생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구
1Hematology service, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty,University of Geneva, 2Department of Pathology and Immunology, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty,University of Geneva, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty,University of Geneva
Summary
여기, 우리가 특정 표면 마커 및 공초점 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 흐름 체 외에서 매매 하는 monocyte 부분 모집단을 측정 하는 통합된 프로토콜 제시. 이 프로토콜은 다른 특정 표면 마커를 사용 하 여 다른 백혈구 하위 프로로 뿐만 아니라 순차 모집 단계를 탐험 하 사용할 수 있습니다.
Abstract
타겟된 주변 조직에 혈액에서 monocytes의 모집 조직 부상, 종양 개발 및 자가 면역 질환 염증 과정에 중대 하다. 이것은 그들의 접착 및 transendothelial 마이그레이션 (환생) 뒤에 기본 영향을 받는 조직으로 활성화 된 내 피 세포의 표면에 luminal 무료 흐름에서 캡처의 과정을 통해 촉진 된다. 그러나, monocyte 모집단의 특혜와 맞는 채용을 지 원하는 메커니즘은 아직 완전히 이해. 따라서, 다른 monocyte 모집단 동시에 시각화 하 고 흐름에서 측정의 채용을 허용 하는 방법을 개발 했습니다. 시간 경과 confocal 영상에 따라이 메서드는 부착 및 transmigrated monocytes 사이 명확한 구별에 대 한 수 있습니다. 여기, 우리는이 메서드를 사용 하 수 있습니다 프로 신생 및 비 신생 monocytes 체 외의 모집 캐스케이드를 동시에 공부 하는 방법을 설명 합니다. 또한,이 메서드는 최대 3 개의 monocyte 인구의 신규 모집의 다른 단계를 공부 하 확장할 수 있습니다.
Introduction
Monocytes의 병원 체, 손상 된 조직, 신생, 고 암1,2,3 포함 하 여 많은 질병의 병 태 생리학 정리 싸움을 위해 필수적 이다 타고 난 면역 phagocytic 구성 요소 구성 . Monocytes는 골 수 유래 세포 혈액에 순환 하지만 특정 분자 메커니즘을 통해 주변 조직에 염증의 사이트에 채용 될 수 있는 다른 유형의 모집단의 구성 이다. Monocytes, 백혈구에 관해서는 모집 캐스케이드 일반적으로 다른 단계 캡처, 압 연, 크롤링, 체포, transendothelial 마이그레이션 (환생) 및 혈관 벽 (지하실 멤브레인와 벽화를 통해 마이그레이션 등 연루 셀)4. 다음이 단계는 주로 ligands selectin 같은 백혈구에 풀, 당단백질 ligands, 발산, 세포 및 접합 접착 분자, 그리고 그들의 수용 체와 같은 내 피 luminal 표면에 염증 유발 분자를 포함 그리고 integrins입니다. 밀매 경로 중 하나는 내 피 세포 접합 (paracellular) 나 내 피 세포 체 (transcellular)를 통해 백혈구에 의해 내 피 장벽5를 사용할 수 있습니다. Monocytes transcellular 경로 통해 transmigrate를 역사적으로 문서화 되어, 하는 동안 그들의 철새 통로의 잠재적인 차이점 monocytes 균질 세포 인구 이라고 여겨진다 이상으로 제안 되었습니다. 그것은 이제 분명 monocyte 다양성 각 그들의 차이 공통점에 의해 정의 될 수 있습니다, 그들의 독특한 넘쳐 흐름에 관하여3,6폭포 되고있다. 따라서, monocyte 모집단 사이 차별 명확 하 게 하기 위해 시각화 하는 중요 한 고 형 채용 중이 다른 모집단의 각 동작을 처리.
