여기 previtrification 개입 및 후 지구 온난화 복구 동안 blastocyst 수축 하 고 다시 확장의 강도 따라 시간 경과 형태학 프로토콜 선물이. 프로토콜의 응용 프로그램에서 체 외에서 수정 시간 경과 현미경을 장착 가능 하며 최적의 blastocyst vitrification 방법의 개발에 것이 좋습니다.
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방법 논문
Vitrification 온난 단계 동안 Blastocyst 행동의 객관적인 평가 대 한 형태학 프로토콜
이 논문에서
요약
초록
이 문서 blastocyst morphometry blastocyst의 볼륨 vitrification 전후 개별 단계 변경의 정확한 모니터링에 대 한 시간 경과 microphotography에 따라 비 침 투 적인 방법을 설명 합니다. 메서드는 blastocyst 수축 및 다시-확장 다른 사전 및 사후 vitrification 단계를 관찰 하 여 blastocyst cryoprotectants의 다른 농도에 노출의 가장 최적의 타이밍에 대 한 검색에 유용할 수 있습니다. 이 방법론 blastocyst vitrification 프로토콜을 최적화할 수 있습니다. 이 형태학 방법의 유용성의 더 나은 데모, vitrification에 대 한 두 개의 다른 blastocyst 준비 프로토콜 비교; 붕괴 하는 인공 blastocoel를 사용 하 여 하나 고 하나 vitrification 전에이 개입 없이. 두 blastocysts' 볼륨 변화는 시간 경과 microphotography 뒤 사진 편집 소프트웨어 도구에 의해 측정. Previtrification 단계에서 매 20 초 및 이후 지구 온난화 기간에 5 분 마다 측정 가져옵니다. 시간 단위 당 blastocyst 크기의 변화는 라인 다이어그램에 그래픽으로 표시 됩니다. 결과 있는 그대로 blastocyst 먼저 축소 및 다음 천천히 입력 vitrification 액체가 채워진 blastocoel와 blastocoel은 긴 평형 previtrification 단계 보여. 인위적으로 축소 blastocyst 전체 평형 단계 긴축된 단계에 남아 있습니다. Vitrification 단계 동안, 그것은 또한 변경 되지 않습니다의 볼륨. Blastocyst morphometry previtrification 단계 동안 인위적으로 축소 된 blastocysts의 일정 볼륨을 보여줍니다, 때문에 그것은이 단계 짧은 것 같다. 설명된 프로토콜 중와 속도 볼륨 변경, 부분 blastocoel 수축 또는 총 blastocyst의 수의 강도 기준 cryopreservation 후 blastocyst 행동의 많은 추가 비교 매개 변수를 제공합니다. 붕괴, 그리고 총 blastocoel 다시 확장 하는 시간 또는 부 화 하는 시간.
서론
체 외에서 수정 프로그램 (IVF)에서 인간의 preimplantation 배아의 cryopreservation 요즘 대부분 IVF 실험실에서 일상적인 연습 이다. 느린 배아 동결 방법 특정 cryoprotectants 및 얼음 nucleation (시드)에서 유도 되었다 때-7 ° c, 배아의 제어 냉각을 컴퓨터 제어 냉동 고의 도입으로 1985 년에 임상으로 사용 되기 시작 합니다 주변 cryoprotective 매체1. 연속 냉각에 의해 얼음 결정 성장 할 것, 나머지 액체 분수와, 따라서, 탈수의 hyperosmolality를 일으키는 원인이 되 고 배아 세포의 수축 량. -30 ° C 또는-80 ° C, 배아는 저장을 위해 액체 질소에 뛰어들었다 것 이다. 냉각 하는 동안 배아 또는 oocytes 일어나 cryopreservation 프로토콜2를 개선 하는 데 도움이 특별히 적응된 cryomicroscopes에 의해서만 관찰 될 수 있었다. Blastocysts, 높은 볼륨 및 더 액체 포함 된 배아 단계의 그 일3에서 덜 유망한 임상 결과 주었다.
돌파구는 blastocyst의 cryopr....
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 메서드는 19 4 월 2016 (0120-204/2016-2 호)에 국가 의료 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 현미경 녹화 시스템의 설정
- 현미경의 난방 격판덮개를 해제 합니다.
