Vitrification 온난 단계 동안 Blastocyst 행동의 객관적인 평가 대 한 형태학 프로토콜

Summary

여기 previtrification 개입 및 후 지구 온난화 복구 동안 blastocyst 수축 하 고 다시 확장의 강도 따라 시간 경과 형태학 프로토콜 선물이. 프로토콜의 응용 프로그램에서 체 외에서 수정 시간 경과 현미경을 장착 가능 하며 최적의 blastocyst vitrification 방법의 개발에 것이 좋습니다.

Abstract

이 문서 blastocyst morphometry blastocyst의 볼륨 vitrification 전후 개별 단계 변경의 정확한 모니터링에 대 한 시간 경과 microphotography에 따라 비 침 투 적인 방법을 설명 합니다. 메서드는 blastocyst 수축 및 다시-확장 다른 사전 및 사후 vitrification 단계를 관찰 하 여 blastocyst cryoprotectants의 다른 농도에 노출의 가장 최적의 타이밍에 대 한 검색에 유용할 수 있습니다. 이 방법론 blastocyst vitrification 프로토콜을 최적화할 수 있습니다. 이 형태학 방법의 유용성의 더 나은 데모, vitrification에 대 한 두 개의 다른 blastocyst 준비 프로토콜 비교; 붕괴 하는 인공 blastocoel를 사용 하 여 하나 고 하나 vitrification 전에이 개입 없이. 두 blastocysts' 볼륨 변화는 시간 경과 microphotography 뒤 사진 편집 소프트웨어 도구에 의해 측정. Previtrification 단계에서 매 20 초 및 이후 지구 온난화 기간에 5 분 마다 측정 가져옵니다. 시간 단위 당 blastocyst 크기의 변화는 라인 다이어그램에 그래픽으로 표시 됩니다. 결과 있는 그대로 blastocyst 먼저 축소 및 다음 천천히 입력 vitrification 액체가 채워진 blastocoel와 blastocoel은 긴 평형 previtrification 단계 보여. 인위적으로 축소 blastocyst 전체 평형 단계 긴축된 단계에 남아 있습니다. Vitrification 단계 동안, 그것은 또한 변경 되지 않습니다의 볼륨. Blastocyst morphometry previtrification 단계 동안 인위적으로 축소 된 blastocysts의 일정 볼륨을 보여줍니다, 때문에 그것은이 단계 짧은 것 같다. 설명된 프로토콜 중와 속도 볼륨 변경, 부분 blastocoel 수축 또는 총 blastocyst의 수의 강도 기준 cryopreservation 후 blastocyst 행동의 많은 추가 비교 매개 변수를 제공합니다. 붕괴, 그리고 총 blastocoel 다시 확장 하는 시간 또는 부 화 하는 시간.

Introduction

체 외에서 수정 프로그램 (IVF)에서 인간의 preimplantation 배아의 cryopreservation 요즘 대부분 IVF 실험실에서 일상적인 연습 이다. 느린 배아 동결 방법 특정 cryoprotectants 및 얼음 nucleation (시드)에서 유도 되었다 때-7 ° c, 배아의 제어 냉각을 컴퓨터 제어 냉동 고의 도입으로 1985 년에 임상으로 사용 되기 시작 합니다 주변 cryoprotective 매체¹. 연속 냉각에 의해 얼음 결정 성장 할 것, 나머지 액체 분수와, 따라서, 탈수의 hyperosmolality를 일으키는 원인이 되 고 배아 세포의 수축 량. -30 ° C 또는-80 ° C, 배아는 저장을 위해 액체 질소에 뛰어들었다 것 이다. 냉각 하는 동안 배아 또는 oocytes 일어나 cryopreservation 프로토콜²를 개선 하는 데 도움이 특별히 적응된 cryomicroscopes에 의해서만 관찰 될 수 있었다. Blastocysts, 높은 볼륨 및 더 액체 포함 된 배아 단계의 그 일³에서 덜 유망한 임상 결과 주었다.

돌파구는 blastocyst의 cryopr....

Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 19 4 월 2016 (0120-204/2016-2 호)에 국가 의료 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다.

1입니다. 현미경 녹화 시스템의 설정

1. 현미경의 난방 격판덮개를 해제 합니다.
2. 어떤 치료를 하기 전에 카메라 장착 거꾸로 현미경 blastocyst의 스냅숏을. 확대는 blastocyst 기록 된 참고 하도록 하십시오.