인간 monocytes, 돼지, 쥐, 마우스 특정 관찰 기능 및 특정 철새 동작7,,89phenotypic 모집단으로 세분화 했다. 예를 들어 인간 monocytes는 CD16, Fc 감마 수용 체 III CD14, 세균성 lipopolysaccharide에 대 한 coreceptor의 그들의 표면 식에 따라 3 개의 하위 집합으로 나눌 수 있습니다. 인간 monocyte 모집단 클래식 CD14 포함+CD16–, CD14 중간+CD16+ 및 비 고전 CD14어둡게CD16+ 세포6,9. 클래식 CD14+CD16– monocytes는 주로 염증 성 표시 했다 반면 CD16 수영장+ monocytes 총칭 TIE2 표현과 proangiogenic 함수10선물을 발견 했다. 일관 되 게, 인간의 종양 괴 사 등 염증 성 cytokines와 내 피 성장 세포 자극 인자 (TNF) α 또는 인터 루 킨 (일리노이-1) 베타 (기존의 염증)은 고전 CD14의 완전 한 신규 모집을 실행 하는 충분 한+CD16 – monocytes입니다. 그러나, 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)와 TNFα (신생 요소 기반 염증)의 동시 작업은는 CD16의 환생을 자극 하는 데 필요한+ monocytes3의 proangiogenic 풀. 역사적으로, 정적 조건, 병렬 플레이트 흐름 챔버 및 µ-슬라이드 흐름 챔버 전통적인 Transwell 시스템 양적 분석 한 시간에서 시험관에11에 한 백혈구 인구의 모집 하는 데 사용 되었습니다. ,,1213. 이러한 프로토콜을 검증 하는 동안 여러 monocyte 모집단의 동시 분석을 허용 하는 더 강력한 방법 여겨질 것입니다 더 많은 통찰력. 이러한 방법론 여러 상호 작용 및 각 각각의 서로 다른 주파수를 담당 하 고 또한 각 monocyte 정의 하는 모집 계곡에 대 한 유사성과 특이성의 기계적 이해를 제공 해야 합니다. 하위 집합입니다.
여기, 우리 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 동시에 공부 될 다른 monocyte 모집단의 철새 계곡 수 있는 흐름 아래 monocyte 모집의 시간 경과 영상에 따라 방법 제시. 이 방법은 hemodynamics 순환 후 모 세관 venules에 monocytes의 vivo에서 백혈구 신규 모집의 주요 위치 뿐 아니라 내 피 세포 염증, 모방 하는 특정 중요 한 기능을 통합 합니다. 제안 된 방법은 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC), 인간의 탯에서 고립의 잘 설립 된 프로토콜을 통해 생성 되는 사용 합니다. 이 임상 자원 또한 탯 줄 정 맥 으로부터 격리 될 수 있는 내 피 세포의 적당 한 수익률을 제공 하는 반면 생물 학적 부산물로 쉽게 사용할 수 있는 이점이 있다. 우리는 또한 사용 형광 염료와 면역 형광 monocyte 위치 (abluminal 대 luminal) 명확 하 게 정의에 confocal 현미경 검사 법 및 다른 세포질 구성 요소 구분을 시간이 지남에. 여기에 제시 된 프로토콜을 동시에 측정 monocyte 모집단의 환생 레벨 개발 되었습니다. 또한, 그것은 다른 biomarkers 및 라벨의 사용 하 여이 방법론 공부 다른 백혈구 모집단 및 채용 프로세스를 확장할 수 있습니다 주목 해야한다.
