르니포름 선충 저항을 위한 면 유전자형 검열

로틸렌출루스 르니포르니스 (린포드와 올리베이라) 일반적으로 레니폼 선충으로 불리며, 미국 남동부 의 토양에 존재하는 주요 기생 선충 종 중하나이다 1,^2,3. 선충은 의무, 앉아있는 반 내분체는 그것의 수명 주기를 완료하기 위하여 호스트식물을 요구합니다 2,^4. Vermiform preadult 여성 선충은 비석^2,3에공급 사이트를 확립하기 위해 숙주 루트 시스템을 관통합니다. 선충이 공급되고 성숙함에 따라 숙주 뿌리 외부에 남아있는 후부 부분은 계란 생산 시 부풀어 오르며특징적인 신장 모양을 형성합니다 (그림 1). 로틸렌출루스 레니포르는 면 4를 포함하여 300종 이상의 식물종의 뿌리계통을 공급할 수 있다. 업랜드코튼(Gossypium hirsutum L.)은 미국 남동부에서 널리 재배되고 있지만 R이 부족합니다. 레니포름 내성 품종은 선충 관리2,^3을방해합니다. 비숙주 작물 종에 대한 네마티드 처리 및 회전과 같은 관리 전략은 토양 R을 감소시키는 데 사용되어 왔다. 레니포름 인구 밀도^5,6,그러나 종자 면 수율 손실은 일반적으로 1에서 5 %^2까지다양할 수 있습니다. R의 증상 . 르니포르니스 감염에는 식물 기절, 억제된 뿌리 성장, 영양 결핍, 과일낙태 및 지연된 성숙도 2가 포함될 수 있습니다. 그러나, 현상은 필드를 통해 현상의 균일성 때문에 명백하지 않을 수 있습니다; 따라서 R을 평가하는 접근 방식. 레니포름 감염은 내성 고지대 면화 품종을 식별하고 개발하는 데 필요합니다. R의 평가 . 식물이 감염의 증상을 보일수 있더라도 감염된 루트 시스템이 정상으로 나타날 수 있기 때문에 면화의 reniformis 저항은 어려운 7로 간주됩니다⁸.

R.식별을 위해서는 효과적인 선충 스크리닝 프로토콜이 필요합니다. 면 세균 컬렉션에서 reniformis 저항하는 착오, 및 이 착오에 대한 저항 유전학의 측정을 위해. 이러한 프로토콜은 고지대 면화에 대한 저항성 유전자의 전달에 도움이 될 것이다. 다양한생물학적 분석 방법이 R. 면 8,^9,10,^{11,12,13,14,15의} 레니포르마 감염 . 일반적으로 R. 식별에 두 가지 주요 접근 법이 사용되었습니다. 레니포르스 내성 면 유전형. 가장 자주 사용되는 접근 방식은 감염된 식물 이나 토양 에서 계란 및 / 또는 vermiform 선충^을추출 하는 포함 8,^11,12,14,15. 이 접근법에 대한 일반적인 방법은 별도의 냄비에 개별 면화 유전형에 대한 씨앗을 심는 것을 포함하며, 묘목이 7 일에서 14 일 동안 발달 할 수 있게하고, R의 vermiform 단계의 혼합물을 추가하여 묘목을 접종합니다. 토양에 reniformis, 선충이 30~60일 동안 루트 시스템을 감염시킬 수 있도록 한다. 다음으로, vermiform 선충 및 계란각 식물의 감염 된 루트 시스템에서 추출 또는 화분 토양에서. 추출된 선충 또는 계란의 수는 저항하는 유전형을 확인하기 위하여 대조군 유전자형과 비교되는 인구 밀도 및 재생 비율을 추정하기 위하여 결정됩니다.

여기서 설명한 바와 같이, 다른 접근법은, 뿌리를 기생시키는 여성 선충의 수를 결정하기 위해 선충에 감염된 면화 뿌리 시스템을 현미경으로 검사하는 것을 포함한다^10,16. 다른 접근법과 마찬가지로 면 유전자형은 별도의 냄비에 심고 심은 후 약 7 일 후에 vermiform 선충으로 접종됩니다. 접종 후 30 일 이내에 뿌리 시스템은 개별 식물에서 제거되고 토양은 뿌리에서 헹구집니다. 다음으로, 뿌리 시스템에 부착된 선충은 붉은 색소로 염색되고, 뿌리는 현미경으로 검사되어 내성 면 유전자형을 가진 감염 부위의 수를 결정한다(그램당 선충의 수에 기초하여 확인) 의 뿌리)에 비해 취약 제어¹⁶. 이러한 제2 접근법은 평가에 필요한 일수를 줄이고 단일 실험에서 평가된 개별 유전자형의 수를 증가시킴으로써 처리량 증가의 장점이 있다. 인구 밀도 또는 재생률을 평가하는 선별 방법론은 감염 징후의 시각적 관찰에 기초한 방법보다 종종 더 많은 시간이 소요되는^{경우가 많다}7. 그러나, 이 접근법의 한 가지 제한은 계란 생산에 의해 결정된 선충 재생을 방해하는 숙주 식물 저항이 평가되지 않는다는^것이다13.