2. 선택과 Vitrification 위한 Blastocysts의 Prepreparation

1. 유일한 완전히 확장 된 하루 5 또는 하루 6 blastocysts cryopreservation 적어도 몇 안 세포 질량 (ICM) 세포와 응집력 trophectoderm에 대 한 선택 합니다.
2. 축소 된 blastocoel와 레이저 치료 blastocysts에 대 한 주제 구멍 직경 4.3에서 9.4 µ m에 이르는 짧은 레이저 펄스 (0.4-0.7 ms) blastocyst tangentially zona pellucida, 두 개의 인접 한 trophectodermal 셀의 교차점에를 감독. 5 분 동안 완전히 또는 부분적으로 붕괴 blastocyst 허용.
....

Results

데모, 우리는 하나의 previtrification에 한 후 지구 온난화 단계 blastocyst morphodynamics을 보였다. 한 차이 blastocyst의 볼륨에 평형 단계의 끝에와 문화 매체는, 사실, 배아 수축 강도 보여 얼음 결정 화에 대 한 배아 보존의 강도 회복의 시작 부분에.

그것은 비디오 1과 그림 1 에서 발견 될 수, 평형 솔루션에서 그대로 blastocyst 완전히 축소 되지 않았다. blastocoel 부분적 으로만 계약을 하지만 10 분 이내 그것 천천히 다시 확장 크기의 70%에 도달. 이, 반대로 인위적으로 축소 blastocyst는 완전히 비우지는 blastocoel 레이저 치료 후 즉시 하지만 재래식 솔루션에 볼륨 더 (

Discussion

동안 blastocyst morphodynamics의 전후 cryopreservation 또한 실시 될 수 있습니다 유사한 악기와 다른 제조 업체에서 소프트웨어 도구를 사용 하 여 관찰에 대 한 프로토콜. 발생 학에 대 한 조정 시간 경과 시스템 배아 개발의 지속적인 모니터링을 허용 합니다. 이 작품의 목적은 vitrification를 자신의 온난 후 blastocysts의 준비 동안 blastocyst 동작의 정량화를 소개 했다. 이 변경에는 날짜 표시줄에 형태학의 객관적인 측정에 의해 수행 되었다. 이러한 측정의 취득된 결과 수학적으로 분석 하 고 다른 결과와 비교 될 수 있습니다. 설명된 프로토콜에 따라 할 수 있는 매개 변수 중에서 blastocyst의 크기에서 변화, 그것의 안 세포 질량, blastocoel, 또는 zona pellucida 특정 기간 내. 크기의 볼륨으로도 계산 후, 그리고 큰 blastocyst 횡단면, blastocyst 둘레 또는 직경, 표면 영역으로 표시할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
도립 현미경 Eclipse TE2000-U	니콘, 일본	/
Saturn 5 Laser System	Research Instruments, Origio, 덴마크	/
디지털 카메라 DC1	Research Instruments, Origio, 덴마크	/
디지털 카메라 DC2	Research Instruments, Origio, 덴마크	/
Cronus 3.7	Research Instruments, Origio, 덴마크	/	현미경 기록 소프트웨어
6% CO2, 5% O2 바인더가 있는 인큐베이터	, 독일	/
Primo Vision 현미경	Vitrolife, 스웨덴	16600
Primo Vision Capture 소프트웨어	Vitrolife, 스웨덴	16608	타임랩스 녹화 소프트웨어
Adobe Photoshop CS6 확장 소프트웨어	Adobe Systems Incorporated, USA/		비디오 분석 소프트웨어
VirtualDub	Avery Lee	/	비디오 편집 소프트웨어
Microsoft Office Excell	Microsoft, 미국	/	스프레드시트 편집기
PrimoVision 배양 접시	Vitrolife, 스웨덴	16604
G2-plus medium	Vitrolife, 스웨덴	10132	배반포 단계 배아용 배양 배지
인간 혈청 알부민	Vitrolife, 스웨덴	10064
파라핀 오일	Vitrolife, 스웨덴	10029
평형 용액 매체	Irvine Scientific, Ireland	90131
유리화 용액 매체	Irvine Scientific, Ireland	90132
해동 용액 매체	Irvine Scientific, Ireland	90134
희석 용액 매체	Irvine Scientific, Ireland	90135
세척 용액 매체	Irvine Scientific, Ireland	90136
HSV 유리화 빨대	CryoBio System, France	025246, 025249, 025250, 025248
액체 질소	/
극저온 용기 Biosafe 120 MD β	Cryotherm, 독일	229286
극저온 탱크	Cryotherm, 독일
독일 집게
가위	/
피펫	벨기에	ID275/10	직경 275 &마이크로;
m 난모 세포 탈변을 위한 피펫	Vitromed, 독일	V-DEN-135	직경 135 &마이크로; m
피펫터 EZ-Grip	Research Instruments	7-72-2802
디지털 간격 타이머 Assistent	Glaswarenfabrik Karl Hecht	41977010
IBM SPSS Statistics 21	IBM, USA/		통계 분석 소프트웨어
자체 조정 와이어 스트리퍼	Knipex, 독일	1262180