생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

Monocytes의 병원 체, 손상 된 조직, 신생, 고 암^{1,2,3 포함 하 여 많은 질병의 병 태 생리학 정리 싸움을 위해 필수적 이다 타고 난 면역 phagocytic 구성 요소 구성} . Monocytes는 골 수 유래 세포 혈액에 순환 하지만 특정 분자 메커니즘을 통해 주변 조직에 염증의 사이트에 채용 될 수 있는 다른 유형의 모집단의 구성 이다. Monocytes, 백혈구에 관해서는 모집 캐스케이드 일반적으로 다른 단계 캡처, 압 연, 크롤링, 체포, transendothelial 마이그레이션 (환생) 및 혈관 벽 (지하실 멤브레인와 벽화를 통해 마이그레이션 등 연루 셀)⁴. 다음이 단계는 주로 ligands selectin 같은 백혈구에 풀, 당단백질 ligands, 발산, 세포 및 접합 접착 분자, 그리고 그들의 수용 체와 같은 내 피 luminal 표면에 염증 유발 분자를 포함 그리고 integrins입니다. 밀매 경로 중 하나는 내 피 세포 접합 (paracellular) 나 내 피 세포 체 (transcellular)를 통해 백혈구에 의해 내 피 장벽⁵를 사용할 수 있습니다. Monocytes transcellular 경로 통해 transmigrate를 역사적으로 문서화 되어, 하는 동안 그들의 철새 통로의 잠재적인 차이점 monocytes 균질 세포 인구 이라고 여겨진다 이상으로 제안 되었습니다. 그것은 이제 분명 monocyte 다양성 각 그들의 차이 공통점에 의해 정의 될 수 있습니다, 그들의 독특한 넘쳐 흐름에 관하여^3,6폭포 되고있다. 따라서, monocyte 모집단 사이 차별 명확 하 게 하기 위해 시각화 하는 중요 한 고 형 채용 중이 다른 모집단의 각 동작을 처리.

인간 monocytes, 돼지, 쥐, 마우스 특정 관찰 기능 및 특정 철새 동작^7,,89phenotypic 모집단으로 세분화 했다. 예를 들어 인간 monocytes는 CD16, Fc 감마 수용 체 III CD14, 세균성 lipopolysaccharide에 대 한 coreceptor의 그들의 표면 식에 따라 3 개의 하위 집합으로 나눌 수 있습니다. 인간 monocyte 모집단 클래식 CD14 포함⁺CD16^-, CD14 중간⁺CD16⁺ 및 비 고전 CD14^어둡게CD16⁺ 세포^6,9. 클래식 CD14⁺CD16^- monocytes는 주로 염증 성 표시 했다 반면 CD16 수영장⁺ monocytes 총칭 TIE2 표현과 proangiogenic 함수¹⁰선물을 발견 했다. 일관 되 게, 인간의 종양 괴 사 등 염증 성 cytokines와 내 피 성장 세포 자극 인자 (TNF) α 또는 인터 루 킨 (일리노이-1) 베타 (기존의 염증)은 고전 CD14의 완전 한 신규 모집을 실행 하는 충분 한⁺CD16 ^- monocytes입니다. 그러나, 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)와 TNFα (신생 요소 기반 염증)의 동시 작업은는 CD16의 환생을 자극 하는 데 필요한⁺ monocytes³의 proangiogenic 풀. 역사적으로, 정적 조건, 병렬 플레이트 흐름 챔버 및 µ-슬라이드 흐름 챔버 전통적인 Transwell 시스템 양적 분석 한 시간에서 시험관에^{11에 한 백혈구 인구의 모집 하는 데 사용 되었습니다. ,,1213}. 이러한 프로토콜을 검증 하는 동안 여러 monocyte 모집단의 동시 분석을 허용 하는 더 강력한 방법 여겨질 것입니다 더 많은 통찰력. 이러한 방법론 여러 상호 작용 및 각 각각의 서로 다른 주파수를 담당 하 고 또한 각 monocyte 정의 하는 모집 계곡에 대 한 유사성과 특이성의 기계적 이해를 제공 해야 합니다. 하위 집합입니다.

