CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 선택한 Proviral 통합 사이트와 에이즈-1 감염에 대 한 Jurkat 기자 모델을 생성 하

Julia K. Bialek; Thomas Walther; Joachim Hauber; Ulrike C. Lange

doi:10.3791/58572

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방법 논문

CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 선택한 Proviral 통합 사이트와 에이즈-1 감염에 대 한 Jurkat 기자 모델을 생성 하

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DOI:

10.3791/58572

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2018년 11월 14일

Julia K. Bialek^*¹^,² , Thomas Walther^*¹ , Joachim Hauber¹^,³ , Ulrike C. Lange¹^,²^,³

¹Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, ²Department of Anesthesiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, ³German Center for Infection Research (DZIF)

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 선택 된 게놈 사이트에 proviral 통합 정리 에이즈-1 감염에 대 한 새로운 체 외 모델의 생성에 대 한 게놈 엔지니어링 워크플로우를 제시. 에이즈-파생 된 기자 들의 CRISPR Cas9 중재, 사이트별 게놈 조작에 의해 촉진 된다. 단일 셀 클론 세대, 심사, 그리고 올바른 대상 확인에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다.

초록

인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)는 재발 사이트 및 게놈 핫스팟 호스트 세포 게놈으로 비 무작위로 proviral DNA를 통합합니다. 여기 우리가 선택한 게놈 통합 사이트 CRISPR-Cas9-기반 게놈 엔지니어링 기술을 사용 하 여 HIV 감염에 대 한 소설 체 외 모델의 생성에 대 한 자세한 프로토콜 제시. 이 방법으로 선택의 기자 시퀀스 수 있습니다 통합할 수는 타겟, 선택한 genomic 소재 시, 임상 관련 통합 사이트를 반영.

프로토콜, HIV 파생 기자의 디자인과 대상 사이트 및 gRNA 순서의 선택 설명 합니다. 상 동 팔 대상 벡터 생성 이며 Jurkat T 세포로 페. 기자 시퀀스 선택 된 게놈 사이트에 대상 사이트에 Cas9 중재 이중 가닥 브레이크에 의해 촉진 된 동종 재결합 대상 이다. 단일 셀 클론 생성 되며 cytometry 및 PCR에 의해 이벤트 대상에 대 한 상영. 선택 된 클론 확장 다음, 그리고 PCR, 시퀀싱, 그리고 남부 blotting에 의해 확인 된다 정확한 타겟팅. CRISPR Cas9 중재 하는 유전자 공학의 잠재적인 대상에서 이벤트는 분석 했다.

이 프로토콜, 소설 세포 배양 시스템을 사용 하 여 임상 관련 통합 사이트에서 그 모델 HIV 감염을 생성할 수 있습니다. 단일 세포 클론의 생성 및 올바른 기자 시퀀스 통합의 확인은 시간이 걸리는, 결과 클론 라인 proviral 통합 사이트 선택 기능 분석에 강력한 도구입니다.

서론

감염 시 호스트 게놈으로 통합 proviral DNA의 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 수명 주기에서 중요 한 단계입니다. 통합에 따라 HIV 메모리 CD4 + T 세포 같은 긴 CD4 + T 세포 부분 집합에서 대기 시간을 설정 하 여 유지 합니다. 에이즈 통합 비 무작위¹^,²나타납니다. Recurrently 통합 proviral dna 게놈 핫스팟의 숫자 심하게만 성으로 감염 된 개인²^,^,³⁴ ^{통합 사이트의 시퀀싱을 통해 여러 연구에서 발견 되었습니다.}⁵^,⁶^,^,⁷⁸. 흥미롭게도, 이러한 통합 사이트의 일부에 같은 로커 스 재발 사이트에서 통합 클론 확장¹미칠 긍정적으로 생각을 이끌어 감염 된 세포의 큰 분수에서 발견 되었다....