R. 에대한 스크리닝 프로토콜. 레니포르니스 저항은 종종 평가⁷ 동안 루트 시스템을 파괴하고 폐기되는 식물 촬영을 포함한다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 종자 생산을 위한 식물의 회수를 허용하는 식물번식의 방법이 개발되었다(18). 선충 평가를 위한 뿌리 시스템의 제거 후, 식물 싹은 뿌리 시스템이 재성장할 수 있도록 포팅 토양에 심어진다. 이 메서드에는 대부분의 R. 르니포르니스 스크리닝 프로토콜. 식물 번식의 간단하고 빠른 방법은 R. 자손의 회복이 다음 세대에 내성 유전형을 사전에 필요한 르니 포르 니스 내성 고원 면 품종.

르니포름 선충 저항을 위한 면 유전자형의 대규모 스크리닝을 위한 프로토콜이 제시된다. 목표는 내성 고지대 면품종의 사육을 돕기 위해 선충 저항에 대한 면 사육 인구를 평가하는 간단하고 신속한 비파괴 선별 방법을 개발하는 것입니다. 이 프로토콜을 사용하여, 데이터는 전형적으로 35 일 안에 장악되고, 단 하나 실험에서 평가된 300개 이상의 유전자형과 함께. 데이터는 이러한 방법을 사용하여 일반적으로 관찰되는 변이를 설명하기 위해 내성 및 감수성 유전형에 대해 제시된다.

1. R의 소스를 유지 레니포르스 이노쿨룸 (이노쿨룸)

1. 테라 코타 점토 냄비 (직경 15cm, 높이 13.5cm)를 1 부분의 모래 로밍과 2 부분 모래의 스팀 저온 살균 혼합물로 채웁니다. 각 냄비에 다양한 토마토(Solanum lycopersicon)를심고 냄비를 유리 하우스에 놓습니다.
   참고 : 면과 같은 다른 영향을 받기 쉬운 식물 품종은 토마토 대신 사용할 수 있습니다.
2. 토마토 식물을 버미폼 레니폼 선충으로 접종합니다(3.3단계 참조). 약 28 °C의 온도에서 유리 하우스의 식물을 유지합니다.

2. R에 대한 면 유전자형을 심기 . 레니포르스 저항 평가

1. 2부로 된 미세한 모래와 밭에서 채취한 1부분의 모래 로밍을 결합하여 토양을 준비합니다.
2. 증기는 토양이 선충과 토양 매개 식물 병원균이없는 것을 보장하기 위해 토양 혼합물을 저온 살균.
3. 원유 플라스틱 냄비에 토양 혼합물을 추가합니다 (직경 4cm, 높이 21cm). 냄비를 채우기 전에 토양 손실을 방지하기 위해 냄비 바닥에 면봉을 놓습니다. 냄비를 위에서 약 2cm 정도 토양으로 채웁니다.
4. 각 냄비에 플라스틱 스테이크를 준비하여 심을 유전자형을 지정합니다.
5. 평가를 위해 선택된 면 유전자형의 식물 종자.
   1. 분리 인구의 평가를 위해 각 냄비에 단일 씨앗을 심고, 각 종자마다 고유한 유전자형을 나타냅니다.
   2. 면화 품종 또는 세균 성 우송의 경우, 선충 접종 전에 냄비에서 제거 된 다른 묘목과 함께 적어도 하나의 식물의 발아를 보장하기 위해 단일 냄비에 2 ~ 3 개의 씨앗을 심습니다.
      참고 : 또는, 씨앗은 실행 불가능한 씨앗 냄비의 수를 최소화하기 위해 심기 전에 24 ~ 72 시간 동안 발아 할 수 있습니다.
6. 선택된 저항하고 영향을 받기 쉬운 통제 유전자형의 식물 종자.
   참고: 대조군 유전자형은 스크리닝 방법론에 내재된 자연적인 변이를 평가하기 위해 5~10회 복제됩니다.
7. 각 냄비에 씨앗을 덮기 위해 추가 토양으로 냄비를 채웁니다.
8. 냄비를 성장 챔버에 놓습니다. 성장 챔버에 대해 주변 공기 온도인 28°C의 일정한 온도를 유지합니다. 16 시간 포토 기간형광등과 백열램프의 혼합물로 인공 조명을 제공합니다.
9. 각 냄비에 물 방출기를 놓고 자동 급수 시스템을 사용하여 하루에 두 번 냄비에 물을. 식물이 성장함에 따라 추가 물을 공급하기 위해 급수 시스템을 조정합니다.

