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방법 논문

Transcranial 직류 자극 (tDCS) 마우스

14.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58517

⸱

2018년 9월 23일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Tecnologia em Medicina Molecular (CTMM), Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Minas Gerais

이 논문에서

요약

Transcranial 직류 자극 (tDCS) 정신 질환 치료를 제안 하는 치료 기술 이다. 동물 모델 tDCS에 의해 갖는 특정 생물 학적 변경 이해 하기 위한 필수적입니다. 이 프로토콜 사용 하 여 만성 이식된 전극 tDCS 마우스 모델을 설명 합니다.

초록

Transcranial 직류 자극 (tDCS) 여러 정신병 질환에 대 한 대체 또는 보완 치료로 제안 하는 비-침략 적 neuromodulation 기술입니다. TDCS의 생물학적 효과 완전히 이해 되지, 인간의 뇌 조직 취득에 어려움으로 인해 일부 설명. 이 프로토콜 사용 만성 이식된 전극 tDCS의 긴-지속적인 생물학적 효과의 연구를 허용 하는 tDCS 마우스 모델을 설명 합니다. 이 실험 모델에서 tDCS 대뇌 피 질의 유전자 발현을 변경 하 고 그것의 치료 적 사용에 대 한 근거의 이해에 두드러진 기여를 제공 합니다.

서론

Transcranial 직류 자극 (tDCS)은 낮은 농도 연속 전류1통해 신경 변조에 초점을 맞추고 비-침략 적, 낮은-비용, 치료 기술입니다. 현재 tDCS에 대 한 두 가지 설정 (anodal 및 cathodal)이 있다. Anodal 자극 한다 활동 전위를 방 아 쇠를 너무 약한 현재 전기 분야, 하는 동안이 방법은 생성 시 냅 스가 소성2변화는 전기 생리학 연구 나타났습니다. 예를 들어 증거 그 tDCS 유도 흥분 성의 postsynaptic 잠재력3,4 의 증가 피크 진폭 및 대뇌 피 질의 흥분5의 변조와 같은 장기 potentiation (LTP) 효과 보여줍니다.

반대로, cathodal 자극 억제, 막 hyperpolarization6결과 유도 합니다. 이 메커니즘에 대 한 가설 tDCS 조절 활동 전위 주파수 및 신경 시체3기간을 설명 하는 생리 적 연구 결과 기반으로 합니다. 특히,이 효과 않습니다 하지 직접 보여주고 활동 전위, 비록 도발은 임계값을 이동 하 고 촉진 하거나 신경 발사7방해 수 있습니다. 이러한 효과 대조 이전 설명 되 있다. 예를 들어 anodal 및 cathodal 자극 토끼8조건부 응답 등록 을 통해 전도 활동에 반대 효과 생산. 그러나, 연구는 또한 보여주었다 자체 대조 효과3를 제시 하는 흥분으로 이어질 수 있습니다 cathodal 전류를 증가 하는 동안 장기간된 anodal 자극 세션 흥분을 줄일 수 있습니다.

Anodal와 cathodal 모두 자극 전극 쌍의 사용 하 여를 집계합니다. 예를 들어 anodal 자극, "활성" 또는 "양극" 전극 "참조" 또는 "음극" 전극의 전류 효과 하 찮은9로 간주 됩니다 지역에 위치 하 고 있습니다 반면 변조 하 뇌 영역에 배치 됩니다. Cathodal 자극에 전극 처리는 거꾸로입니다. 효과적인 tDCS 자극 강도 현재 강도에 따라 달라 집니다 그리고 전기에 영향을 미치는 전극 크기10다르게 필드. 가장 출판된 연구에서 평균 전류 강도 0.10 ~ 2.0 사이 mA와 0.1 0.8 mA 인간 및 쥐, 각각6,11를. 35 c m2 의 전극 크기는 인간에서 일반적으로 사용 된다, 설치류에 대 한 전극 크기에 대 한 적절 한 이해 없는 그리고 더 철저 한 조사는 필요6.

tDCS 제공 하는 여러 신경 정신병 무질서11 간 질12, 양극성 질환13, 스트로크5 등에 대 한 대체 또는 보완 치료의 시도 함께 임상 연구에서 제안 되었습니다. , 주요 우울증14,15Alzheimer의 질병, 다 발성 경화 증16 와 파 킨 슨 병17. TDCS 관심과 임상 시험, 상세한 휴대 및 뇌 조직, 짧은 분자 갖는 변경 및 긴-지속 효과, 뿐만 아니라 행동의 결과에 그것의 사용, 성장에 불구 하 고는 아직 수 더 깊이 조사18, 19. tDCS 동물 모델의 사용 세포질이 고 분자 이벤트에 대 한 접근으로 인해 tDCS의 치료 메커니즘을 기본으로 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다 tDCS을 철저 하 게 공부에 대 한 직접 인간의 접근 가능한 이기 때문에 동물의 뇌 조직입니다.

