식물 성장 및 Extremophyte Schrenkiella parvula 의 꽃-딥 변환 Agrobacterium 중재

요약

Agrobacterium 중재 변환 꽃 딥 메서드를 사용 하 여 성공적으로 extremophyte 모델 Schrenkiella parvula의 안정적인 유전자 변형 라인을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 선물이 프로토콜에서 애기 thaliana, 다른 성장 습관을 고려 하 고는 extremophyte의 생리 적 특성에 대 한 수정.

초록

Schrenkiella parvula 는 여러 이온 독성 스트레스를 포함 하 여 다양 한 abiotic 스트레스에 적응 하는 extremophyte입니다. 높은-품질 게놈 자원을 사용할 수 있는도 불구 하 고 식물 환경에 적응 하는 방법을 공부를 강조, 기능 유전체학 모델 값 고 도구 가능한 변환 시스템의 부족에 의해 제한 되어 있다. 이 프로토콜에서 우리는 안정적인 유전자 변형 미 parvula 를 생성 하는 방법을 보고 Agrobacterium 중재 꽃 딥 방법을 사용 하 여 라인. 우리는 A. thaliana 불확정 꽃 습관 등 잎에 높은 epicuticular 왁 스 콘텐츠 S. parvula의 독특한 특성에 대 한 계정에 사용 하는 변환 프로토콜을 수정 합니다. 간단히, S. parvula 씨앗 심기 전에 5 일 동안 4 ° C에서 층 화 되었다. 식물 photoperiod 14 h 빛과 어둠 10 h과는 130 µmol m^-2s^-1 빛의 강도, 22 ° C 24 ° c에서 성장 했다 8 9 주 된 식물 여러 inflorescences 변환에 대 한 선정 됐다. 이러한 inflorescences Agrobacterium tumefaciens GV3101의 pMP90RK 플라스 미드를 들고 침투 솔루션에서 감소 했다. 우리는 꽃 찍기 변환 효율을 높이기 위해 3 ~ 4 주 간격으로 2 라운드를 수행. T1 씨앗 수집 하 고 후보에 대 한 화면 발 변형 라인 전에 방와 컨테이너에 4 주 동안 건조 했다. 그만하 라고 저항 T1 식물에 사용 되었다. 우리는 가양성을 줄이기 위해 2 주 된 식물에서 시작 하는 3 일 간격으로 세 번 그만하 라고 솔루션을 살포. 그만하 라고 드롭 테스트 살아남는 진정한 긍정적인 transformants를 식별 하기 위해 개별 공장에서 수행 되었다. 변환 효율 0.033%, 10000 T1 씨앗 전파 당 3-4 유전자 변형 식물을 양보 했다.

서론

이 프로토콜에서 성장 및 extremophyte 모델 Schrenkiella parvula에 대 한 안정적인 유전자 변형 라인의 설립을 설명합니다. 효율적인 변환 시스템의 가용성은 어떤 다양 한 유전자 모델의 특징 이다. 극한 환경에서 번 창 하는 식물 extremophytes, 식물 환경 스트레스에 적응을 이해 하기 위한 중요 한 리소스 제공 이라고 합니다. Schrenkiella parvula (이전 Thellungiella parvula , Eutrema parvulum) 게놈 자원^1,2,3,,45를 확대와 함께 한 같은 extremophyte 모델입니다. 그러나, 변환 프로토콜 하지 아직 보고 되었습니다 S. parvula 에 대 한 게시 된 연구.

S. parvula 의 게놈 십자화과 (겨자 양배추 가족)에 첫 번째 게시 된 extremophyte 게....

프로토콜

1. 식물 성장

1. 종자 살 균 (선택 사항)
   1. 이중 증 류 물 (ddH₂O) 1 표 백제 50% 준비 또는 비 이온 세제의 2 상품 ( 재료의 표참조) 50 mL 튜브에. 여러 번 솔루션을 혼합 튜브를 반전.
      참고: 그것은 층 류 캐비닛 15 분 동안 UV 살 균된 표면 살 균 씨를 수행 하는 것이 좋습니다.
   2. ~ 100-200 표 백제 솔루션 추가 1.5 mL 튜브에 S. parvula 씨. 철저 하 게 혼합 하 고 튜브를 5 분 동안 앉아 보자.
   3. 튜브에서 표 백제를 제거 하 고 70% 에탄올을 추가. 여러 번 pipetting으로 씨앗을 세척 하 고 에탄올 솔루션을 즉시 제거.
   4. 초과 표 백제 및 에탄올, 제거 하는 소독된 물에 씨앗을 씻어 다음 물을 제거 합니다. 5 ~ 6 배가이 단계를 반복 합니다.
2. 씨앗 층 리
   1. 소독된 물에 씨앗을 담가 그리고 4 ° c.에 5 ~ 7 일 동안 저장 또는, 젖은 토양에 직접 말린된 unsterilized 씨앗을 뿌리 다 하 고 토양 트레이 4 ....