3. 면화 의 선충 접종 및 뿌리 샘플의 준비

1. 추출 vermiform reniform 선충은 접종 전날 용출¹⁹ 및 원심 부양²⁰ 방법론을 사용하여 취약한 토마토 식물 (1 단계 참조)에 유지됩니다. 추출된 선충을 4°C에 저장합니다.
   참고: Baermann 깔때기 추출(21)은 선충 추출을 위한 대체 방법이다.
2. 100 μL 하위 샘플에서 선충의 수를 계산하여 추출 된 선충의 수를 결정하고 접종을위해 수돗물에 1,000 선충 / mL의 현탁액을 준비하십시오.
3. 선충 현탁액으로 심은 후 면 모종을 7 d 접종합니다. 식물 옆의 토양에 작은 우울증을 만들고, 기중선 염현의 피펫 1 mL을 우울증으로 만듭니다.
4. 선충 평가를 위해 접종 후 냄비 28 d에서 식물을 제거합니다.
   참고 : 이 단계에서 식물은 키가 약 15cm이며 4 ~ 6 개의 잎이 완전히 확장됩니다.
   1. 냄비에서 식물을 제거하기 전에 가위를 사용하여 식물에서 완전히 확장 된 잎의 대부분을 제거합니다.
   2. 냄비에서 식물을 제거하려면 냄비를 짜내고 토양을 손으로 밀어 냅니다.
   3. 10L 용기에 수돗물에 뿌리 시스템을 교반하여 뿌리에서 토양을 부드럽게 제거합니다. 깨끗한 수돗물 용기에 뿌리 시스템을 간략하게 헹구어 보시고 자릅니다.
   4. 가위를 사용하여 토양 선 아래 약 1cm 의 식물에서 루트 시스템을 제거합니다.
5. 루트 시스템을 식별에 사용되는 냄비의 플라스틱 스테이크와 함께 120 mL 플라스틱, 비 멸균, 일회용 표본 용기에 넣습니다.
   참고: 3.7 단계로 진행하기 전에 여러 샘플이 처리됩니다. 식물 싹의 식물 번식을 위한 4단계로 진행한다.
6. 뿌리 시스템에 부착 된 선충을 염색하기 위해 수돗물에 붉은 식품 착색^17의 12.5 %(v / v) 용액을 준비하십시오.
7. 적색 식품 착색 액의 약 30 mL를 표본 용기의 루트 샘플에 추가하여 루트 시스템을 완전히 덮습니다.
8. 시편 용기를 전자레인지에 넣고 염색용액이 끓기 시작할 때까지 뿌리 샘플을 가열합니다. 전자레인지에서 시료를 꺼내실체가 실온에서 식힙니다.
9. 뿌리 샘플에서 붉은 식품 착색 액을 장식하고 여분의 얼룩을 제거하기 위해 시편 용기에 약 100 mL의 수돗물을 추가합니다. 덮개를 시편 용기에 놓고 샘플을 4°C의 냉장고에 보관합니다. 루트 감염 평가를 위해 5 단계로 진행하십시오.
   참고: 5단계로 진행하기 전에 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

