생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

요약

여기, 우리가 특정 표면 마커 및 공초점 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 흐름 체 외에서 매매 하는 monocyte 부분 모집단을 측정 하는 통합된 프로토콜 제시. 이 프로토콜은 다른 특정 표면 마커를 사용 하 여 다른 백혈구 하위 프로로 뿐만 아니라 순차 모집 단계를 탐험 하 사용할 수 있습니다.

초록

타겟된 주변 조직에 혈액에서 monocytes의 모집 조직 부상, 종양 개발 및 자가 면역 질환 염증 과정에 중대 하다. 이것은 그들의 접착 및 transendothelial 마이그레이션 (환생) 뒤에 기본 영향을 받는 조직으로 활성화 된 내 피 세포의 표면에 luminal 무료 흐름에서 캡처의 과정을 통해 촉진 된다. 그러나, monocyte 모집단의 특혜와 맞는 채용을 지 원하는 메커니즘은 아직 완전히 이해. 따라서, 다른 monocyte 모집단 동시에 시각화 하 고 흐름에서 측정의 채용을 허용 하는 방법을 개발 했습니다. 시간 경과 confocal 영상에 따라이 메서드는 부착 및 transmigrated monocytes 사이 명확한 구별에 대 한 수 있습니다. 여기, 우리는이 메서드를 사용 하 수 있습니다 프로 신생 및 비 신생 monocytes 체 외의 모집 캐스케이드를 동시에 공부 하는 방법을 설명 합니다. 또한,이 메서드는 최대 3 개의 monocyte 인구의 신규 모집의 다른 단계를 공부 하 확장할 수 있습니다.

서론

Monocytes의 병원 체, 손상 된 조직, 신생, 고 암^{1,2,3 포함 하 여 많은 질병의 병 태 생리학 정리 싸움을 위해 필수적 이다 타고 난 면역 phagocytic 구성 요소 구성} . Monocytes는 골 수 유래 세포 혈액에 순환 하지만 특정 분자 메커니즘을 통해 주변 조직에 염증의 사이트에 채용 될 수 있는 다른 유형의 모집단의 구성 이다. Monocytes, 백혈구에 관해서는 모집 캐스케이드 일반적으로 다른 단계 캡처, 압 연, 크롤링, 체포, transendothelial 마이그레이션 (환생) 및 혈관 벽 (지하실 멤브레인와 벽화를 통해 마이그레이션 등 연루 셀)⁴. 다음이 단계는 주로 ligands selectin 같은 백혈구에 풀, 당단백질 ligands, 발산, 세포 및 접합 접착 분자, 그리고 그들의 수용 체와 같은 내 피 luminal 표면에 염증 유발 분자를 포함 그리고 integrins입니다. 밀매 경로 중 하나는 내 피 세포 접합 (paracellular) 나 내 피 세포 체 (transcellular)를 통해 백혈구에 의해 내 피 장벽⁵를 사용할 수 있습니다. Monocytes transcellular 경로 통해 transmigrate를 역사적으로 문서화 되어, 하는 동안 그들의 철새 통로의 잠재적인 차이점 monocytes 균질 세포 인구 이라고 여겨진다 이상으로 제안 되었습니다. 그것은 이제 분명 monocyte 다양성 각 그들의 차이 공통점에 의해 정의 될 수 있습니다, 그들의 독특한 넘쳐 흐름에 관하여^3,6폭포 되고있다. 따라서, monocyte 모집단 사이 차별 명확 하 게 하기 위해 시각화 하는 중요 한 고 형 채용 중이 다른 모집단의 각 동작을 처리.

인간 monocytes, 돼지, 쥐, 마우스 특정 관찰 기능 및 특정 철새 동작^7,,89phenotypic 모집단으로 세분화 했다. 예를 들어 인간 monocytes는 CD16, Fc 감마 수용 체 III CD14, 세균성 lipopolysaccharide에 대 한 coreceptor의 그들의 표면 식에 따라 3 개의 하위 집합으로 나눌 수 있습니다. 인간 monocyte 모집단 클래식 CD14 포함⁺CD16^-, CD14 중간⁺CD16⁺ 및 비 고전 CD14^어둡게CD16⁺ 세포^6,9. 클래식 CD14⁺CD16^- monocytes는 주로 염증 성 표시 했다 반면 CD16 수영장⁺ monocytes 총칭 TIE2 표현과 proangiogenic 함수¹⁰선물을 발견 했다. 일관 되 게, 인간의 종양 괴 사 등 염증 성 cytokines와 내 피 성장 세포 자극 인자 (TNF) α 또는 인터 루 킨 (일리노이-1) 베타 (기존의 염증)은 고전 CD14의 완전 한 신규 모집을 실행 하는 충분 한⁺CD16 ^- monocytes입니다. 그러나, 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF)와 TNFα (신생 요소 기반 염증)의 동시 작업은는 CD16의 환생을 자극 하는 데 필요한⁺ monocytes³의 proangiogenic 풀. 역사적으로, 정적 조건, 병렬 플레이트 흐름 챔버 및 µ-슬라이드 흐름 챔버 전통적인 Transwell 시스템 양적 분석 한 시간에서 시험관에^{11에 한 백혈구 인구의 모집 하는 데 사용 되었습니다. ,,1213}. 이러한 프로토콜을 검증 하는 동안 여러 monocyte 모집단의 동시 분석을 허용 하는 더 강력한 방법 여겨질 것입니다 더 많은 통찰력. 이러한 방법론 여러 상호 작용 및 각 각각의 서로 다른 주파수를 담당 하 고 또한 각 monocyte 정의 하는 모집 계곡에 대 한 유사성과 특이성의 기계적 이해를 제공 해야 합니다. 하위 집합입니다.