결과

우리는 150 일 이내 T₀ 씨앗의 수확을 가능 하 게 변환 프로토콜을 A. thaliana에서 수정 꽃 딥 방법을 사용 하 여 개발 했다. 그림 1 타임 라인 및 S. parvula 식물 꽃 딥 통해 변화를 실행 하기 위한 최적의 단계를 나타내는 요약을 보여 줍니다. 우리는 변환에 대 한 대상 무대도 발 아 후 60-80 일에 여러 inflorescences에 S. parvula 70 –80 꽃을 가진 식물을 선택. 기존의 오픈 또는 수정 된 꽃 및이 단계에서 siliques의 작은 수 꽃 dip 방법으로 A. tumefaciens 침투 하기 전에 제거 되었다. A. tumefaciens 감염 (그림 2(a) 괄호) 꽃의 낙태 귀착되는. Siliques 꽃 딥 변형.......

토론

식물의 생리 적 상태 변환²⁵의 효율을 크게 영향을 줍니다. 변환에 대 한 건강 하 고 활기찬 식물의 사용 S. parvula에서 성공적인 변환에 대 한 주요 요구 사항입니다. 물 또는 가벼운 스트레스 식물 변환 (그림 1, 센터 패널)에 대 한 이상적인 건강 한 식물에 비해 적은 꽃 있을 것 이다. S. parvula 는 빛의 강도에 성장할 수 있는 보다 작은 130 µmol m^{-2의 -1}하지만 식물 경향이 frailer; 이러한 식물 들이 더 이어질 것 이다 꽃 꽃 찍어 다음 중단. S. parvula 보다 더 높은 속도로 Agrobacterium 담근 꽃을 중단 하는 경향이 있다 A. thaliana. 따라서, 중단된 꽃 A. tumefaciens 침투 솔루션에서는 감소 하는 경우를 최소화 하기 위해 이동 하는.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agar	VWR International, Radnor, PA	90000-762	Bacto 한천 솔디파잉제, BD 진단
B5 비타민	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G1019	Gamborg' s 비타민 용액
건조제	W A Hammond Drierite, Xenia, OH	22005	DRIERITE 6 메쉬
목적지 벡터	표시 TAIR	벡터 : 6531113857	pKGWFS7
Electroporation 큐벳	USA Scientific	9104-5050	Electroporation 큐벳, 둥근 캡, 0.2cm 갭
Electroporator	BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA	1652100	MicroPulser Electroporator
비료 비즈	Osmocote Garden, Marysville, OH	N/A	Osmocote 스마트 릴리스 식물 식품  플라워 & 식물성
젤 추출 키트	iNtRON Biotechnology, Boston, MA	17289	MEGAquick-spin 총 단편 DNA 정제 키트
Gentamicin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G1914-5G	Gentamicin sulfate
Glufosinate-ammonium (11.3%) 제초제 (BASTA)	Bayer environmental science, Montvale, NJ	N / A	FINALE 제초제
Kanamycin	VWR International, Radnor, PA	200004-444	Kanamycin monosulfate
MES	Bioworld, Dublin, OH	41320024-2	MES, Free Acid
MS salt	MP Biomedicals, Santa Anna, CA	092621822	Hoagland의 변형된 기초 염 혼합물
N6-benzylaminopurine (BA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B3274	6-Benzylaminopurine 용액
NaCl	Sigma-Alrich	S7653	염화나트륨
비이온 세제	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	9005-64-5	TWEEN 20
플라스미드 분리 키트	Zymo Research, Irvine, CA	D4036	Zyppy 플라스미드 키트
재조합 효소 믹스 키트	Life Technology	11791-020	Gateway LR Clonase II 효소 믹스
Rifampicin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	R3501-1G	Rifampicin, 분말, ≥ 97 % (HPLC)
쉐이킹 인큐베이터	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	SHKE4450	MaxQ 4450 벤치 탑 궤도 쉐이커
토양 믹스	Sun Gro	SUN239223328CFLP	Sun Gro Metro-Mix 360 재배자 믹스
Spectinomycin	VWR International, Radnor, PA	IC15206705
멸균 50 mL 원추형 튜브	USA Scientific, Ocala, FL	1500-1811	50mL 원뿔형 스크류 캡 튜브, 공중합체, 랙, 멸균
수크로오스	VWR International, Radnor, PA	57-50-1	수크로오스, ACS
계면활성제 용액	Lehle 종자, Round Rock, TX	VIS-02	Silwet L-77
Topoisomerase-based cloning kit	Life Technologies, Carlsbad, CA	K240020	pENTR/D-TOPO 클로닝 키트, One Shot TOP10 Chemically CompetentE. coli
Tryptone	VWR International, Radnor, PA	90000-282	BD Bacto Tryptone, BD Biosciences
효모 추출물	VWR International, Radnor, PA	90000-722	BD Bacto 효모 추출물, BD Biosciences

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