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방법 논문

CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 선택한 Proviral 통합 사이트와 에이즈-1 감염에 대 한 Jurkat 기자 모델을 생성 하

9.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58572

⸱

2018년 11월 14일

 ,  ,  , 
1Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, 2Department of Anesthesiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 3German Center for Infection Research (DZIF)

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 선택 된 게놈 사이트에 proviral 통합 정리 에이즈-1 감염에 대 한 새로운 체 외 모델의 생성에 대 한 게놈 엔지니어링 워크플로우를 제시. 에이즈-파생 된 기자 들의 CRISPR Cas9 중재, 사이트별 게놈 조작에 의해 촉진 된다. 단일 셀 클론 세대, 심사, 그리고 올바른 대상 확인에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다.

초록

인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)는 재발 사이트 및 게놈 핫스팟 호스트 세포 게놈으로 비 무작위로 proviral DNA를 통합합니다. 여기 우리가 선택한 게놈 통합 사이트 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 기술을 사용 하 여 HIV 감염에 대 한 소설 체 외 모델의 생성에 대 한 자세한 프로토콜 제시. 이 방법으로 선택의 기자 시퀀스 수 있습니다 통합할 수는 타겟, 선택한 genomic 소재 시, 임상 관련 통합 사이트를 반영.

프로토콜, HIV 파생 기자의 디자인과 대상 사이트 및 gRNA 순서의 선택 설명 합니다. 상 동 팔 대상 벡터 생성 이며 Jurkat T 세포로 페. 기자 시퀀스 선택 된 게놈 사이트에 대상 사이트에 Cas9 중재 이중 가닥 브레이크에 의해 촉진 된 동종 재결합 대상 이다. 단일 셀 클론 생성 되며 cytometry 및 PCR에 의해 이벤트 대상에 대 한 상영. 선택 된 클론 확장 다음, 그리고 PCR, 시퀀싱, 그리고 남부 blotting에 의해 확인 된다 정확한 타겟팅. CRISPR Cas9 중재 하는 유전자 공학의 잠재적인 대상에서 이벤트는 분석 했다.

이 프로토콜, 소설 세포 배양 시스템을 사용 하 여 임상 관련 통합 사이트에서 그 모델 HIV 감염을 생성할 수 있습니다. 단일 세포 클론의 생성 및 올바른 기자 시퀀스 통합의 확인은 시간이 걸리는, 결과 클론 라인 proviral 통합 사이트 선택 기능 분석에 강력한 도구입니다.

서론

감염 시 호스트 게놈으로 통합 proviral DNA의 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 수명 주기에서 중요 한 단계입니다. 통합에 따라 HIV 메모리 CD4 + T 세포 같은 긴 CD4 + T 세포 부분 집합에서 대기 시간을 설정 하 여 유지 합니다. 에이즈 통합 비 무작위1,2나타납니다. Recurrently 통합 proviral dna 게놈 핫스팟의 숫자 심하게만 성으로 감염 된 개인2,,34 통합 사이트의 시퀀싱을 통해 여러 연구에서 발견 되었습니다. 5,6,,78. 흥미롭게도, 이러한 통합 사이트의 일부에 같은 로커 스 재발 사이트에서 통합 클론 확장1미칠 긍정적으로 생각을 이끌어 감염 된 세포의 큰 분수에서 발견 되었다.

재발 성 통합 사이트의 중요성에 대 한 우리의 이해를 사전에 proviral 통합 사이트 선택 탐구 해야 합니다. 그러나 여러 가지 기술적인 측면 공부 에이즈 통합을 방해 하는, 선택과 결과 사이트. JLat 셀 라인 임상 관련 재발 통합 사이트9를 반영 하지 않습니다 처럼 광범위 하 게 HIV 대기 시간에 대 한 셀 문화 모델 사용. 기본 환자 파생 셀에 대 한 연구 한 한편으로, 통합 사이트 프리의 설명 연속 있지만 기능 분석에 대 한 허용 하지 않습니다. 우리의 지식을 하려면, 아무 적절 한 실험 모델은 선택 된 임상 관련 통합 사이트를 분석 하는 기능을 사용할 수 있습니다.