- 어떤 치료를 하기 전에 카메라 장착 거꾸로 현미경 blastocyst의 스냅숏을. 확대는 blastocyst 기록 된 참고 하도록 하십시오.
2. 선택과 Vitrification 위한 Blastocysts의 Prepreparation
- 유일한 완전히 확장 된 하루 5 또는 하루 6 blastocysts cryopreservation 적어도 몇 안 세포 질량 (ICM) 세포와 응집력 trophectoderm에 대 한 선택 합니다.
- 축소 된 blastocoel와 레이저 치료 blastocysts에 대 한 주제 구멍 직경 4.3에서 9.4 µ m에 이르는 짧은 레이저 펄스 (0.4-0.7 ms) blastocyst tangentially zona pellucida, 두 개의 인접 한 trophectodermal 셀의 교차점에를 감독. 5 분 동안 완전히 또는 부분적으로 붕괴 blastocyst 허용. ....
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결과
데모, 우리는 하나의 previtrification에 한 후 지구 온난화 단계 blastocyst morphodynamics을 보였다. 한 차이 blastocyst의 볼륨에 평형 단계의 끝에와 문화 매체는, 사실, 배아 수축 강도 보여 얼음 결정 화에 대 한 배아 보존의 강도 회복의 시작 부분에.
그것은 비디오 1과 그림 1 에서 발견 될 수, 평형 솔루션에서 그대로 blastocyst 완전히 축소 되지 않았다. blastocoel 부분적 으로만 계약을 하지만 10 분 이내 그것 천천히 다시 확장 크기의 70%에 도달. 이, 반대로 인위적으로 축소 blastocyst는 완전히 비우지는 blastocoel 레이저 치료 후 즉시 하지만 재래식 솔루션에 볼륨 더 (
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토론
동안 blastocyst morphodynamics의 전후 cryopreservation 또한 실시 될 수 있습니다 유사한 악기와 다른 제조 업체에서 소프트웨어 도구를 사용 하 여 관찰에 대 한 프로토콜. 발생 학에 대 한 조정 시간 경과 시스템 배아 개발의 지속적인 모니터링을 허용 합니다. 이 작품의 목적은 vitrification를 자신의 온난 후 blastocysts의 준비 동안 blastocyst 동작의 정량화를 소개 했다. 이 변경에는 날짜 표시줄에 형태학의 객관적인 측정에 의해 수행 되었다. 이러한 측정의 취득된 결과 수학적으로 분석 하 고 다른 결과와 비교 될 수 있습니다. 설명된 프로토콜에 따라 할 수 있는 매개 변수 중에서 blastocyst의 크기에서 변화, 그것의 안 세포 질량, blastocoel, 또는 zona pellucida 특정 기간 내. 크기의 볼륨으로도 계산 후, 그리고 큰 blastocyst 횡단면, blastocyst 둘레 또는 직경, 표면 영역으로 표시할 수 있습니다.
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품 연구 프로그램 P3-0327 및 연구 프로젝트 J3-7177, 슬로베니아어 연구 재단에 의해 설립 된의 일부입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
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| 디지털 카메라 DC1 | Research Instruments, Origio, 덴마크 | / | |
| 디지털 카메라 DC2 | Research Instruments, Origio, 덴마크 | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, 덴마크 | / | 현미경 기록 소프트웨어 |
| 6% CO2, 5% O2 바인더가 있는 인큐베이터 | , 독일 | / | |
| Primo Vision 현미경 | Vitrolife, 스웨덴 | 16600 | |
| Primo Vision Capture 소프트웨어 | Vitrolife, 스웨덴 | 16608 | 타임랩스 녹화 소프트웨어 |
| Adobe Photoshop CS6 확장 소프트웨어 | Adobe Systems Incorporated, USA/ | 비디오 분석 소프트웨어 | |
| VirtualDub | Avery Lee | / | 비디오 편집 소프트웨어 |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, 미국 | / | 스프레드시트 편집기 |
| PrimoVision 배양 접시 | Vitrolife, 스웨덴 | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, 스웨덴 | 10132 | 배반포 단계 배아용 배양 배지 |
| 인간 혈청 알부민 | Vitrolife, 스웨덴 | 10064 | |
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참고문헌
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of in....
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재인쇄 및 허가