사용할 수 있는 증거는 쥐에서 tDCS 모델에 관한 제한 됩니다. 보고 모델의 대부분은 다른 이식 레이아웃, 전극 크기, 및 자료 사용. 예를 들어 윈 클 러 외. (2017) 염 분 가득한 머리 전극 (Ag/AgCl, 직경에서 4 mm)을 이식 하 고 아크릴 시멘트 및 나사20은 두개골에 고정. 우리의 접근 방법에서 다른, 그들의 가슴 전극 이식된 (백 금, 20 x 1.5 m m) 이었다. Nasehi 외. (2017) 사용 절차, 우리에 게 매우 유사한 흉부 전극 식 염 수에 젖은 스폰지 (탄소, 9.5 c m2)21에서 만들어졌다. 또 다른 연구는 히드로 지휘자22와 동물의 머리를 커버 하 고 고정된 플레이트를 사용 하 여 달성 되었다 동물의 머리에 두 전극 이식. 여기, 우리 간단한 수술 절차 및 tDCS 설정 (그림 1) 만성 이식된 전극 사용 하는 tDCS 마우스 모델을 설명 합니다.

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프로토콜

개별적으로 보관 되어 남성 성인 (8-12 주) C57BL/6 쥐이 실험에서 사용 되었다. 동물 이전, 도중 및 음식과 물 실험 절차 후 적절 한 치료를 받은 ad libitum. 모든 절차는 연방 대학의 미나스제라이스에서 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (프로토콜 번호 59/2014).