여기 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 기술을 사용 하 여 HIV 감염에 대 한 새로운 모델을 생성 하는 자세한 워크플로 선물이. 여기에 설명 된 워크플로 HIV 감염, 선택한 통합 사이트에서 genomically 통합된 proviral 기자를 들고 모델 T 세포 유래 기자 셀 라인을 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그들은 따라서 proviral 통합 사이트 에이즈 생물학 영향을 미칠 수 어떻게는 provirus 다른 치료 전략 (예: 대기 시간 역전 에이전트에서, inducibility)에 응답 하는 방법을 탐구 하는 새로운 도구로 봉사는. 우리의 방법은 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링, 기자는 통합에 동종 재결합 하 여 시퀀스는 대상 사이트에서 Cas9 nuclease 유도 이중 가닥 브레이크에 의해 촉진 된의 장점을 사용 합니다. 통합에 대 한 대상 사이트는 HIV에 감염 된 개인과 Cas9 중재 게놈 엔지니어링에 대 한 적합 한 PAM 모티프의 존재에 대 한 연구에서 설명된 재발 통합 사이트에 근접에 따라 선택 됩니다.

우리의 훌륭한 결과에서 우리는 BACH2 유전자 소재 시는 BTB와 CNC 상 동 transcriptional 레 귤 레이 터 2에 대 한 코드에 집중 했다. 항 레트로 바이러스 치료에만 성으로 HIV 감염 된 개인, BACH2 통합된 HIV-1 시퀀스3,6,7,,810의 농축을 보여주는 loci 중 하나입니다. 우리는 우리 BACH2 intron 5에서에서 두 개의 특정 사이트를 대상으로 HIV 1 파생 긴 단말기 반복 (LTR), tdTomato 코딩 시퀀스, 소 성장 호르몬 (BGH) polyadenylation 신호 (PA)의 구성 된 최소한의 HIV 파생 기자를 선택 했습니다. 제시 프로토콜 Jurkat 세포 인간의 CD4 + T 세포에서 파생 된 현 탁 액 셀 라인, 하지만 다른 셀 라인을 사용할 수 있습니다, 적절 하 게 적응 하는 프로토콜 최적화 되어 있습니다. 선물이 다양 한 대상 사이트, 대상 상 동 팔, CRISPR-Cas9-중재 선택한 게놈 사이트, 생성 및 클론 라인의 선택으로 취재의 대상으로 하 고 포괄적인 벡터의 건설에 대 한 자세한 워크플로 확인 새로 생성 된, 대상 기자 셀 라인의.

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프로토콜

1. 게놈 엔지니어링 및 벡터 (tv) 디자인을 타겟팅에 대 한 전략을 타겟팅

참고: 유전자 공학의 첫 번째 단계는 선택 및 필요한 도구 CRISPR Cas9 중재 하는 대상에 대 한 포함 됩니다. 게놈 통합 사이트 로커 스의 선택, 타겟팅, 셀 형식의 선택 그리고 디자인의 통합에 대 한 HIV 파생 기자가이 단계를 선행 한다. 이 프로토콜은 Jurkat 대상 세포로 HIV-LTR_tdTomato_BGH-PA 최소한의 취재의 대상으로 설명 합니다. CRISPR-Cas9-기반 타겟팅, 세대, 심사 및 검증을 위한 클론 선의 워크플로의 순서도 그림 1에 묘사 된다. 설명된 대상 전략 S. pyogenes Cas9를 사용 하 여 선택한 통합 사이트에서 gRNA 감독 dsDNA 나누기 생성 하 (SpCas9). 기자 제공 하는 비 오는지 대상 벡터 (tv) 소위 5'과 3' 상 동 팔 (HA)11에 의해 형벌 기자 시퀀스를 포함 하 여 동종 재결합을 통해 선택한 genomic 소재 시에 다음 타겟입니다.

