유도 및 개미, Vollenhovia Emeryi 를 사용 하 여 근 친 십자가의 평가

요약

이 프로토콜에서 근 친 십자가 실시 하 고 그 십자가의 성공을 평가 하기 위한 메서드가 개미 Vollenhovia emeryi에 대 한 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 실험 Hymenoptera에 섹스 결정 시스템의 유전 기초를 이해 하기 위한 중요 합니다.

초록

성 결심 캐스케이드의 유전 및 분자 구성 요소는 꿀벌, Apis mellifera, hymenopteran 모델 생물에에서 광범위 하 게 연구 되었습니다. 그러나, 작은 다른 비 모델 hymenopteran taxa, 개미 같은 성 결정 메커니즘에 대 한 알려져 있다. Hymenopteran 종에서 진화 하는 라이프 사이클의 복잡 한 특성, 유지 하 고 실험실에서이 유기 체 사이 실험적인 십자가 실시 하기가 어렵습니다. 여기, 우리가 근 친 십자가 수행 하 고 개미 Vollenhovia emeryi에 그 십자가의 성공을 평가 하기 위한 방법을 설명 합니다. Emeryi 대를 사용 하 여 실험실에서 근 친을 유도 하는 것은 종족의 유일한 생물학 때문에 상대적으로 간단 합니다. 특히,이 종 생산 androgenetic 남성, 그리고 여성 reproductives 전시 날개 다형성, 유전 십자가에 고기의 식별을 단순화. 또한, 근 친 결혼의 성공 평가 간단 남성 제작 하실 수 있습니다 지속적으로 정상적인 남성만 잘 정의 된 생식 기간 동안 필드에 표시 하는 동안, 십자가 inbreeding로 합니다. 우리의 프로토콜을 사용 하 여 emeryi 대 모델로 개미 종에서 성 결심 체계의 유전과 분자 기초 조사를 허용 합니다.

서론

개미와 꿀벌, Eusocial Hymenopteran taxa heterozygous 하나 이상의 무료 섹스 결정에 어떤 개인 (CSD) loci 될 여성, 그는 호모-또는 hemizygous haplodiploid 성 결심 체계 진화 남성 (그림 1A)¹되.

섹스 결정 캐스케이드에 관련 된 유전자 및 분자 구성 요소는 꿀벌, Apis mellifera, hymenopteran 모델 생물^2,,34에 잘 연구 되었습니다. 최근 비교 유전체학 조사 개미와 꿀벌 섹스 결정 통로 초기 성 결정 유전자를 csd⁵등에서 많은 상 상속 homologs 공유 것이 좋습니다. 그러나,이 homologs의 기능 보존에 대 한 증거는 아직 개미 부족.

이 문제를 해결 하기 위해 근 친 라인 들은 유전 매핑 및 분자 연구에 필수적으로 개발 될 필요가 있다. 그러나, 유지 하 고 진화 하는 라이프 사이클의 복잡 한 특성 때문에 실험실에서이 유기 체 사이 실험적인 십자가 실시 하기가 어렵습니다.

여기, 우리가 개미^6,7성 결심 체계의 유전과 분자 기초 조사 모델 Vollenhovia emeryi 사용 합니다. 이 종의 근 친 라인 이전 개미⁶에 처음으로 섹스 결정에 관련 된 특성에 대 한 양적 특성 loci (QTL)의 연계 매핑을 위해 개발 되었다. 또한, 분자 성 결정 캐스케이드 조사⁷되었습니다. 이 종 특이 한 복제 시스템을 gynogenesis와 androgenesis (그림 1B)^8,9를 사용 하 여 진화 하고있다. 대부분의 새로운 퀸 즈와 남성 clonally 생산 됩니다 산 모와 아버지의 유전자에서 각각. 또한, 근로자와 일부 퀸 즈 생산 성적으로⁸. 이 복제 시스템은 성적으로 사용 하 여 생산 하는 근 친 십자가 퀸 즈 생산과 남성 클래식 backcross에 유전으로 동일 하기 때문에 유전자 연구에 특히 적합 합니다. 성적으로 생산된 퀸 즈 다 모성 유전자¹⁰ (그림 1B)에서 생산 하는 퀸 즈에서 형태학 상으로, 이후 실시 하 고 평가 하는 근 친 십자가 크게 단순화이 메서드를 사용 하 여.