1. 전극 배치

  1. Sedating 및 stereotaxic 기구에 동물을 편집증
    1. 모든 필요한 수술 기구를 소독.
      참고입니다. 440 ° c.에 3 분 동안 수술 기구 소독 했다 면봉 20 분 동안 121 ° C에서 20 psi (평방 인치 당 파운드)에 압력가 마로 소독 했다.
    2. 37 ° c 열 플랫폼 컨트롤러를 조정
    3. 그리고 무게는 동물 마 취 유도 대 한 적절 한 복용량을 계산. 100 mg/kg 케 타 민 및 8 mg/kg xylazine, intraperitoneally 주어진 (바늘 크기, 31 G)의 복용량 마 취 제와 xylazine의 혼합물을 사용 합니다. 동물 2 ~ 3 분 이내 잠들어가 한다.
    4. 수술 사이트 다운 면도 전기 면도기 또는 면도기를 사용 합니다.
    5. 장소 미리 따뜻하게 위로 stereotaxic 기구에 동물 난방 격판덮개.
    6. 동물의 머리를 잡고 고 각 stereotaxic 플랫폼으로 그것을 해결 하기 위해 동물의 귀에 삽입 팁 귀 바.
    7. 이며 아무 측면 머리 이동 후 작은 수직 운동을 천천히 동물의 머리 위치를 이동 하 여 확인 합니다.
    8. 부드럽게 마우스의 코를 통해 마 취 마스크를 슬라이드와 나사를 강화 하 여 장소에 그것을 수정.
    9. 1 %1.0 L/min의 O2는 isoflurane를 설정 합니다.
    10. 수술 중 각 막 건조 방지 하기 위해 동물의 눈에 눈 연 고를 적용 합니다.
  2. 동물의 머리에는 임 플 란 트를 연결
    1. Povidone-요오드 (또는 2% 액체)의 3 개의 교체 수술 용 외과 사이트를 준비 하는 면봉을 사용 하 여 및 70% 에탄올.
    2. 핀셋의 쌍을 사용 하 여 가볍게 동물의 발가락을 압박 하 고 동물의 페달 철수 (발가락 핀치) 반사의 손실을 확인 하 여 마 취 깊이 확인 합니다.
    3. 약 3 m m 절 개 후부 동물의 귀 라인을 만들고 눈 라인에. 절 개 사이트에 이식 받을 수 될 길이 대략 1 cm 있어야 합니다.
    4. 부드럽게 접착제 향상과 준수 시멘트 뼈 스 크레이 퍼와는 두개골을 다쳤어요. 마이크로 스크래치를 만드는 도와 힘이 빛을 마십시오.
    5. 신중 하 게 수술 후크 오픈 수술 분야를 유지 하 고 피부와 모피 같은 장애물의 무료를 느슨한 피부에 위치.
    6. 동물의 두 피를 건조 멸 균 면봉을 사용 합니다.
    7. 해 현미경을 사용 하 여 동물의 두개골의 상단을 시각화.
    8. Stereotaxic 홀더를 바늘을 연결 하 고는 bregma 찾습니다. 약간은 bregma 감동 하는 동물의 머리 바로 위에 바늘을 위치.
    9. 다음 바늘을 인상 및 디지털 추적 프로그램에 모든 좌표 밖으로 0.
    10. TDCS 이식 stereotaxic 소유자 수정. 동물의 머리에 놓고 이식 및 그것은 천천히 적절 한 stereotaxic 좌표를 사용 하 여 관심사의 지역에.
    11. 임 플 란 트의 기지에 슈퍼 접착제의 1 방울 (약 35 μ) 확산 바늘을 사용 합니다.
    12. 그것은 두개골을 건드리면 때까지 아래쪽으로 소유자 이동 천천히. 임 플 란 트 자료는 전적으로 표면 접촉 해야 합니다.
    13. 제조업체의 지침에 따라 수술 시멘트를 준비 합니다.
    14. 정확한 위치 지정 후 적용 3 얇은, 심지어 레이어는 두개골 및 이식의 하단에 시멘트의. 드롭 드롭 응용 프로그램 브러쉬를 사용 하 여 당 적용 됩니다. 레이어 추가 구조 지원을 플 언덕 모양의 구조를 형성 해야 합니다.
    15. 부드러운, 막힘 없는 연결을 허용 하는 시멘트의 깨끗 한 임 플 란 트의 나사 스레드를 둡니다.
    16. 각 레이어 약 4 분 동안 건조를 허용 합니다.
    17. 건조 하면, 조심 스럽게 이식에서 완전히 분리 될 때까지 소유자 제거. 동물의 두개골에서 실수로 추출 수 있습니다 이후 임 플 란 트, 처리할 때는 항상 극단주의 사용 합니다.
  3. 마무리 수술과 수술 후 관리
    1. 식 염 수에 젖은 면봉으로 절 개 사이트에 동물의 피부 하이드 레이트.
    2. 코트 tDCS 임 플 란 트의 동안 피부.
    3. 핀셋의 쌍을 사용 하 여 조직을 함께 가져오고 조직의 0.2 cm 당 수술 조직 접착제의 방울으로 절 개를 닫습니다.
    4. 1-2 %lidocaine 절 개 사이트에 침투 하 고 기본 조직.
    5. 젖 산 벨의 솔루션의 500 µ L 마우스 피하 하이드 레이트.
    6. 미리 데워 진된 (37 ° C) 청소, 단일 보관 되어 감 금 소에 마우스를 놓습니다.
    7. 다음 시간에 음식에 쉬운 접근을 위한 감 금 소에 젖은 음식 펠 릿을 가진 작은 접시를 넣어.
    8. 동물의 수술 후 체중을 등록 합니다.
    9. 수술 후 및 다음 2 일에 피하 동물 ketoprofen (5 mg/kg)을 제공 합니다.
    10. 적어도 1 주 복구 동물의 밀접 하 게 모니터링 합니다. 조 난, piloerection, 손질, 운동 감소, 상처 긁 고 외과 사이트의 염증의 부족의 어떤 표시 든 지를 평가 합니다.