  1. 타겟된 로커 스, gRNA, 및 벡터 디자인 대상의 선택
    1. 개별 과학 질문에 따라 타겟이 될 thegenomic 소재 시에 선택 합니다. 에이즈의 재발 통합 사이트의 게시 된 목록에 환자에서 다른 발견 사용 연구2,3,,45,6,7,8 로 지침 서입니다. 실리콘 추출 대상된 ()의 순서는 완전 한 유전자 또는 genomic 순서의 적어도 5 kb 원하는 genomic 소재 시 게놈 시퀀스 UCSC 게놈 브라우저 (http:// genome.edu.ucsc.edu)를 사용 하 여.
    2. 선택 가이드 (gRNAs) 20의 RNAs E-선명 webtool (http://www.e-crisp.org)를 사용 하 여 선택한 genomic 소재 시의 대상에 대 한 nt.
      1. 유기 체로 "호모 사피엔스 GRCh38"를 선택 합니다. 취재 단계 1.1.1에서에서 추출 원하는 genomic 소재 시 게놈 시퀀스의 입력 2000 혈압.
      2. 중간 응용 프로그램 설정 (모든 팸, 어떤 5' 기본, 오프-대상 용납 불일치, 및 introns/CPG 섬 제외)를 사용 하 여 gRNA 검색을 시작 합니다. 가능한 gRNA 디자인 목록이 표시 됩니다, 특이성 그리고 효율성에 대 한 점수를 낮은 높은 순위.
      3. 선호 특이성 그리고 효율성에 대 한 높은 점수를 표시 하 고 타겟이 될 원하는 genomic 소재 시에 최대한 가까이 gRNA를 선택 합니다.
        참고: 원하는 genomic 소재 시에 근접 및 특정 하 고 효율적인 gRNA의 디자인 사이 타협 찾을 수 있다.
    3. GRNA 바인딩 사이트의 고유성에 대 한 확인 NCBI 폭발 브라우저 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)를 사용 하 여 참조 게놈에 대 한 선택한 gRNA 시퀀스를 폭발.
      1. 게놈으로 "인간"을 선택 합니다. 쿼리 시퀀스로 gRNA 시퀀스를 입력 합니다. "매우 비슷한 시퀀스" 선택 (megablast) 프로그램으로. GRNA 시퀀스 고유한 있는지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 선택 다른 gRNA 단계 1.1.2.3과 폭발에서 다시.
    4. 일단 gRNA 시퀀스를 선택 따라 5'과 3' 하 단계 1.1.1에서에서 추출한 게놈 시퀀스에서 철에 1000 bp 업스트림과 다운스트림 gRNA 시퀀스를 선택 합니다.
      참고: 는 gRNAs 선택한 게놈 통합 사이트 로커 스에 일치 해야 하 고 protospacer 인접 한 모티브에 인접 한 위치 (팸; 예를 들어, SpCas9에 대 한 NGG) (그림 2a). Tv 5'과 3'가 있는 기자 시퀀스를 포함 되어 있습니다. 업스트림 및 다운스트림 gRNA 시퀀스11의 커버 1000 bp를 있다. 전체 gRNA 시퀀스는 HA에 포함 되지 해야 합니다. 최대 5 중첩 nt는 허용 (그림 2a).
  2. GRNA 및 벡터를 타겟팅의 세대
    참고: 벡터 구성표, 그림 2b참조.
    1. SpCas9와 gRNA의 표현에 대 한 벡터를 생성 하는 SpCas9와 단일 가이드 RNA (sgRNA) 표현 될 수 있다 동시에 중추로 서 pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9를 사용 합니다. 등뼈에 gRNA 시퀀스를 복제 하려면 BbsI 제한 사이트12를 사용 합니다.
    2. Tv를 생성 하려면 백본 (예:, pMK 또는 cDNA3.1)로 높은 사본 플라스 미드를 선택 합니다.
      1. 첫째, 기자를 조립 (이 프로토콜에서: LTR_tdTomato_BGH PA) 깁슨 어셈블리 clong에 의해 구성 등뼈로13 복제 상업 어셈블리를 사용 하 여 키트, 그리고 5'과 3' 측면에 서는 금지 사이트 소개 (예:, 5' 3'과 PacI SmaI) 이후 제한 소화는가의 복제에 대 한.
      2. 타겟이 될 셀 타입의 게놈 DNA (gDNA)에서 단계 1.1.4에서에서 선택한 HA 조각의 1000 bp를 증폭 (이 프로토콜: Jurkat 세포) 활동 교정와 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 ( 표 1 및 2 PCR 재료에 대 한 참조 및 사이클링 조건). 그런 다음, 기자 측면에 서는 각 하 (PacI에 5' 하 양 끝에 3' 양쪽에 HA SmaI)의 5'과 3' 끝에 제한 사이트 소개.
      3. 순차적으로 복제 구문 백본14,15복제 제한 효소에 의해 이미 포함 하는 (단계 1.2.2.1에서에서 생성) 기자로 있다. 첫째, 5' 하에 복제 다음에 3' HA 복제 PacI 제한 사이트를 사용 하 여 SmaI 제한 사이트를 사용 하 여.
        참고: Tv 백본 추가 형광 기자 있으면 원치 않는 백본 통합 cytometry에 의해 평가 될 수 있다 (3.2.2, 3.2.3 단계 참조). Tv 백본 아무 형광 기자 있으면 백본 통합 평가 해야 PCR를 사용 하 여 (단계 3.2.8 참조).