여기, 우리 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 동시에 공부 될 다른 monocyte 모집단의 철새 계곡 수 있는 흐름 아래 monocyte 모집의 시간 경과 영상에 따라 방법 제시. 이 방법은 hemodynamics 순환 후 모 세관 venules에 monocytes의 vivo에서 백혈구 신규 모집의 주요 위치 뿐 아니라 내 피 세포 염증, 모방 하는 특정 중요 한 기능을 통합 합니다. 제안 된 방법은 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC), 인간의 탯에서 고립의 잘 설립 된 프로토콜을 통해 생성 되는 사용 합니다. 이 임상 자원 또한 탯 줄 정 맥 으로부터 격리 될 수 있는 내 피 세포의 적당 한 수익률을 제공 하는 반면 생물 학적 부산물로 쉽게 사용할 수 있는 이점이 있다. 우리는 또한 사용 형광 염료와 면역 형광 monocyte 위치 (abluminal 대 luminal) 명확 하 게 정의에 confocal 현미경 검사 법 및 다른 세포질 구성 요소 구분을 시간이 지남에. 여기에 제시 된 프로토콜을 동시에 측정 monocyte 모집단의 환생 레벨 개발 되었습니다. 또한, 그것은 다른 biomarkers 및 라벨의 사용 하 여이 방법론 공부 다른 백혈구 모집단 및 채용 프로세스를 확장할 수 있습니다 주목 해야한다.

프로토콜

인간의 재료 자원 봉사 기증자의 및 임상 연구에 스위스 윤리 위원회에 통지 해준 동의 함께 사용 되었다.

1. 격리와 인간의 탯 줄의 정 맥 내 피 세포 (HUVEC)

1. HUVEC 절연을 시작 하기 전에 코팅 솔루션의 5 mL는 T75 플라스 크 (0.1 mg/mL 콜라겐 G 및 인산 버퍼 pH 7.4에서 염 분 PBS에 0.2% 젤라틴) 37 ° C에서 30 분을 추가 합니다.
2. PBS 가진 코드를 청소, 살 균 압축으로 닦 고 살 균 20 cm 배양 접시에. 살 균가 위 코드의 끝을 잘라.
3. 하나의 큰 정 맥과 두 개의 작은 동맥을 식별 합니다. 부드럽게 코드 끝에 정 맥 사지에 그것에 연결 된 3 방향 자 지와 함께 한 캐 뉼 러를 삽입 합니다.
4. 코드 및 정 맥 연결 와이어의 길이와 단단히 조입니다.
5. 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스 250 ng/mL 코드의 혈관을 씻어 암포 B 포함 된 RPMI 매체의 20 mL로 두 번 코드 perfuse 이 프로세스 하얀 하 고 명확 하 게 코드의 모양을 만든다. 한쪽 끝에 주사기는 RPMI 수집 하 여 콜라 추가 하기 전에 정 맥을 비어 있습니다.
6. 1 mg/mL 콜라 형식의 12 mL와 함께 정 맥 perfuse 나 (0.22 μ m 필터).
7. 닫기 코드에서 자 지 그리고 12 분 동안 37 ° C에서 코드를 품 어.
8. 부드럽게 마사지 정 맥 루멘에서 내 피 세포를 분리 하려면 코드.
9. 받아 30 mL 50 mL 주사기 10% 태아 종 아리 혈 청에 포함 된 RPMI의 고 탯의 한쪽 끝을 연결 합니다.
10. 탯의 다른 쪽 끝에는 빈 50 mL 주사기를 연결
11. 자 지를 열고 상호로 다른 쪽 끝에서 수집 하는 동안 한쪽에서 정 맥을 perfuse.
    참고: 수집 된 서 스 펜 션 내 피 세포를 포함 되어 있습니다.
12. 5 분 동안 200 x g 에 세포 현 탁 액이 원심
21. 4. 
       