여기, 우리 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 동시에 공부 될 다른 monocyte 모집단의 철새 계곡 수 있는 흐름 아래 monocyte 모집의 시간 경과 영상에 따라 방법 제시. 이 방법은 hemodynamics 순환 후 모 세관 venules에 monocytes의 vivo에서 백혈구 신규 모집의 주요 위치 뿐 아니라 내 피 세포 염증, 모방 하는 특정 중요 한 기능을 통합 합니다. 제안 된 방법은 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC), 인간의 탯에서 고립의 잘 설립 된 프로토콜을 통해 생성 되는 사용 합니다. 이 임상 자원 또한 탯 줄 정 맥 으로부터 격리 될 수 있는 내 피 세포의 적당 한 수익률을 제공 하는 반면 생물 학적 부산물로 쉽게 사용할 수 있는 이점이 있다. 우리는 또한 사용 형광 염료와 면역 형광 monocyte 위치 (abluminal 대 luminal) 명확 하 게 정의에 confocal 현미경 검사 법 및 다른 세포질 구성 요소 구분을 시간이 지남에. 여기에 제시 된 프로토콜을 동시에 측정 monocyte 모집단의 환생 레벨 개발 되었습니다. 또한, 그것은 다른 biomarkers 및 라벨의 사용 하 여이 방법론 공부 다른 백혈구 모집단 및 채용 프로세스를 확장할 수 있습니다 주목 해야한다.

인간의 재료 자원 봉사 기증자의 및 임상 연구에 스위스 윤리 위원회에 통지 해준 동의 함께 사용 되었다.

1. 격리와 인간의 탯 줄의 정 맥 내 피 세포 (HUVEC)

1. HUVEC 절연을 시작 하기 전에 코팅 솔루션의 5 mL는 T75 플라스 크 (0.1 mg/mL 콜라겐 G 및 인산 버퍼 pH 7.4에서 염 분 PBS에 0.2% 젤라틴) 37 ° C에서 30 분을 추가 합니다.
2. PBS 가진 코드를 청소, 살 균 압축으로 닦 고 살 균 20 cm 배양 접시에. 살 균가 위 코드의 끝을 잘라.
3. 하나의 큰 정 맥과 두 개의 작은 동맥을 식별 합니다. 부드럽게 코드 끝에 정 맥 사지에 그것에 연결 된 3 방향 자 지와 함께 한 캐 뉼 러를 삽입 합니다.
4. 코드 및 정 맥 연결 와이어의 길이와 단단히 조입니다.
5. 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스 250 ng/mL 코드의 혈관을 씻어 암포 B 포함 된 RPMI 매체의 20 mL로 두 번 코드 perfuse 이 프로세스 하얀 하 고 명확 하 게 코드의 모양을 만든다. 한쪽 끝에 주사기는 RPMI 수집 하 여 콜라 추가 하기 전에 정 맥을 비어 있습니다.
6. 1 mg/mL 콜라 형식의 12 mL와 함께 정 맥 perfuse 나 (0.22 μ m 필터).
7. 닫기 코드에서 자 지 그리고 12 분 동안 37 ° C에서 코드를 품 어.
8. 부드럽게 마사지 정 맥 루멘에서 내 피 세포를 분리 하려면 코드.
9. 받아 30 mL 50 mL 주사기 10% 태아 종 아리 혈 청에 포함 된 RPMI의 고 탯의 한쪽 끝을 연결 합니다.
10. 탯의 다른 쪽 끝에는 빈 50 mL 주사기를 연결
11. 자 지를 열고 상호로 다른 쪽 끝에서 수집 하는 동안 한쪽에서 정 맥을 perfuse.
    참고: 수집 된 서 스 펜 션 내 피 세포를 포함 되어 있습니다.
12. 5 분 동안 200 x g 에 세포 현 탁 액이 원심
21. 4. 
       

HUVEC 활성화 TNFα에 의해 유도 된의 상태 확인

염증 성 cytokine TNFα의 생물 활동 일괄 처리 및 냉동 녹고 사이클의 반복에 따라 달라질 수 있습니다. 그것은 TNFα 치료와 HUVEC의 활성화 상태를 확인 하는 것이 중요입니다. 이 풀, ICAM-1 및 VCAM-115,16,17의 염증 유도 confluent HUVEC의 일부 샘플 병렬로 얼룩 수행 수 있습니다. TNFα 치료는 염증 스트레스 내 피 세포에 의해 표시 형태 변경 후 HUVEC의 활성화 상태를 확인 하는 쉽고 간단한 방법. 그림 3에서 보듯이 HUVEC unstimulated 세포에 비해 TNFα의 6-h 후 연장. 유사한 신장 HUVECs은 TNFα와 VEGFA의 혼합에 의해 자극 될 때 관찰 된다. HUVEC의 활성화 상태를 기록 하는 것은 중요 monocytes의 환생의 최종 결과 내 피 세포 활성화의 품질에 따라 달라 집니다.