이 문서에서는, 교차 시험, 실험실 식민지의 설립을 위한 방법 근 친 결혼의 응용 십자가 전체 sib 쌍을 사용 하 고 식민지 일원의 유전형과 남성 자손의 절 개를 사용 하 여 그 십자가의 성공 평가 생식 기는 emeryi 대에 설명 되어 있습니다.

복제 시스템 고용에 inbreeding 십자가의 응용 프로그램은 종종 어떤 조사는 Hymenoptera에 섹스 결정 시스템의 필수적인 첫 번째 단계. 예를 들어 Cardiocondyla obscurior, 2 중 남성 전체-sib 실험실에서 짝짓기의 10 세대 후의 거의 완전 한 부재 부재 CSD 로커 스¹¹의 보여 줍니다. 그것은 남성 근 친 십자가^6,,1213에서 생산의 비율에서 CSD loci의 수를 예측할 수 있습니다.

프로토콜

1. 필드 컬렉션 및 실험실에서 V. Emeryi 식민지의 유지 보수

참고: emeryi 대 의 둥지 썩 로그 및 일본 타락 한 부패 나무 branchesin 보조 숲에서 발견 된다. 이 종 식민지, 식민지 (1) 즉, 긴 날개 퀸 즈와 (2) 식민지 주로 짧은 날개 퀸 즈 퀸 즈 롱 날개^8,14의 작은 숫자 뿐만 아니라 생산의 두 가지 유형을 보여 줍니다. 이 프로토콜에서 이시카와 현, 일본에에서 식민지의 후자의 유형을 수집 했습니다.

1. 이른 여름 동안 emeryi 대 식민지를 수집 합니다.
   참고: 생식 시즌 동안 성적 개인의 충분 한 번호를 얻을, 식민지 포함 하는 300 개 이상의 개인 선호 됩니다.
2. 흡 인기 (그림 2, 왼쪽)를 사용 하 여 유리 커버와 함께 수집 된 지점에서 인공 석고 둥지 개미 견본을 전송.
3. 16:8 h 명암 주기에서 25 ° C에서 인공 둥지에 있는 식민지를 유지 합니다. 젖은 석고 세척 병으로 수돗물을 제공 합니다.
   1. 새로운 reproductives (F₁ 날개-퀸 즈와 F₁ 남성) 나타날 때까지 매일 갈색 설탕 물 채워진 팁 (20 µ L 팁) 및 알루미늄 호 일에 싸여 건조 귀뚜라미 분말의 약 100 mg을 추가 합니다.

2. 실험 실험실 십자가

참고: 새로운 reproductives (그림 3)가을에 늦 여름에서 등장 하기 시작 합니다. 긴 날개 퀸 즈는 성적으로, 생산 그리고 짧은 날개 퀸 즈 clonally 생산 모성 게놈 (그림 1). 사용 하 여 긴 날개 왕비와 남성 inbreeding 십자가 대 한.

1. 이동에서 개인을 중지, 방에 지속적인 환경 4 ° C에서 15 분 동안 식민지를 배치 합니다.
2. 입체 현미경 집게를 사용 하 여 30 노동자의 중간 다리를 제거 하 고 새로운 작은 석고 둥지로 (그림 2, 오른쪽) inbreeding 십자가 대 한 그들을 전송.
   참고: 이후 근 친 십자가 의해 생산 됩니다 노동자에서 현재 근로자를 구별 하는 다리 제거 됩니다.
3. 노동자를 포함 하는 석고 둥지로 3-4 유 충 이나 번데기를 추가 합니다.
   참고: 노동자 F₀ 퀸 즈 덜 식민지에서 탐구 활동을 표시. 유 충 이나 번데기에 게는 효과적으로 이러한 노동자와 식민지의 중심에 새로운 reproductives을 횡단 테스트 동안 끌 수 있다. 그 결과, 정상적인 식민지에 가까운 실험 식민지의 계속.
4. 긴 날개 왕과 남성 십자가 inbreeding 2.3 단계에서 준비 석고 둥지로 전송.
5. 음식과 물 제공 여왕 그녀의 날개를 잃게 하 고 알을 낳 기 때까지 1.3에 설명 된 대로 16:8 h 명암 주기에서 25 ° C에서 식민지를 유지.
   참고:이 한 달에 1 주일 걸립니다.
6. 입체 현미경 실험 식민지 매일을 확인 합니다. F₁ 자손 사이 십자가 근 친을 수행 후 계란 입체 현미경으로 관찰할 수 있습니다.
7. F₁ 여왕 시작 되 면 알을 낳고, F₁ 남성 및 애벌레 또는 pupae 둥지에서 단계 2.3에서에서 추가 된 F₁ 세대 (남성 및 여성 근 친 십자가에 사용) 및 F₂ 세대 (자손의 혼합 방지 제거 근 친 십자가에서 생산).
   참고: 식민지에 몇 남성 경우 가능 하다 근 친 십자가 같은 실험적인 식민지의 한 남성과 1 ~ 3 퀸 즈를 사용 하 여 유도 하.
8. F₂ 자손 등장 때까지 1.3에 설명 된 동일한 conditionsas에서 식민지를 유지.
   참고: 전송 F₁ 여왕 및 새로운 더 큰 석고 둥지로 (그림 2, 왼쪽) 장기 식민지 유지에 대 한 F₂ 자손.