Protocol
인간의 재료 자원 봉사 기증자의 및 임상 연구에 스위스 윤리 위원회에 통지 해준 동의 함께 사용 되었다. 1. 격리와 인간의 탯 줄의 정 맥 내 피 세포 (HUVEC) HUVEC 절연을 시작 하기 전에 코팅 솔루션의 5 mL는 T75 플라스 크 (0.1 mg/mL 콜라겐 G 및 인산 버퍼 pH 7.4에서 염 분 PBS에 0.2% 젤라틴) 37 ° C에서 30 분을 추가 합니다. PBS 가진 코드를 청소, 살 균 압축으로 닦 고 살 균 20 cm 배양 접시에. 살 균가 위 코드의 끝을 잘라. 하나의 큰 정 맥과 두 개의 작은 동맥을 식별 합니다. 부드럽게 코드 끝에 정 맥 사지에 그것에 연결 된 3 방향 자 지와 함께 한 캐 뉼 러를 삽입 합니다. 코드 및 정 맥 연결 와이어의 길이와 단단히 조입니다. 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스 250 ng/mL 코드의 혈관을 씻어 암포 B 포함 된 RPMI 매체의 20 mL로 두 번 코드 perfuse 이 프로세스 하얀 하 고 명확 하 게 코드의 모양을 만든다. 한쪽 끝에 주사기는 RPMI 수집 하 여 콜라 추가 하기 전에 정 맥을 비어 있습니다. 1 mg/mL 콜라 형식의 12 mL와 함께 정 맥 perfuse 나 (0.22 μ m 필터). 닫기 코드에서 자 지 그리고 12 분 동안 37 ° C에서 코드를 품 어. 부드럽게 마사지 정 맥 루멘에서 내 피 세포를 분리 하려면 코드. 받아 30 mL 50 mL 주사기 10% 태아 종 아리 혈 청에 포함 된 RPMI의 고 탯의 한쪽 끝을 연결 합니다. 탯의 다른 쪽 끝에는 빈 50 mL 주사기를 연결 자 지를 열고 상호로 다른 쪽 끝에서 수집 하는 동안 한쪽에서 정 맥을 perfuse.참고: 수집 된 서 스 펜 션 내 피 세포를 포함 되어 있습니다. 5 분 동안 200 x g 에 세포 현 탁 액이 원심 삭제는 상쾌한 고 완전 한 M199 매체 (M199 포함 20 S, 15 µ g/mL 내 피 세포 성장 보조 제, 100 µ g/mL 헤 파 린 나트륨, 0.5 µ M 날린, 10 µ g/m l L-아 스 코르 빈 산, 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend 스 고 250 ng/mL 암포 B). T75 플라스 크에서 코팅 솔루션을 제거 하 고 PBS로 한 번 씻어. 씨 셀 T75 플라스 크에 1.13 단계에서 수집 하 고 5% CO2와 37 ° C에서 인큐베이터에 배치. 다음 날, 린스 3 번 잔여 적혈구를 제거 하 여 다음 변경할 매체 합류까지 2 일 마다 완전 한 M199 매체와 플라스 크. 80-90% 합류 HUVEC 단층 PBS의 5 mL로 한 번 헹 구 고 M199의 5 분 추가 4 mL과 트립 신 작업을 중지 하는 FCS의 1 mL에 대 한 37 ° C에서 1 mM EDTA에에서 0.05 %trypsin 5 mL로 세포를 분리. 모든 HUVEC를 분리 하려면 플라스 크를 플러시. VE cadherin, PECAM-1 및 gp38, 얼룩에 사용할 cytometry HUVEC 순도 확인 하 여 분석을 50 µ L의 약 수를 수집 합니다. 실 온에서 5 분 동안 200 x g에서 15 mL 튜브와 원심 분리기에서 1.18 단계에서 HUVEC의 나머지를 수집 합니다. 단계 1.19에서에서 상쾌한 삭제 하 고, resuspend cryotubes에서 5 x 105 셀/mL의 조밀도에 솔루션 (10 %DMSO 포함 하는 FCS)에 셀 펠 릿 사용까지-80 ° C에 또는 액체 질소에서를 고정. HUVEC 순수성을 확인: HUVEC 1.18 단계에서 수집 된의 50 µ L의 약 수를 반대로 인간 VE cadherin FITC 항 체의 1 µ L, 1 µ L의 반대로 인간 PECAM1 PE 항 체, 및 반대로 인간 Podoplanin APC 항 체의 1 µ L를 추가 합니다. 10 분 동안 실내 온도에 품 어. 400 x g 30에서 100 µ L의 PBS와 원심 분리기를 추가 s. 삭제는 상쾌한 고 PBS의 100 µ L에서 resuspend. 데이터 흐름 cytometry 기술로 이제 인수 수 있습니다.참고: HUVEC VE cadherin 및 PECAM-1에 대 한 긍정적이 고 부정적인 Podoplanin에 대 한 있습니다. 2. HUVEC 녹 이기 참고: 낮은 통로에 HUVEC를 사용 하 여 실험 (최대 5 구절). 30 분 동안 37 ° C에서 코팅 솔루션의 1 mL와 T75 플라스 크 코트. 