Monocyte 환생 내 피 세포에서 특성 중단 하 게

흐름에서 monocyte 환생을 연구, 우리 CMFDA와 핵 세포 투과성 Hoechst 33342 염료 (그림 4)와 파란색에서 스테인드 격리 monocytes의 녹색으로 얼룩진 내 피 세포 confocal 현미경 검사 법 사용. 시간 경과 confocal 영상 그들의 형 수 꼭대기 비행기에 monocytes의 시각화 (그림 4A-C, 보충 영화 1) 평가 허용. 환생을 겪고 마이그레이션 셀 꼭대기 비행기에서 사라진 기저 면에 등장 하기 전에 해당 셀 접합 하는 세포 공간으로 이동 합니다. Transmigrated 셀 monocyte 도형에 해당 하는 핵 주위 블랙 홀 제시. 이 셰이프는 끊임없이 내 피 세포 (그림 4A-C, 보충 영화 2-3) 아래 monocyte 마이그레이션 동안 변경. 내 피 세포 및 monocyte 위치 아래 monocyte 신체에 의해 만들어진이 동적 블랙홀 transmigrated 셀의 명확한 식별을 위해 허용. 시간이 지남에 monocyte 모집의 정량 monocyte 접착을 환생 (그림 4D-E)에 의해 따라 나타났다. 백혈구는 transcellular와 paracellular 경로 통해 extravasate 수 있습니다, 하지만 우리만이 방법으로 흐름 아래 paracellular 환생을 관찰 수 합니다. 이것은 우리의 이전 관측3,11,,1819일치.

신생 요소 구동 염증 촉진 CD16 + monocytes의 환생

이 메서드를 사용 하 여 우리 내 피 단층 염증 성 cytokine TNFα 혼자 또는 함께 신생 요소 VEGFA에 의해 자극된을 통해 인간의 proangiogenic 대 비 신생 monocytes의 환생을 분석 했다. Proangiogenic 인간 monocytes는 그들의 표면에는 CD16 또는 TIE2 식으로 확인할 수 있습니다. 여기, 안티-CD16-PE 항 체 프로 비-신생 monocytes 사이 차별을 사용 되었다. 그림 5A-B (보충 영화 4-5), CD16의 환생 속도 같이+ monocytes 때 낮은 내 피 세포만 TNFα로 자극 했다. 그러나,이 속도 증가 하면 내 피 세포는 TNFα와 VEGFA (그림 5C-E, 보충 영화 6-7) 동시에 자극 했다. 비 신생 monocytes의 환생 속도 모두 염증 성 조건 하에서 유사 하 게 높았다. 두 셀 부분 모집단에 대 한는 환생 paracellular 경로 통해 독점적으로 발생 했습니다. 따라서이 메서드는 다른 monocytic 인구의 환생 적성에 대 한 동시 조사를 수 있습니다.

Monocytes의 순도 영향을 미치는 환생 효율

주변 혈액 단 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, monocytes의 구성 됩니다. 여기에 사용 하는 monocyte 격리 방법 PBMC에서 다른 백혈구 인구 고갈을 필요 합니다. Monocyte 순도의 부족 결과 미치는 영향을 이해, 우리 PBMCs를 사용 하 고 흐름에서 채용 시험을 수행 하기 전에 안티-CD14-PE 항 체와 팬 monocytes에 대 한 스테인드. 그림 6에서 같이, TNFα 또는 TNFα + VEGFA HUVEC 자극만 monocyte 인구의 환생을 유도 한다. 다른 백혈구 구성 T 세포, B 세포와 NK 세포에 TNFα 또는 TNFα + VEGFA transmigrate 하지 않았다. 실제로, 그것은 이러한 백혈구 환생에 대 한 다른 신호 필요 문서화 되었습니다. 따라서, monocytes의 비효율적인 격리로 다른 백혈구 monocytes로 간주 될 것 이라고 monocyte 환생의 싼을 이어질 것입니다. 이 monocyte 환생, 다른 백혈구와 monocyte 인구의 오염 때문에 잘못 된 결과 이어질 것 이다.

