루미노미터에 EA 라벨이 부착된 칩카드를 삽입하고 시작을 누릅니다. 14분 배양 후, 케미루미노미터에 표시된 지침을 따라 EA 튜브를 올바른 순서로 판독한다.
  10. 화학루미노미터의 샘플 홀더에 놓기 전에 각 튜브를 10초 동안 부드럽게 소용돌이치십시오. 샘플 서랍을 열고 샘플 홀더에 튜브 #1 놓습니다. 그런 다음 샘플 서랍을 닫고 상대 라이트 유닛(RLU) 판독을 기다립니다.
  11. 튜브 2 및 튜브 3에 대해 2.10 단계를 반복합니다.
  12. 중복 튜브 1, 2 및 3에 대해 2.10 단계를 반복합니다.
    참고: 2.10-2.12 단계 동안 동일한 시간 동안 모든 튜브를 소용돌이로 이동하십시오.
  13. 모든 튜브가 처리된 후에는 EA 결과가 자동으로 계산되고 인쇄됩니다. 레벨은 EA 단위로 표현되며 동일한 샘플에서 중복 결정의 평균을 나타냅니다.
  14. 검사를 받아야 하는 모든 혈액 샘플에 대해 2.2~2.13단계를 반복합니다.
  15. 분석이 완료되면, 나머지 시험관 및 EA 시약을 최대 30일 동안 2-8°C에 보관합니다.

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결과

72 세의 남자는 학술 도시 병원의 응급 실 (ED)에 입원했다. 며칠 전에 그는 배뇨에 불타는 불평 그의 1 차 배려 의사에게 제출했다. 경구 인광마이신을 가진 단기 과정 치료가 추천되었습니다. 그의 병력은 고혈압, 복잡하지 않은 타입-2 당뇨병 및 양성 전립선 비대증을 포함했습니다. 그의 약물에는 에날라프, 아토르바스타틴, 탐술로신 및 메트포르민이 포함되었습니다.

에드에서, 그는 무기력했다, 깨어났을 때 혼란. 그의 온도는 39.1 °C, 심박수는 분당 125 비트, 혈압은 80/40 mmHg, 호흡률은 20/min, SpO 2는 실내 공기에서 94%였으며, 비강 캐뉼라를 통해 4 L/min 산소로 99%로 상승하였다. 복부 검사는 부정확하게 현지화 된 온화한 초약함을 제외하고는 정상이었습니다. 어려움으로 폴리 카테터를 배치했습니다. 어두운...

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토론

패혈증 쇼크는 고려된 보고16에따라 이 비율이 변화하더라도, 40%만큼 높은 사망률과 아직도 연관됩니다. 신규하고 더 나은 바이오 마커에 대한 필요성은 패혈증 쇼크 환자의 조기 진단, 더 나은 관리 및 예후에서 임상의를 돕기 위해 분야의 대부분의 전문가에 의해 옹호됩니다6.

EA 테스트를 수행하려면 이전의 기술 지식이나 정교한 실험실 장비가 필요하지 않으며, 모든 의료 제공자는 이를 실행하는 방법을 쉽고 빠르게 배울 수 있습니다. 높은 순환 EA의 신속한 식별은 환자의 위험을 계층화하는 데 도움이 될 수 있습니다, 이전의 더 공격적인 치료 접근 방식을 트리거. 반대로, 0.40 EA 단위 미만의 EA 결과는 다기관 부전17로의진행 위험이 낮음을 나타낼 수 있습니다. 그들의 자신의 통제로 환자의 견본의 사용은 간단합니다, 이 시험은 내독증의 실제 혈중 농...

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공개 사항

Estor SpA는 저널의 출판 및 비디오 제작 비용을 다루었습니다. 저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

감사의 글

분석 프로토콜 방법론을 검토해 주신 파올로 브라가노 박사와 리사 마티아센 박사에게 감사드립니다. 다리오 윈터턴( Dario Winterton, MD)은 영어 능력에 대한 원고를 검토하는 데 상당한 도움을 주였습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
EAA 키트Spectral Medical Inc.EAAST-20패키지, 테스트 20회 + 품질 관리 1
Smart Line TLBertholdEAASL광도계
인큐베이터 쉐이커, GRANTES-20미니 인큐베이터 쉐이커
, VortexerVWR444-2790Vortex 기기
회, ,

참고문헌

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