급속 하 게 2 분 동안 37 ° C에서 HUVEC defreeze 하 고 완전 한 M199 10 mL에 셀 resuspend. 5 분 동안 실 온에서 200 x g 에서 세포를 원심 및 삭제는 상쾌한. 완전 한 M199 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 미리 코팅된 플라스 크에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 5% CO2와 37 ° C에서 인큐베이터에 플라스 크를 배치 합니다. 세포 배양 매체 매 2 일 변경. 3. HUVEC 문화 0.4 µ 슬라이드 챔버에 흐름 실험을 시작 하기 전에 5 일 미리 0.1 mg/mL 콜라겐 G, 30 분 동안 37 ° C에 0.2% 젤라틴을 포함 하는 PBS의 30 µ L로 0.4 µ-슬라이드의 실 코트. 100 µ L의 PBS와 챔버 세척. T75 플라스 크의 80-90% confluent HUVEC에서 세포를 분리 합니다. PBS의 5 mL와 함께 HUVEC를 헹 구 고 5 분 동안 37 ° C에서 0.05 %trypsin 5 mL와 함께 그들을 분리. 플러시 및 완전 한 M199에 세포 현 탁 액을 수집 하 고 가장 편리한 방법으로는 셀의 개수. 실 온에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심. 106 셀/mL에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 챔버 당 30 µ L (30000 셀) 배포. 1 시간에 5% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 셀을 품 어. 각 약 실에 완전 한 M199의 150 µ L을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 5 일 동안 셀 문화. 매체 매 2 일 변경. 4. HUVEC 흐름 아래 Monocyte 모집 분석 결과 대 한 얼룩 M199 및 CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)의 1 개의 µ M 라벨 매체를 준비 하 고 셀 라벨 전에 5 분 동안 37 ° C에서 그것을 따뜻하게. 37 ° c.에 M199 매체와 두 번 씻어 HUVEC 따뜻하게 따뜻하게 라벨 매체를 포함 하는 CMFDA의 1 개의 µ M의 30 µ L 매체를 바꿉니다 고 10 분 동안 37 ° C, 5% CO2 배양 기 합니다. 완전 한 M199로 한번 세척 하 고 30 분 동안 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 완전 한 M199 셀을 품 어.참고: 라벨 솔루션을 추가 하기 전에 혈 청의 모든 흔적을 제거 하는 것이 중요 하다, 그렇지 않으면 그것은 HUVEC 얼룩을 변경할 수 있습니다. 대체 어느 인간의 TNFα를 포함 완전 한 M199와 매체 (500 U/mL) 또는 인간 TNFα의 혼합 (500 U/mL) 인간의 VEGFA와 (1 µ g/mL) 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 6 h에 대 한. 5. 인간의 팬 Monocytes 그리고 모집단의 얼룩의 격리 사용 하 여 집중 인간의 피 버 피 코트 또는 EDTA vacutainer 튜브에 실험 당일 수집 갓 고립 된 인간의 혈액의 20 mL. PBS-1 mM EDTA (1:1)에 혈액을 희석 하 고 부드럽게 밀도 그라데이션 미디어의 20 mL 위에 희석된 혈액의 20 mL를 플라스틱. 천천히 가속 및 브레이크 없이 실 온에서 30 분 400 x g 에서 원심. 주변 혈액 단 세포 (PBMC) 수집-PBS-1 mM EDTA의 40 mL를 포함 하는 새로운 50 mL 튜브에 혈소판 레이어 (밀도 그라데이션 미디어 플라즈마 레이어 사이). 최대 50 mL PBS-1 mM EDTA와 함께 톱. 5 분에 대 한 실 온에서 200 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다. 얼룩 버퍼 (PBS-1 mM EDTA 0.5% 소 혈 청 알 부 민 BSA를 포함)의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend 5 분에 대 한 실 온에서 200 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한을 삭제 합니다. 5.5-5.6 단계 반복 합니다. 버퍼를 얼룩이 지기의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend 셀 개수에 대 한 10 µ L의 약 수를 가져가 라. PBMC 인구를 확인 하 고 빠르게 교류 cytometer와 셀.