그림 1: cytometry에 의해 격리 된 monocytes의 프로 파일링. 림프 구 고갈 전에 PBMC의 형태 (A) 분석. 크기 (앞으로 분산형: FSC) 및 세분성 (사이드 분산형: SSC) 말 초 혈액의 단 세포 cytometry에 의해 결정 되었다. (B) 크기와 절연된 monocytes의 세분성 림프 구 고갈 후 cytometry에 의해 결정 되었다. Monocytes의 효율적인 절연 림프 구 인구의 완전 한 고갈을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 유체 시스템의 다이어그램. (A) 전과 슬라이드 및 주사기 펌프에 장착 후 살포 시스템의 도식 개요. 튜빙 클램프를 사용 하 여 슬라이드를 연결 하는 프로세스의 (B) 도표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 내 피 세포의 효율적인 활성화 체크. 염증 성 자극에 의해 HUVEC의 활성화 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 셀 모양을 분석 하 여 확인 했다. 치료의 6 시간 후 HUVEC TNFα로 자극 하면 길쭉한 형태를 제시 (500 U/mL) 또는 TNFα의 혼합 (500 U/mL) + VEGFA (1 µ g/mL) unstimulated 세포에 비해. 염증 성 자극에 따라 HUVEC의 형태학 변화 흐름 분석 결과 대 한 보장 한다 세포 활성화의 검출 하기 쉬운 지표 이다. 눈금 막대 120 µ m = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: confocal 현미경 검사 법에 의해 transmigrated monocytes의. (A) 꼭대기와 기저 비행기에서 예상 전망과 monocyte 환생의 다이어그램. Hoechst 33342로 얼룩진 monocytes의 핵 파란색으로 그려져 그리고 monocytes의 이론적인 모양 핵 주위에 파선으로 표시 됩니다. 기저 보기에서 transmigrated 플랫 monocytes 내 피 세포 아래 공간을 점유 하는 것 같습니다. 이 공간 confocal 이미지에 monocyte 핵을 둘러싼 검은 구멍으로 나타납니다. (B)의 지 방화는 monocyte 전과 환생 후. 직교 뷰 표시 됩니다, 그리고 내 피 abluminal 구획에 monocyte 마이그레이션 후 (흰색 점선으로 구분 된) 블랙홀의 모습을 관찰할 수 있다. 빨간 화살촉 환생 전에 monocyte 위치 나타내고 흰색 화살표는 환생 후 동일한 셀을 나타냅니다. 직교 뷰 transmigrated monocyte 내 피 세포 아래 표시 됩니다. 눈금 막대 = 40 µ m. (C) 시간 경과 이미지 시퀀스 (0-20 분)에서 monocyte 모집 연장. 꼭대기 및 기저 보기 표시 됩니다. 전체 시퀀스 추가 영화 1, 2, 3에서에서 볼 수 있습니다. 빨간색 사각형 transmigrated monocyte 블루 핵으로 강조 표시합니다. 내 피 세포 아래 monocyte의 평면 몸에 해당 하는 블랙 홀은 황색 파선으로 구분 된. 눈금 막대 = 40 µ m. (D) 대 TNFα 자극에 monocyte 접착의 정량화는 시간이 지남에 따라 HUVEC unstimulated. 시간이 지남에 monocyte 환생 속도의 (E) 정량화 N = 3 생물 복제. 평균 ± 사 우 스 다코타 데이터 제시는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: 흐름 아래 monocyte 모집단의 환생의 동시 조사. (A) 시간 경과 이미지 시퀀스 (0-20 분)에서 proangiogenic monocytes의 채용 (CD16+)와 비 신생 monocytes HUVEC TNFα 활성화를 통해 시간이 지남에. 눈금 막대 = 40 µ m; 꼭대기 및 기저 보기 표시 됩니다. 전체 시퀀스에 대 한 보충 영화 4 에서 볼 수 있습니다 꼭대기 기저 플레이 추가 영화 5 . (B) 인간 proangiogenic monocytes의 환생의 정량 (HPMo: CD16 +)와 HUVEC TNFα 활성 단층을 통해 인간의 비 신생 monocytes (HNMo). N = 4 생물 복제, 데이터 평균 ± 사 우 스 다코타도 제공 됩니다 * p < 0.05; 맨-휘트니 테스트 합니다. (C) 시간 경과 이미지 시퀀스 (0-20 분)에서 초과 TNFα + VEGFA 활성화 HUVEC 통해 proangiogenic와 비 신생 monocytes의 채용의. 눈금 막대 = 40 µ m; 꼭대기 및 기저 보기 표시 됩니다. 전체 시퀀스에 대 한 보충 영화 6 에서 볼 수 있습니다 꼭대기와 기저 플레이 추가 영화 7 . Proangiogenic 인간 monocytes의 환생의 (D) 정량 (HPMo: CD16 +)와 인간의 비 신생 monocytes (HNMo: CD16-) HUVEC TNFα + VEGFA 활성 단층을 통해. N = 4 생물 복제, 데이터 평균 ± 사 우 스 다코타도 제공 됩니다 * p < 0.05; 맨-휘트니 테스트 합니다. (E) (10 분) 전에 CD16 지역화+ monocytes (15 분) HUVEC TNFα + VEGFA 자극 통해 환생 후. 