figure-protocol-1
그림 1: CRISPR Cas9 중재 하는 대상으로, 생성 및 다양 한 클론 기자에 대 한 워크플로 정의 통합 사이트 선. (A) 대상 벡터 생성 및 transduce 대상 벡터와 Cas9/gRNA 식 플라스 미드 Jurkat T 세포. (B) 리치 transfected 세포 72 h 게시물 transfection FACS에 의해 (C) 하자 셀 10 ~ 14 일에 대 한 성장를 대상으로 PCR에 의해 이벤트의 발생을 확인 하 고 cytometry 흐름. (D) 생성 희석 하 고 클론을 제한 하 여 단일 세포 클론 3 주 동안 성장. (E)는 PCR에 의해 올바른 대상에 대 한 클론 화면 하 고 96 잘 형식에서 cytometry 흐름. 선택 된 클론 확장 합니다. (F) 남쪽 오 점, PCR 및 시퀀싱, 및 Cas9 endonuclease 활동의 대상에서 이벤트의 분석에 의해 선택 된 클론에서 타겟팅 올바른 확인 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-protocol-2
그림 2: 전략 및 벡터를 대상으로. (한) gRNA 그리고 상 동 팔의 선택. 20 nt gRNA 선택한 게놈 대상 사이트에 동종 이며 무기는 gRNA의 다운스트림 1000 bp까지-보완 하 고 gRNA 시퀀스를 포함 하지 않아야 PAM. 상 동에 인접 한 위치. (b) gRNA/Cas9 벡터와 벡터를 타겟팅의 설계도. 5'과 3' 상 동 팔에 의해 형벌 선택한 기자 시퀀스 대상 벡터에 의하여 이루어져 있다. GRNA/Cas9 벡터 pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 백본 기반으로 합니다. (c) 동종 재결합 하 여 타겟팅의 회로도. 대상 벡터 및 guideRNA/Cas9 벡터 Jurkat 세포로 페는. Cas9 중재 게놈 대상 사이트에서 이중 가닥 휴식 (표시 *) 동종 재결합 기자 시퀀스 게놈 대상 현장으로의 통합을 용이 하 게 하 고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. CRISPR-Cas9-기반 Jurkat 세포의 대상으로

  1. Jurkat 세포의 transfection
    1. transfection, 플레이트 1.25 x 106 Jurkat T 이전 24 시간 10% (v/v) 송아지 태아 혈 청 (FCS) 및 4 m m L-글루타민 [라고도 "RPMI w.o. 항생제 (AB)"] 6 음 셀 문화 접시의 당 보충 RPMI 1640의 2.5 mL에 세포. 단일 대상 실험에 대 한 하나의 완전 한 6-잘 접시 준비 (예:, 6 우물 각각 세포 현 탁 액의 2.5 mL).
    2. 다음 날, 공동 원형 tv와 pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/gRNA Jurkat 세포의 transfection 시 약 관련 된을 사용 하 여 셀 transfect.
      1. 추가 원형 tv의 2 µ g와 2 µ g pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/gRNA 잘 당의 상업 RPMI 매체의 250 µ L에 감소 된 혈 청 농도 transfection (50% 감소 된 혈 청 RPMI)에 대 한 최적화 된 반응 관에 잘 혼합.
      2. 튜브의 벽을 건드리지 않고 DNA/매체에 천천히 transfection 시 약의 12 µ L를 추가 하 고 소용돌이. 혼합물이 15 분 동안 품 어 및 셀의 한 잘에 dropwise 추가 하자. 37 ° C, 5% CO2에서 셀을 품 어.
        참고: Transfection 반응의 준비 확장할 수 있습니다. 매체 변화는 transfection 후 필요 합니다.
  2. 농축 transfected 셀 형광 활성화 (FACS) 정렬
    1. 72 h 후 transfection transfected 세포 그들, 계산 수영장과 FACS에 의해 농축에 대 한 준비. 4 분 50 mL 원뿔 튜브, g 및 실 온 (RT) x 300에서 원심 분리기에 있는 세포를 수집, 셀 PBS에 한 번 씻고, 다시 원심, 1 x 10






















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결과

대표적인 실험에서 LTR, tdTomato 코딩 순서, 및17의 BACH2 유전자 intron 5 두 loci polyA 신호 시퀀스의 구성 된 최소한의 HIV-1 파생 기자를 대상으로 선택 했습니다. 대상에 대 한 loci HIV 감염 환자2,,45,6, 기본 T 세포에 다른 연구에서 발견 된 재발 통합 사이트에 근접에 따라 선정 됐다 7,8 과 팸 모티브 NGG 더블-스트랜드 나누기의 Cas9 중재 유도에 필요한 존재. 대상 벡터 생성 되었고 설명된 프로토콜에 따라 페. T...

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토론

여기, 우리가 선택한 proviral 통합 사이트 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 적용 HIV 1 파생 Jurkat 기자 모델을 생성 하는 프로토콜을 설명 합니다.