3입니다. 근 친 성공의 평가

1. DNA 추출 및 유전형 부모의 세대 (F₀)의
   1. 한 다리의 집게를 사용 하 여 F₀ 여왕을 제거 하 고 1.5 mL microtube chelation 에이전트의 100 µ L를 포함 하는 다리를 전송.
   2. 입체 현미경, 유리 접시 집게를 사용 하 여 초순 수의 300 µ L로 가득에 여성 복 부 해 부 고 격리 spermatheca 성관계 남성에서 정자를 포함 하.
   3. 껍질 멀리는 spermatheca의 조직 그리고 곤충 핀을 사용 하 여 여자의 조직에서 정자를 분리.
      참고:는 spermatheca에서 정자 추출 촉진, 여성의 표본에에서 저장 100 %EtOH 이상 하루 전에 해 부에 대 한.
   4. 1.5 mL microtube chelation 에이전트의 100 µ L를 포함 하는 정자 전송할는 micropipette를 사용 하 여.
   5. F₀ 왕과 3.1.1와 3.1.3, 단계에서 각각 준비 하는 정액 샘플을 품 어, 20 분 플래시 95 ° C에서 원심은 microtube 및 4 ° c.에 저장
   6. 모든 샘플링 방법을 사용 하 여 유전자 형 설명 다른 곳⁴.
2. 개미 근 친 십자가 (F₁)에 대 한 사용의 쌍에서 DNA 추출
   1. Sib는 계란 생산 확인 F₁ 여왕 성관계, 후의 여왕 그녀의 창 고 날개 또는 한 중간 다리와 3.1 위의 섹션에 설명 된 동일한 메서드를 사용 하 여 유전자 형을 사용 하 여 DNA를 추출 합니다.
   2. DNA의 F₁ 남자를 사용 하 여 한 다리와 유전자 동일을 사용 하 여 추출 방법 3.1 위의 섹션에 설명 된.
      참고: 샘플은 DNA 추출, 전에 EtOH 및 DNA chelation 에이전트에서 4 ° c.에 두 달 동안 저장할 수 있습니다. 100%에 저장할 수 있습니다.
3. 남성 불 임 남성에서의 평가 inbreeding 십자가에서 생산
   참고: 근 친 십자가에서 생산 하는 2 중 남성 불 임 많습니다.
   1. 집게를 사용 하 여 PBS 솔루션의 400 µ L 유리 접시에 내부 생식 기관 해 부.
   2. PBS를 제거 하 고 4 %paraformaldehyde (PFA)는 micropipette를 사용 하 여 추가 합니다.
   3. 실 온 (15-25 ° C)에서 30 분 동안 PFA에 배양 하 여 조직 수정.
   4. 워시는 micropipette를 사용 하 여 PBS의 400 µ L로 5 회 조직.
   5. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 솔루션 1 µ g/ml PBS에 희석.
   6. PBS를 제거 하 고 조직에이 희석 DAPI 얼룩 솔루션의 약 300 µ L를 추가 합니다.
   7. 실 온 (15-25 ° C)에서 어두운 조건 하에서 15 분을 품 어.
   8. 5 번과 400 µ L의 PBS, 조직 세척 하 고 티슈 포 셉을 사용 하 여 슬라이드 유리의 센터에 전송.
   9. 중간 포함 Tetramethylrhodamine TRITC 활용 된 phalloidin 장착에 티슈를 탑재 합니다.
   10. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 20 X 63 X 렌즈를 사용 하 여 샘플을 관찰 합니다.
   11. DAPI 검색 410-530 nm 405 nm 여기 레이저와 하이브리드 검출기를 사용 합니다.
   12. TRITC 검색 565-650 nm에서 561 nm 여기 레이저와 하이브리드 검출기를 사용 합니다.
   13. 400 Hz의 검사 속도 사용 하 여 (400 라인/s) 1024 × 1024 픽셀 해상도.
   14. 소프트웨어 플랫폼을 사용 하 여 이미지를 캡처하십시오.