직교 뷰 표시 됩니다. 눈금 막대 40 µ m = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6: CD14 + 대 CD14-PBMC 흐름에서의 환생의 동시 조사. (A) 접착 CD14+대 CD14- PBMC 흐름에서 HUVEC TNFα 활성화 하. (B) 접착의 CD14+대 CD14- PBMC 흐름에서 HUVEC TNFα + VEGFA 활성화 하. (C) 환생 CD14의 비율 (%)+대 CD14- PBMC 흐름에서 HUVEC TNFα 활성화를 통해. (D) 환생 CD14의 비율 (%)+대 CD14- PBMC 흐름에서 HUVEC TNFα + VEGFA 활성화를 통해. 데이터는 평균 ± 사 우 스 다코타 N = 4 생물 복제. * p < 0.05; 맨-휘트니 테스트 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 1: 흐름 아래 팬 monocyte 모집의 꼭대기 비행기에서 보기. 팬 monocyte 꼭대기 비행기에서 흐름에서의 채용의 확장 된 보기. HUVEC CMFDA로 얼룩진 했다 그리고 monocytes의 핵 Hoechst 33342 라이브-스테인드. 눈금 막대 50 µ m = 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 2: 흐름 아래 팬 monocyte 모집의 기저 비행기에서 보기. 기초 평면에서 흐름 아래 팬 monocyte의 채용의 확장 된 보기. HUVEC CMFDA로 얼룩진 했다 그리고 monocytes의 핵 Hoechst 33342 라이브-스테인드. 눈금 막대 50 µ m = 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 3: 흐름 아래 팬 monocyte 모집의 z 스택의 최대 투영. 팬 monocyte 보충 영화 1과 2에서와 같이 흐름에서의 채용의 확장 된 보기. HUVEC CMFDA로 얼룩진 했다 그리고 monocytes의 핵 Hoechst 33342 라이브-스테인드. 눈금 막대 50 µ m = 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 4: TNF에 monocyte 모집단의 채용의 꼭대기 평면에서 보기α-활성화 HUVEC. 흐름에서 HUVEC TNFα 활성화 흐름 아래 monocyte 모집단의 동시 채용의 꼭대기 평면에서 보기 확장. HUVEC CMFDA로 얼룩진 했다 그리고 monocytes의 핵 Hoechst 33342 라이브-스테인드. Proangiogenic 인간 monocyte 모집단 CD16의 표면 식으로 확인 되었다. 눈금 막대 = 30 µ m. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 5: TNF에 monocyte 모집단의 채용의 기저 면에 보기α-활성화 HUVEC. 흐름에서 HUVEC TNFα 활성화 흐름 아래 monocyte 모집단의 동시 채용의 기저 평면에서 확장 된 보기. HUVEC CMFDA로 얼룩진 했다 그리고 monocytes의 핵 Hoechst 33342 라이브-스테인드. Proangiogenic 인간 monocyte (HPMo) 부분 모집단 CD16의 표면 식으로 확인 되었다. 눈금 막대 = 30 µ m. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 6: TNF에 monocyte 모집단의 채용의 꼭대기 평면에서 보기α+ VEGFA 활성화 HUVEC. 흐름에서 HUVEC TNFα + VEGFA 활성화 흐름 아래 monocyte 모집단의 동시 채용의 꼭대기 평면에서 확장 된 보기. HUVEC CMFDA로 얼룩진 했다 그리고 monocytes의 핵 Hoechst 33342 라이브-스테인드. Proangiogenic 인간 monocyte 부분 모집단 CD16의 표면 식으로 확인 되었다. 눈금 막대 30 µ m = 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 7: TNF에 monocyte 모집단의 채용의 기저 면에 보기α+ VEGFA 활성화 HUVEC. 흐름에서 HUVEC TNFα + VEGFA 활성화 흐름 아래 monocyte 모집단의 동시 채용의 기저 평면에서 확장 된 보기. HUVEC CMFDA로 얼룩진 했다 그리고 monocytes의 핵 Hoechst 33342 라이브-스테인드. Proangiogenic 인간 monocyte (HPMo) 부분 모집단 CD16의 표면 식으로 확인 되었다. 눈금 막대 30 µ m = 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.