4. 종자 생산을위한 식물을 복구하는 식물 전파

1. 원유 플라스틱 냄비 바닥에 면봉을 놓고(2.3단계 참조) 토탄 이끼 포팅 매체로 냄비를 부분적으로 채웁니다. 그런 다음, 냄비에 식물 촬영을 배치하고 단단히 냄비를 채우기 위해 포팅 매체를 추가합니다. 각 냄비에 새 라벨이 부착된 플라스틱 스테이크를 놓아 면 유전자형을 지정합니다.
2. 냄비 트레이를 플라스틱 용기(길이 73.6cm x 너비 45.7cm x 높이 15.2cm)에 물로 넣고 식물에 물을 주어 화분 매체에 적시다. 16 시간 포토 주기를 사용하여 28 °C의 일정한 온도로 성장 챔버에 냄비를 놓습니다. 토양 수분을 유지하기 위해 필요에 따라 플라스틱 용기에 물을 추가합니다.
3. 약 30 d. 포팅 매체 (단계 4.1 참조)로 6L 플라스틱 냄비를 부분적으로 채우고, 작은 냄비에서 식물을 제거하고, 6L 냄비에 식물을 넣고, 냄비를 채우기 위해 포팅 매체를 단단히 추가한 후 종자 생산을 위해 식물을 더 큰 냄비에 이식하십시오.
4. 유리 집에 식물을 놓고 포팅 매체를 적시기 위해 물을 추가하십시오. 약 28 °C에서 유리 하우스의 온도를 유지하십시오 (인공 조명이 필요하지 않습니다).
   1. 약 30 d에 대 한 필요에 따라 손으로 물 식물.
   2. 식물의 약 75%가 매일 급수를 필요로 할 때, 자동 급수 시스템을 사용하여 매일 물 식물. 식물 성장에 필요에 따라 자동 급수 시스템을 더 자주 물로 조정합니다.
   3. 꽃이 시작되기 전에 각 냄비에 약 10g의 느린 방출 비료를 넣습니다.
5. 성숙시 식물을 수확하고 추가 평가를 위해 씨앗을 얻기 위해 면종 자 샘플을 처리합니다.
   1. 면 씨앗을 수확하려면 식물의 열린 볼에서 면을 손으로 제거하고 라벨이 붙은 종이 봉투에 넣습니다. 씨앗은 다음 단계에서 제거되는 면 섬유에 부착됩니다.
   2. 10톱 실험실 진을 사용하여 종자 샘플에서 보풀 섬유를 제거합니다.
   3. 농축 황산을 사용하여 종자 샘플에서 퍼지 섬유를 제거합니다. 탄산나트륨의 15% (v/v) 용액에서 종자 샘플을 중화하고, 수돗물로 시료를 헹구고, 강제 공기 건조기에서 시료를 건조시다.
   4. 시드 샘플을 보관을 위해 레이블이 붙은 봉투에 놓습니다.

5. R의평가 . 레니포르스 루트 감염

1. 시편 용기에서 루트 샘플을 제거하고 입체 현미경 (20 배확대)을 사용하여 루트 시스템에 부착 된 여성 선충의 수를 계산합니다.
   참고 : 여성 기운 선충만이 식물 뿌리를 감염시킬 수 있습니다.
2. 여분의 수분을 제거하기 위해 약 10 분 동안 종이 타월에 뿌리 시스템을 놓습니다. 루트 시스템의 무게를 측정하여 새로운 루트 가중치를 결정합니다.
3. 선충 수와 신선한 루트 체중 데이터를 컴퓨터 스프레드시트 프로그램에 입력하고 루트 그램당 여성 수를 계산합니다.

두 가지 품종에 대한 루트 시스템의 로틸렌출루스 르니포름 감염은 도1에 제시되어 있다. 상대적으로 적은 수의 여성 성선충은 영향을 받기 쉬운 유전자형에 비해 내성 면 유전자형에 대한 공급 부위를 확립할 수 있다. 그림2에 나와 있는 것처럼 루트 성장의 변화는 접근 간에 공통됩니다. 신선한 뿌리 중량에 의해 측정된 이러한 변화는 동일한 유전자형의식물 사이에서도 관찰될 수 있다(표 1). Gossypium arboreum 유전형은 종종 고지대 면질 형보다 낮은 뿌리 성장 속도를 보여줍니다. 이 변이를 보상하기 위해 데이터는 각 유전자형에 대한 그램 루트 조직 당 여성 레니포선 선충의 수를 계산하는 데 사용되는 신선한 뿌리 가중치에 수집됩니다. 저항하는 유전형을 위한 뿌리의 그램 당 여성 reniform 선충의 수는 일반적으로 10 보다 적게, 반면 영향을 받기 쉬운 유전형은 일반적으로 루트의 그램 당 30 선충 보다 더 큰.