프로토콜의 몇 가지 포인트는 계획 단계에서 주의 필요합니다. 첫째, 타겟이 될 장소 선택 해야 신중 하 게, 일부 loci 대상에 다른 사람 보다 쉽게 될 수 있습니다 (예:, 지역 및 대상의 염색 질 상태에 따라 자체 순서). 반복 시퀀스 대상 벡터에 복제 어렵다 고 게놈 내에서 고유 자주 없습니다. 억압 적인 chromatin의 영역은 더 CRISPR-Cas9 시스템19,20대상입니다.

둘째, gRNA의 CRISPR Cas9 중재 하는 대상에 대 한 결정적 이다. 대표적인 통합 사이트와 HIV 감염에 대 한 모델을 생성 하기 위해 하나...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리 기술 지원 Britta Weseloh와 베티 아벨 감사합니다. 우리 또한 감사 아르네 두 제 다우와 Jana Hennesen (교류 cytometry 기술 플랫폼, 하인리히 Pette Institut) 기술 지원.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9Addgene42230벡터 SpCas9 및 gRNA pMK
GeneArt클로닝을 위한 포유류 발현 벡터
cDNA3.1InvitrogenV79020클로닝을 위한 포유류 발현 벡터
BbsINew England BiolabsR0539S제한 효소
NEBuilder Hifi DNA 어셈블리 클로닝 키트New England BiolabsE5520S타겟 벡터 생성에 사용되는 어셈블리 클로닝 키트
TaqPlus Precision PCR SystemAgilent Technologies600210DNA 중합효소(교정 활성) 상동성 암의 증폭(1.2.2.2단계), 통합 부위 및 리포터 염기서열 검증(3.3.3 및 3.3.5단계), 서던 블롯에 대한 게놈 프로브 생성(3.4.1.5단계) 및 off-target 이벤트 분석에 사용됩니다. (단계 3.5.4)
96웰 조직 배양 플레이트(둥근 바닥)TPP92097희석 도금용 조직 배양 플레이트
Phusion High-Fidelity DNA 중합효소New England BiolabsM0530 LDNA 중합효소, 표적 이벤트 검출(2.4.2단계) 및 서던 블롯에 대한 리포터 특이적 프로브 생성에 사용(3.4.1.4단계)
디메틸 설폭사이드(DMSO)Sigma-AldrichD9170디메틸 설폭시드 PCR 첨가제
염화마그네슘(MgCl2) 용액New England BiolabsB9021SPCR로서의 MgCl2 용액
첨가제 데옥시뉴클레오티드(dNTP) 용액 혼합물New England BiolabsN0447SdNTP 혼합물과 PCR 반응에 대한 각 nt당 10mM
5PRIME HotMasterMix5PRIME2200400즉시 사용 가능한 PCR 혼합물(단계 3.2.11)
QIAamp DNA 혈액 미니 키트Qiagen51106DNA 분리 및 정제 키트
QIAquick PCR 정제 키트Qiagen28106PCR 정제 키트
RPMI 1640(글루타민 제외) LonzaBE12-167F세포 배양 배지
태아 혈청 남아프리카 공화국 ChargePAN BiotechP123002배양 배지 보충제
L-글루타민BiochromK 0282세포 배양 배지 보충제
페니실린/스트렙토마이신 10.000 U/mL/ 10.000 &마이크로; g/mLBiochromA 2212세포 배양 배지 보충제
Gibco Opti-MEM 저감 혈청 배지Thermo Fisher Scientific31985062세포 배양 배지 transfection에 최적화된 저혈청 농도
TransIT-JurkatMirus BioMIR2125transfection 시약
phorbol 12-myristate 13-acetateSigma-AldrichP8139-1MG세포 배양 시약
IonomycinSigma-AldrichI0634-1MG세포 배양 시약
주사기 구동 필터 장치, PES 멤브레인, 0,22 &마이크로; m 멸균 여과용MillexSLGP033RB
Heracell 150i 인큐베이터Thermo Fisher Scientific51026280 조직 배양 인큐베이터
Amershan Hybond-N+GE HealthcareRPN1520BDNA 및 RNA 블로팅용 양전하를 띤 나일론 멤브레인
Stratalinker 1800 Stratagene400072UV crosslinker
High Prime무작위올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 방사성 dCTP로 DNA를 라벨링하기 위한11585592001
, illustra ProbeQuant G-50 마이크로 컬럼GE Healthcare28-9034-08라벨링된 DNA 정제를 위한 크로마토그래피 스핀 컬럼
, 세포 필터 장치Roche 키트

참고문헌

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