4. 
   

9. 
   
11. 1. 
       
    12. 
        
20. 
    

1. 
   
2. 
   
9. 
   
   

3. 
   
8. 
   

결과

HUVEC 활성화 TNFα에 의해 유도 된의 상태 확인

염증 성 cytokine TNFα의 생물 활동 일괄 처리 및 냉동 녹고 사이클의 반복에 따라 달라질 수 있습니다. 그것은 TNFα 치료와 HUVEC의 활성화 상태를 확인 하는 것이 중요입니다. 이 풀, ICAM-1 및 VCAM-1^15,16,17의 염증 유도 confluent HUVEC의 일부 샘플 병렬로 얼룩 수행 수 있습니다. TNFα 치료는 염증 스트레스 내 피 세포에 의해 표시 형태 변경 후 HUVEC의 활성화 상태를 확인 하는 쉽고 간단한 방법. 그림 3에서 보듯이 HUVEC unstimu...

토론

여기, 우리가 어떻게 monocyte 모집단 염증이 내 피 단층을 통해 transmigrate의 연구를 자세히 설명 하는 방법 보고. 토론된 방법 단계 대조 현미경 검사 법, 또한 흐름^3,,1119monocyte 모집을 공부 하는 데 사용 되는 대신 confocal 현미경 검사 법을 사용 합니다. 시간 경과 영상에 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여의 주요 장점 중 하나는 환생 및 monocytes의 강한 접착 사이 명확 하 게 구별할 수 있는 능력입니다. 단계 대조 현미경-기반 방법은 강력한도 하지만, 전문을 transmigrated 세포와 강하게 부착 세포를 혼합을 피하기 위해 필요 합니다. 이 경우에, 하나는 monocyte 모집 캐스케이드의이 두 가지 상태 간의 명확한 차이 만들기 위해 분석에 대 한 엄격한 기준을 설정 해야 합니다. 또한, 그것...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
조직 배양 플라스크 75 cm2	TPP	90076	Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4	IBIDI	80606
Centrifuge Tubes 15 mL	TPP	191015
Centrifuge Tubes 50 mL	TPP	191050
Collagen G	Biochrom	L 7213	세포 배양 코팅용 플라스크
젤라틴	Sigma-Aldrich	1393	세포 배양 플라스크
Dulbecco의 코팅용 s 인산염 완충 식염수(MgCl2 및 CaCl2)	제외)Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(MgCl2 및 CaCl2)	시그마-알드리치	D8662
RPMI-1640 매체	시그마-알드리치	R8758
3방향 스톱콕	BIO-RAD	7328103
페니실린 10,000 μ/mL 스트렙토마이신 10,000 μ g/mL fungizone 25 μ/mL	AMIMED	4-02F00-H
콜라겐분해효소 유형 1	Worthington	LS004216
Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes	GIBCO 22340020
소 알부민 분획 V	ThermoFisher	15260037
내피 세포 성장 보조제, 150 mg	Millipore	02-102
헤파린 나트륨	시그마-알드리치	H3149RT
하이드로코르티손	시그마-알드리치	H6909
L-아스코르브산	시그마-알드리치	A 4544
EDTA 이나트륨 염 이수화물 C10H14N2Na2O8 · 2H2O	APPLICHEM	A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), 인간 재조합 클론: REA199, FITC	Miltenyi Biotech	130-100-713	AB_2655150
CD31-PE 항체, 인간 재조합 클론: REA730, PE	Miltenyi Biotech	130-110-807
AB_2657280 Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC	Miltenyi Biotech	130-107-016	AB_2653263
BD Accuri C6 Plus	BD Bioscience
µ-Slide I Luer	IBIDI	80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)	ThermoFisher	C2925
재조합 인간 TNF &알파;	Peprotech	300-01A
재조합 인간 VEGFA	Peprotech	100-20
NE-1000 프로그래밍 가능한 주사기 펌프	KF 기술	NE-1000
Ficoll  Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE	Miltenyi Biotech	130-110-519
AB_2655051 Pan Monocyte Isolation Kit, human	Miltenyi Biotech	130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE	Miltenyi Biotech	130-106-762	AB_2655403
LS 컬럼	Miltenyi Biotech	130-042-401
QuadroMACS 분리기	Miltenyi Biotech	130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	ThermoFisher	H1399
실리콘 튜빙	IBIDI	10841
엘보 루어 커넥터	IBIDI	10802
암 루어 잠금 커플러	IBIDI	10823
루어 잠금 커넥터 암	IBIDI	10825
인라인 루어 주입 포트	IBIDI	10820
Ar1 컨포칼 현미경	Nikon
40x 대물	Nikon	40x 0.6 CFI ELWD S 평면 Fluor WD:3.6-2.8mm 보정 0-2mm
ImageJ 소프트웨어	NIH