결과

F₀ , F₁ 세대를 사용 하 여 microsatellite 분석의 결과 근 친 십자가 성공적으로 생산 되었다 보여주었다 (그림 4)⁶. 결과적으로 inbreeding 십자가의 성관계 퀸 즈 실험 건너 식민지 설립의 한 달 이내에 획득 했다. 나머지는 여성 (노동자와 여왕)⁶근 친 십자가에서 모든 자손 (F₂)의 분기 (27.1 ± 8.91 %SD) 남성, 이었다. QTL 매핑 inbreeding 십자가에서 자손을 사용 하 여 보여 남성 십자가 inbreeding 제작한 했다 2 중 2에서 homozygous CSD loci (CSD1 및 그림 5에 CSD2), 여성 (노동자) 동안 inbreeding 십자가에서 생성 했다...

토론

이 문서에서는 근 친 십자가 유도 하 고 emeryi 대개미에 근 친 결혼의 발생을 평가 하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 보여 줍니다. 실험, 십자가 대 한 사용 하는 개인의 유전형은 근 친 십자가 성공한 되도록 필요 합니다. 그러나, 이러한 교차 테스트의 효율성 2 중 남성은 단일 남성만 생산할 수가 있는 필드와 실험실⁶동안 연중 생산 수 명확 하 게 명백한 것입니다. Sib 성관계 퀸 즈 교차점 직후 남성 자손을 생산 하기 시작 합니다. Emeryi 대^6,7. 에 2 중 및 단일 남성 사이 형태학 phenotypic 차이가 관찰 되었다 그러나, 2 중 남성 emeryi 대 거의 변함없이 실패 하지 testes를 개발 합니다. 테스트를 교차 사용 하는 쌍의 유전 relatedness를 테스트 하기 위한 유전자 표시...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
플라스터 파우더	N/A	N/A	어떤 브랜드든 사용할 수 있습니다
. 숯, 활성화, 파우더	Wako	033-02117,037-02115
슬라이드 글라스	N/A	N/A	어떤 브랜드든 사용할 수 있습니다
드라이 크리켓 다이어트	N/A	N/A	어떤 브랜드도 사용할 수 있습니다
. 브라운 슈거	N/A	N/	A 어떤 브랜드든 사용할 수 있습니다
스티렌 사각형 케이스	AS ONE	어떤 크기든	크기는 개미의 수에 따라 다릅니다.
Incbator			어떤 브랜드도 사용할 수 있습니다
알루미늄 블록 욕조 건조 온도계 DTU-1B	TAITEC	0014035-000
1.5mL 하이퍼 마이크로튜브, 투명, 둥근 바닥	WATSON	131-715CS
에탄올 (99.5)	Wako	054-07225
실체 현미경	N/A	N/A	어떤 브랜드든 사용할 수 있습니다
Forseps	DUMONT	0108-5-PO
Chelex 100 sodium form	SIGMA	11139-85-8
Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4	TaKaRa	T9181
Paraformaldehyde	Wako	162-16065
-Cellstain- DAPI 솔루션	Dojindo Molecular Technologies	D523
ABI 3100xl 유전자 분석기	응용 바이오 시스템		자세한 내용은 시공사에 직접 문의하십시오.
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 Leica TCS SP8	Leica		자세한 내용은 건설업체에 직접 문의하십시오.
HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM	Leica		자세한 내용은 생성자에 직접 문의하십시오.
HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER	Leica		자세한 내용은 생성자에 직접 문의하십시오.
라이카 HyDTM	라이카		자세한 내용은 생성자에 직접 문의하십시오.
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		자세한 내용은 생성자에 직접 문의하십시오.