참고: 특성 림프 구 및 monocyte 인구 (그림 1A) 관찰 될 수 있다. 에 대해 기대 하는 신선한 인간의 혈액 50 mL에서 50-100 x 106 PBMC. CD14 + 대 CD14-PBMC 흐름에서의 채용에 대 한: 세 번 흐름 버퍼와 펠 릿을 세척 (M199 0.5 %BSA 포함)와 resuspend mL 당 6 x 106 세포에 흐름 버퍼에서 단 세포. 각 분석 결과 대 한 200 µ L의 aliquots를 확인 합니다. 분석 결과 전에 20 분까지 37 ° C에서 품 어. 각 약 수를 안티-CD14-PE와 2 µ M의 최종 농도에 Hoechst 33342 5 µ L를 추가 합니다. 혼합 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 품 어. 30에 대 한 400 x g 에서 약 수를 원심 s. 삭제는 상쾌한 고 흐름 버퍼의 200 µ L와 펠 릿을 resuspend. 흐름에서 monocyte 모집단의 채용에 대 한: 제조업체 지침에 따라 팬 monocyte 격리 키트 monocytes를 격리 합니다.참고: 다음 격리 프로토콜 50 x 106 세포입니다. 그것은 확장할 수 있습니다 위 또는 아래로 그것은 제조 업체의 권장 사항을 내로. 5 분 동안 실 온에서 200 x g 에서 PBMC 정지 원심 상쾌한 무시 하 고 버퍼를 얼룩이 지기의 400 µ L와 펠 릿 resuspend. Fc 수용 체 차단 약의 50 µ L 팬 Monocyte 항 체 칵테일의 50 µ L를 추가 합니다. 10 분 동안 실내 온도에 품 어. 버퍼 및 자석 구슬 활용된 반 비오 항 체의 100 µ L를 얼룩이 지기의 400 µ L를 추가 합니다. 15 분 동안 실 온에서 품 어. 얼룩 버퍼의 2 개 mL를 추가 하 고 자석으로 결합 맥 LS 열을 사용 하 여. 자석에 LS 열을 놓고 버퍼를 얼룩이 지기의 1 mL를 추가 합니다. 흐름을 통해 삭제 합니다. 열에서 PBMC 정지를 통과 하 고 새로운 15 mL 튜브에서 팬 monocytes를 포함 하지만 분명 흐름을 수집. 5 mL까지 가기로 얼룩 버퍼를 추가 합니다. 약 수를가지고 고 교류 cytometer는 monocyte 격리의 품질을 확인 하십시오. 팬 monocyte 개수를 결정 합니다.참고: 만 monocyte 인구 (그림 1B)관찰 될 수 있다. 5 분 동안 200 x g 에서 5.11.11 단계에서 monocytes의 나머지 원심 폐기는 상쾌한. 흐름 버퍼의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend (M199 0.5 %BSA 포함). 5.11.13에 5.11.14 EDTA의 흔적을 제거 하는 두 번 반복 합니다. 흐름에 monocyte 정지를 만들기 6 x 106 셀/mL에 (0.5 %BSA M199) 버퍼. 각 모집 분석 결과 대 한 monocytes의 200 µ L의 aliquots를 확인 합니다. 주입 하기 전에 20 분까지 인큐베이터에서 37 ° C에는 약 수를 유지. 각 약 수를 안티-CD16-PE 항 체와 Hoechst 33342 (최종 2 µ M)의 5 µ L를 추가 합니다. 혼합 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 품 어. 30에 대 한 400 x g 에서 약 수를 원심 s. 삭제는 상쾌한 고 흐름 버퍼의 250 µ L와 펠 릿을 resuspend. Confocal 현미경에 인수 매개 변수 설정에 대 한 봉사를 슬라이드의 한 챔버에 monocyte 정지 30 µ L를 추가 합니다. 37 ° c.에 단계 5.18에서에서 monocyte 서 스 펜 션의 aliquots를 유지참고: 이 현 탁이 액 흐름 시스템에 주입 될 준비가 되어 있습니다. 6입니다. 유체 시스템의 준비 37 ° c.에 설정 하는 영상에 대 한 셀 인큐베이터 확인참고: 흐름 시스템의 다이어그램은 그림 2에 표시 됩니다. 1 배관 부 조립 실리콘 튜브 (8 cm 길고 3 밀리미터 두꺼운)의 한쪽 끝에 Luer 커넥터 남성 삽입 하 고 다른 쪽 끝에 선 루어 주입 세트에 연결. 커넥터 연결 합니다 후자 Luer 실리콘 튜브 (40 cm 및 3 밀리미터 두꺼운)의 한쪽 끝에.참고: 선택적으로, 3-방향 탭 5 mL 주사기에 연결 된 인라인 Luer 주입 세트와 실리콘 최종 공기 거품 제거를 위한 튜브 사이의 삽입할 수 있습니다. 배관 부 II의 조립: 실리콘 튜브 (1 m 및 두께 3 m m)의 길이의 한쪽 끝에 20 mL 주사기를 연결. 