여기, 히스티딘 태그 pyrophosphokinase 효소 정화 및 radiolabelled 기질 그리고 효소 활동 체 외에 대 한 분석 결과를 제품의 얇은 층 크로마토그래피를 이용 하는 방법을 설명 합니다. 효소 활동 분석 결과 모든 키, 뉴클레오티드 있고, 또는 인광 체 전송 반응의 메커니즘 포함 뉴클레오티드 3 인산 염 가수분해에 광범위 하 게 적용 됩니다.
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방법 논문
정화 및 체 외에서 활동 분석 결과 (p) ppGpp Clostridium 남과 어울리지 않 는에서 합성에 대 한
이 논문에서
요약
초록
키 및 pyrophosphokinase 효소 phosphorylated 제품을 기판에 뉴클레오티드 3 인산 염 선구자에서 감마 인산 염 또는 베타-감마 파이 인산 moiety를 전송. 사용 하는 γ-32-P NTP 선구자를 표시 하실 수 있습니다 방사선에 의해 기판 사용률 및 제품 대형의 동시 모니터링. 셀 룰 로스 판에 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 신속한 분리 및 기질과 제품의 민감한 정량화를 허용 한다. 우리는 얇은 층 크로마토그래피 정제 (p) ppGpp 합성의 pyrophosphokinase 활동 분석 결과를 활용 하는 방법을 제시. 이 방법은 주기적인 뉴클레오티드 및 디뉴클레오티드 synthetases의 활동 특성 사용 되었습니다 이전 이며 뉴클레오티드 3 인산 염 유대 hydrolyzes 또는 터미널 전송 하는 모든 효소의 활동을 특성화 하는 데 광범위 하 게 적합 인산 다른 분자를 염 인산 염 기증자 로부터
서론
키 및 pyrophosphokinase (또는 diphospho 키) 효소 기질 분자 뉴클레오티드 3 인산 염 (NTP) 선구자에서 인산 염을 전송. 기판 다른 뉴클레오티드, 아미노산 이나 단백질, 탄수화물, 그리고 지질1포함할 수 있습니다. 효소의 동족 기판 또는 특징이 효소를 유사성에 따라 기판 Bioinformatic 분석 예측 가끔 수 있습니다 하지만 실험 유효성 검사 여전히 필요 합니다. 마찬가지로, 그것의 substrate(s) 및는 그것 catalyzes 형광체 전송 반응 속도 효소의 선호도 및 공동 요인, 억제제, 또는 다른 효소 이펙터의 효과 결정 되어야 합니다 실험적으로. 다른 ATP 소모 효소 세균성 세포질에 존재에 의해 ATP 전조의 소모를 피하기 위해, 양적 활동 분석 실험 순화 된 단백질을 필요로 합니다.
단백질 정화 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 문학2,3에 철저 하 게 적용 되었습니다 했습니다. 히스티딘 태그 6 연속 히스티딘 잔류물에는 N-또는 C-말단 재조합 단백질의 추가 구성 된 금속 친화성 크로마토그래피4,....
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프로토콜
1. 유도할 수 있는 Overexpression 히스티딘 태그 단백질의
- Rsh C. 남과 어울리지 않 는 R20291 genomic DNA에서에서 증폭.
- 높은 중 합 효소를 사용 하 고 제조업체의 지침을 따르십시오.
- C. 남과 어울리지 않는 rsh 뇌관을 사용 하 여 증폭
rsh_F (CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG)와
rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), C 터미널 hexahistidine 태그를 소개 하.
참고: KpnI와 PstI 사이트 뇌관 순서에 잘라 굵게 표시 됩니다. - PMMBneo 벡터 소화 그리고 rsh his6 PCR 제품 Pstl 및 KpnI 제한으로 45 분 동안 37 ° C에 사이트.
- 선형화 벡터와 PCR 파편 agarose 젤 전기 이동 법 및 DNA 젤 추출 키트와 함께 후속 정화를 통해 정화.
- 280 nm의 흡수도 (280)는 벡터 및 증폭 된 PCR 제품을 측정 합니다. 방정식을 사용 하 여 <....
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결과
선물이 Clostridium 남과 어울리지 않는 그것의 효소 활동의 평가에서 (p) ppGpp 합성의 친 화력 정화 하는 방법. 그림 1 에 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 달성 단백질 정화 방법을 보여 줍니다. 이 정화에서 두 번째 차입 (E2) 분수 dialyzed 고 효소 활동 분석 결과 대 한 사용. 그림 2 에 대 한 준비 하 고 얇은 층 크로마토그래피에 의해 pyrophosphotransferase 분석 실험을 수행 하기 위해 필요한 조치를 자세히 설명 합니다. 그림 3 에서는이 실험에서 데이터 적절 한 블랭킹 및 변환 신호 강도의 비율에 quantitated는 어떻게 보여 줍니다. 그림 4A, (p) ppGpp 합성 분석 결과 사.......
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토론
여기 우리가 보고 그의 태그 RSH C. 남과 어울리지 않 는에서 정화 활동 정량화 방사선된 얇은 층 착 색 인쇄기를 사용 하 여에 대 한 방법을 제시 하 고. 이 방법은 이전 C. 남과 어울리지 않는로 (p) ppGpp 합성, 뉴클레오티드 있고, 키 니 아 제 diguanylate 있고 효소와 다른 유기 체11,12 포스 효소의 활동을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. ,,1321. 메서드는 소설, 그것은 많은 유형의 분석 결과, 광범위 하 게 적용 그리고 우리 연구원에서에서 찾을 것입니다 그것의 프레 젠 테이 션 비디오 포맷 도움이 바랍니다.
프로토콜 내에서 가장 중요 한 단계는 단백질 정화 (단계 2.1.3–2.1.......
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공개 사항
저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 NIAID 1K22AI118929-01에 의해 투자 되었다. EBP는 오래 된 판도 대학 노퍽, 버지니아, 미국에서 연구의 사무실에서 여름 연구 친교 프로그램 교부 금에 의해 지원 되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <>히스티딘 태그 단백질의 유도성 과발현 | |||
| 푸전 중합효소 | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA 겔 추출 키트 | Qiagen | 20021 | |
| KpnI 제한 효소 | NEB | R0142S | |
| PstI 제한 효소 | NEB | R0140S | |
| T4 DNA 리가제 | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-알파 유능 E. 대장균 ( 고효율) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) 유능한 E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 원심분리기 with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti-Microcentrifuge | ||
| with D3024/D3024R rotor | Scilogex-MaxQ | ||
| SHKE6000 인큐베이터 | Thermo | Scientific-Ultrasonic | |
| processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 투석 장치 (MWCO: 20-kD) | 스펙트럼 | G235033 | |
| Mini-Protean 전기영동 세포 | BioRad | 1658004 | |
| 박층 크로마토그래피에 의한 단백질 활성 분석 | |||
| 박층 크로마토그래피(TLC) 개발 탱크 | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| 폴리에틸렌 (PEI) - 셀룰로오스 플레이트 (20cm x 20cm, 100 μ m 두께) 폴리 에스테르 지원 | 시그마 - 알드리치 | Z122882 - 25EA | |
| ATP, [&감마; -32P] - 3000 Ci / mmol 10mCi / ml 리드, 100 μ Ci | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5'-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage 형광체 스크린 | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E 트리튬 스크린 | |
| Storm 860 인광체 분석기 | GE Healthcare 생명과학 | - |
참고문헌
- Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6(2005).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
- Arnau, J., Lauritzen, C., ....
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재인쇄 및 허가
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