2입니다. tDCS 설치 및 자극

  1. tDCS 설치 ( 그림 2참조)
    참고입니다. TDCS 자극 완전히 충전 되어 있는지 확인 합니다.
    1. TDCS 자극을 양극 및 음극 케이블을 연결 하 고 자극 사이트 근처 사용할 수 있도록. Stereotaxic 홀더 핀 형 전극을 연결 합니다.
    2. 37 ° c 열 플랫폼을 설정
    3. 흡입 마 취 시스템 1 L/min에 산소 유량 계를 켭니다.
    4. 마 취 유도 챔버에 마우스를 놓습니다.
    5. 3 %isoflurane 기화 기를 켭니다. 4 분 isoflurane 효과을 동물 허용.
    6. 유도 챔버에서 동물을 실행 하는 동안 멸 균 주사기를 사용 하 여 0.9% 식 염 수 솔루션 바디 전극을 채우기 위해.
    7. 유도 챔버에서 동물을 제거 하 고 신체 전극의 가슴을 놓고.
    8. 부드럽게 마우스의 코 마 취 마스크 슬라이드 그리고 장소에 그것을 해결. 낮출 isoflurane 출력 1.5%.
    9. 이식 및 핀 형 전극 식 염 수로를 신중 하 게 그들을 첨부.
    10. 자극 시간과 현재 강도 조정 합니다.
    11. TDCS 자극에 연락처 품질을 확인 합니다. 최적의 접촉 1 ~ 10의 규모에 10 7에서 갑니다.
  2. 자극
    1. 자극을 시작 합니다.
    2. 30을 위해 현재 램프 관찰 s 선택한 값 및 자체 유지를 꾸준히 설립 동안에, 그 후에, 다시 아래로 램프 세션의 끝에.
    3. 컨트롤 마우스 가짜 버튼을 활성화 합니다.
    4. 30을 위해 현재 램프 관찰 s 선택한 값 그리고 아래로 아래로 연속 램프 끝에 선택 된 값에 최종 진입로와 자극 기간의 나머지에 대 한 1.
    5. 자극 세션이 완료 되 면 신중 하 게 10 분을 위한 미리 데워 진된 (37 ° C) 케이지는 동물 전송.
      참고입니다. 동물 3 분 후 각 성 하기 시작 합니다.
    6. 흡입 마 취 시스템을 해제 합니다.

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결과

수술 프로토콜 없이 염증 신호 자극된 사이트에 다른 원치 않는 효과 함께 적어도 한 달 동안 장기 임 플 란 트 안정성을 제시. 모든 동물 살아 수술 절차 및 tDCS 세션 (n = 8). 이 실험에서 tDCS 이식 M1 및 M2 외피가 (1.0 m m 앞쪽 후부 및 bregma에 0.0 m m 옆)에 위치 했다. 1 주일 후, tDCS (n = 3-4)와 가짜 (n = 3) 마우스 0.35에서 10 분 동안 5 일 연속에 대 한 자극 했다 mA. 연락처 품질 (CQ) 값 이식 생존 능력을 평가 하기 위해 등록 하 고 5 일 자극 과정 (그림 3A) 그룹 사이 중요 한 차이가 발견 됐다. 이 동물 모델을 사용 하 여 자극 성공 두뇌 파생 된 neurotrophic 요인 (BDNF)를 폐해 fibrillary 산 성 단백질 유전자 표현 수준의 평가 통해 결정 될 수 있다 (GFAP...

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토론

최근 몇 년 동안, 통제 기술을 되었습니다 입력 임상 연습 치료 정신병 질환23유망한 절차로. 통제의 메커니즘의 지식의 부족에 의해 부과 된 제약을 줄이기 위해, 우리는 여기 뇌 영역을 대상으로 수 전극 들고 tDCS 마우스 모델 제시. 전극 이식 만성 이기 때문에,이 동물 모델 tDCS (최소 1 개월)에 대 한 복잡 한 자극 패턴에 의해 갖는 긴-지속적인 생물학적 효과의 조사 수 있습니다. 제대로 실행 하는 경우 높은 임 플 란 트 관용과 감염의 기회가 거의 설명된 tDCS 동물 모델을 선물 한다. 전반적으로, 수술 단계는 임 플 란 트 배치를 신속 하 고 간단 실행 (30 분/동물)입니다. 이 tDCS 모델의 하나의 추가 장점은 전극 접촉 품질 및 실제 현재 자극 값을 추적할 수 있다는.

이 동물 모델의 주요 단점은 마우스의 두개골에 있는 적당 한 임 플 란 트 고정입니다. 수술 하는 동안 제한 하는 방식으로 이동 측면 머리 (머리...