삽입 튜브의 다른 쪽 끝에 Luer 커넥터 남성. 연결 부 I와 II 튜브 Luer 커넥터 남성 여성 Luer 잠금 커플러 (그림 2A)을 삽입 하 여 부. 포함 하는 37 ° c.에 예 열 흐름 버퍼 (M199 + 0.5 %BSA) 저수지에서 끝낼 실리콘 튜브의 무료 흐름 버퍼 튜브를 채우기 위해 20 mL 주사기의 플런저를 당겨. 펌프에 주사기를 놓고 그것을 확보 합니다. 펌프를 설정에서 철회 모드 (에 반대)으로 하 고 유량을 지정. 다음 수식을 사용 하 여 사용 하는 IBIDI 슬라이드에 따르면 흐름 율을 결정 합니다.참고: 슬라이드 요소는 실험에 사용 되는 IBIDI 슬라이드에 의존 합니다. Μ-슬라이드 나0.4 Luer 잠금이이 예제에서는 슬라이드 요소에에서 사용 되는 131.6. 특정 슬라이드 요소에 대 한 회사 웹사이트14를 참조 하십시오. 흐름 버퍼 점도 0.0072 dyn.s/cm2. 후 모 세관 venules에 전단 응력은 0.5 dyn/cm2에 대해. 슬라이드 (그림 2B) 연결: 여성 Luer 잠금 커플러 주위 실리콘 튜브 클램프 및 커플러에서 두 Luer 커넥터 남성을 분리 합니다. 자극의 HUVEC 및 매체와 채우기 포함 된 슬라이드의 저수지에 그들을 연결 합니다. 이 단계 동안 공기 방울을 피하십시오. 클램프 해제 하 고 연결 유출 되지 않습니다 확인 하십시오. 시간 경과 영상에 대 한 현미경 슬라이드 놓고 펌프를 시작 합니다. 7. Confocal 현미경 검사 법에 의해 흐름 아래 Monocyte 모집 시간 경과 영상 40 x 목표를 사용 하 여 참조 테이블의 자료영상에 대 한. 활성화는 405 nm (블루 monocyte 핵), 488 nm (녹색 내 피 세포) 및 561 nm (빨간 CD16 + 하위 집합) 레이저. 인수 매개 변수를 설정 하는 monocytes를 포함 하는 챔버를 사용 합니다.참고: 비 transmigrated와 transmigrated monocytes, 감지 하 고 핀 홀 레이저 405 nm의 강도 높은 설정 됩니다. 따라서, 비 transmigrated monocytes 기저 계획에 약간 볼 수 있습니다. 그러나 단지 transmigrated monocytes는 흠 없는 주변 핵 내 피 세포 아래 점유 하는 새로운 공간에 해당 제시. 현미경 획득 챔버를 놓습니다. 다중 위치 confocal 영상에 대 한 1 cm 반지름 안에서 뷰의 3 필드를 선택 합니다. 정의 기저와 내 피 세포의 꼭대기 측면 10-12 µ m 범위 (0.5 µ m 단계) z-스택을 설정 합니다. 모든 1 분 시간 경과 수집을 실행 합니다. 영상의 3 분 후에 선 루어 주입 포트를 통해 monocyte 정지 (6 x 106 셀/mL)의 200 µ L를 주사.참고: Monocytes 꼭대기 초점면에 표시 하는 급속 하 게 준수 하 고 환생 (기저 계획에는 꼭대기에서 환승)을 시작 합니다. 적어도 30 분에 대 한 이미지입니다. 완료 되 면, 이미지를 중지 하 고 중단. 슬라이드에서 그들을 분리 튜브 클램프. 10 분 동안 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde 슬라이드를 수정 합니다. PBS와 슬라이드를 세척 하 고 필요한 경우 추가 분석을 위해 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다. 8. ImageJ와 데이터 분석 각 분야에 총 부착 monocytes의 수를 계산 합니다. M m2당 셀 수를 결정 합니다. 내 피 세포 아래 기초 계획에 존재 하 고 핵 주위 (녹색 채널)에서 블랙홀의 존재에 의해 확인 된 transmigrated monocytes를 계산 합니다. 부착 백혈구의 총 수로 transmigrated 백혈구의 수를 나눕니다. 환생 속도 부착 monocytes의 비율으로 제공 됩니다. 이해를 돕기 위해는 꼭대기와 기저 면 수 표시 동시에 내 피이 구획의 각각에서 발생 하는 이벤트를 설명 하기 위해.
Representative Results
HUVEC 활성화 TNFα에 의해 유도 된의 상태 확인 염증 성 cytokine TNFα의 생물 활동 일괄 처리 및 냉동 녹고 사이클의 반복에 따라 달라질 수 있습니다. 그것은 TNFα 치료와 HUVEC의 활성화 상태를 확인 하는 것이 중요입니다. 이 풀, ICAM-1 및 VCAM-115,16,17의 염증 유도 con…
Discussion
여기, 우리가 어떻게 monocyte 모집단 염증이 내 피 단층을 통해 transmigrate의 연구를 자세히 설명 하는 방법 보고. 토론된 방법 단계 대조 현미경 검사 법, 또한 흐름3,,1119monocyte 모집을 공부 하는 데 사용 되는 대신 confocal 현미경 검사 법을 사용 합니다. 시간 경과 영상에 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여의 주요 장점 중 하나는 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 감사 박사 폴 Bradfield 원고 읽기 및 피드백. A. S.는 선생님 쥘 가시 자선 해외 신뢰 등록에서 재정 지원을 받은
Materials
| Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
| µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
| Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
| Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
| Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
| penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml | AMIMED | 4-02F00-H | |
| Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
| Medium 199 1X avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
| Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg | Millipore | 02-102 | |
| Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
| EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
| CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
| CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
| Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
| BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
| µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
| CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
| Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
| Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
| NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
| Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
| Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
| Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
| Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
| Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
| Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
| In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
| Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
| 40X objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
| ImageJ Software | NIH |
References
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Cite This Article
Ropraz, P., Imhof, B. A., Matthes, T., Wehrle-Haller, B., Sidibé, A. Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58509, doi:10.3791/58509 (2018).