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감사의 글

마우스 식민지를 유지 하는 도움에 감사 씨로 드리고 드 수 자 하 고. L.A.V.M 망 토 박사 후 연구원 이다입니다. 이 작품은 그랜트 PRONEX에 의해 지원 되었다 (FAPEMIG: APQ-00476-14).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BD 초미세 50U 주사기BD10033430026peritonially 주사용.
면도기(Philips Multigroom)Philips(브라질)QG3340/16수술 부위 트리밍용.
Surgical Equipment
Model 940 디지털 디스플레이 콘솔이 있는 소형 동물 입체 기구KOPF940동물 수술 제한 및 포지셔닝용.
모델 922 비파열 60도 팁 이어바KOPF922동물 수술 제한 및 포지셔닝용.
캐뉼라 홀더KOPF1766-AP임플란트 포지셔닝용.
붐 스탠드의 정밀 스테레오 줌 쌍안 현미경(III)WPIPZMIII-BS브레그마 위치 파악 및 임플란트 위치 지정용.
온도 제어 시스템 모델 KOPFTCAT-2LV동물 체온 제어용.
차가운 광원 WPIWA-12633초점 밝기
탁상용 실험실 동물 마취 시스템(소기 포함)VetEquip901820이소플루란 전달 및 안전성.
VaporGuard 활성탄 흡착 필터VetEquip931401Delivery 시스템 안전 조치. 
모델 923-B 마우스 가스 마취 헤드 홀더KOPF923-B동물 제한 및 O2 및 이소플루란 전달용.
산소 조절기, E-실린더 VetEquip901305O2 규정 및 배송용.
산소 호스– 녹색 VetEquip931503O2 및 이소플루란 전달용.
적외선 살균기 800 º CMarconiMA1201기기 살균용.
Surgical Instruments
Fine Scissors - ToughCutFine Science Tools14058-11절개용.
수술용 후크INJEX1636In House Fabricated - 수술 부위의 피부와 털을 제거하는 데 사용됩니다.
표준 핀셋 또는 집게--피부 잡기용.
Surgical 소모품
Vetbond3MSC-361931절개 봉합용.
시멘트 및 촉매 KIT (Duralay)Reliance2OZ임플란트 고정용.
멸균 면봉 (오토클레이브)JnJ75U수술 부위 방부제용. 
24 웰 플레이트(조직 배양 플레이트)SARSTEDT831,836시멘트 준비용.
응용 프로그램 : 브러시parkellS286시멘트 혼합 및 적용.
Pharmaceutics
Xylazin (ANASEDAN 2%)Ceva Pharmaceutical (Brazil)P10160마취 유도용.
케타민(DOPALEN 10%)Ceva Pharmaceutical(브라질)P30101마취 유도용.
이소플루란(100%)크리스트&아큐트; lia (브라질)100ML마취 유지 보수용.
리도카인(XYLESTESIN 5%)Cristal Pharma-수술 후 관리용.
케토프로펜(PROFENID 100mg)사노피 아벤티스20ML수술 후 관리용.
Ringer의 젖산 솔루션SANOBIOL LAB7898153652145수술 후 관리용.
TobraDex (덱사메타손 1 mg/g)Alcon631눈 윤활 및 보호용. 
Stimulation
Animal Transcranial StimulatorSoterix Medical2100현 세대용.
핀형 전극 홀더(원통형 홀더 베이스)Soterix Medical2100전극 지지대(임플란트).
핀형 전극(Ag/AgCl)Soterix Medical2100전류 전달용(전극). 
핀형 전극 캡Soterix Medical2100임플란트 보호용.
본체 전극 (Ag/AgCl 코팅)Soterix Medical2100전류 전달용 (전극). 
식염수 (0.9 %)FarmaX7896902206441전류 전달을위한 전도성 매체.
표준 핀셋 또는 집게--tDCS 설정용.
Real Time Polymerase Chain Reaction
BioRad CFX96 Real Time SystemBioRadC1000For qPCR
SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix (5 X 1mL)BioRad1725271For
qPCR Hard Shell PCR Plates PCT COM 50 p/ CFX96BioRadHSP9601For qPCR
Microseal "B" seal pct c/ 100qPCR을 위한BioRadMSB1001
,

참고문헌

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