R에 대한 면 유전자형을 선별하기위한 하나의 도전 . reniformis 저항은 실험 내 및 사이에서 발생할 수있는 잠재적 인 변화입니다. 이 변이를 평가하고 조정하기 위해, 저항성 및 영향을 받기 쉬운 면 유전자형은 대조군으로 포함되고 각 실험에서 복제된다. 표 1은 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 두 개의 개별 실험에서 대조군으로 사용되는 두 가지 유전자형에 대한 데이터를 제시한다. 유전자형은 1,000개의 vermiform 선충을 심은 후 7일 동안 10회 복제하고 접종한 다음, 뿌리 시스템을 접종 후 28일 후에 수확하여 뿌리에 부착된 선충을 계산하였다. 실험은 다른 시간에 실시되었기 때문에, 접종에 사용되는 선충의 근원은 달랐다; 그렇지 않으면 다른 모든 매개 변수가 비슷했습니다. 이들 데이터는 르니포름 선충 평가에서 관찰될 수 있는 변이를 보여 준다. 여성 선충 수와 뿌리 무게는 실험 2에 비해 두 개의 대조군을 위한 실험 1에서 더 높았으며, 그 결과 실험 1의 경우 뿌리 그램당 여성의 수가 더 많았습니다. 암컷 수는 실험 1에 대해 상당히 높았기 때문에, 뿌리 가중치의 증가는 실험 2에 대해 관찰된 수준으로 뿌리의 그램당 여성의 수를 낮추지 않았다. 개별적인 유전자형의 복제 사이 상당한 변이 또한 관찰되었습니다. 그러나, 내성 G. arboreum 유전자형 PI 615699는 수민수G보다 뿌리의 그램당 여성 수가 실질적으로 더 낮은 것으로 나타났다. hirsutum 유전자형 PI 529251. 유전자형은 비교를 위해 이용될 때 저항하거나 영향을 받기 쉬운 으로 분류될 수 있습니다. 유전형은 뿌리의 그램 당 여성의 수가 영향을 받기 쉬운 통제의 대략 10%인 때 저항하는 것으로 분류됩니다.

프로토콜을 사용하여 평가된 분리F2 모집단의 데이터 하위 집합이 표2에 제시되어 있습니다. 인구는 300F2 식물을 포함하고, 변화의 범위를 나타내는 50 식물에 대한 데이터가 제시된다. 300 식물의 인구에 대 한, 루트 시스템을 감염 관찰 된 선충의 수는 범위 0 받는 것 50, 평균9.4. 루트 가중치는 0.01-1.22 g의 범위로, 뿌리 의 그램 당 평균 0.38 g. 0-400에서 원거리 여성 선충, 평균 33.6. 부모는 평가에서 복제되었습니다. 내성 모(PI 417895)는 뿌리 의 그램당 5.8 암컷의 평균을 보였으며, 평균 뿌리 중량은 0.8 g이었다. 대조적으로, 영향을 받기 쉬운 부모 (PI 529729)는 뿌리의 그램 당 40.8 암컷의 평균을 보였고, 0.35 g의 평균 뿌리 무게와 함께 20 식물은 선충 감염을 보이지 않았으며 저항성으로 분류되었지만, 이것은 탈출을 나타낼 수 있습니다. 루트 성장이 좋지 않는 이 식물과 식물은 일반적으로 데이터 분석에서 제거됩니다. 뿌리 성장 및 선충 감염에 대 한 변이 범위 는 일반적으로 선충 평가 대 한 관찰; 따라서, 단일 실험에서 많은 수의 식물을 스크리크하는 능력은 이러한 변이를 최소화하고 저항의 유전학을 정확하게 평가할 수 있다. 인구는 선충 감염을 위한 양적 변이를 보여주었고, 식물은 저항이 인구를 위한 2개의 열성 유전자에 의해 수여되었다는 것을 건의하는 영향을 받기 쉬운 부모에게서 데이터에 근거를 둔 저항으로 분류되었습니다. 또한, 위에서 설명한 식물 전파 프로토콜은 이 집단으로부터 식물을 회수하는 데 성공적으로 사용되었다. 개별 F2 식물로부터 유래된 F3 자손의 등급은F2 식물의 등급에 자주 대응되었다.

그림 1: 로틸렌출루스 르니포름 감염 뿌리 샘플. 저항하는 면 유전자형 (아래 왼쪽)에서 루트 견본은 뿌리에 붙어 있는 단 하나 여성 선충을 보여줍니다, 반면 에 취약한 유전자형 (오른쪽 상단) 루트에 붙어 있는 다중 암컷을 보여줍니다. 검은색 막대는 0.1mm 눈금을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 두 가지 면 유전자형에 대한 뿌리 성장에서 관찰된 변이. 두 개의 레니포름 선충 저항하는 G.arboreum 우제에 대한 루트 시스템은 뿌리 성장을 위해 관찰 될 수있는 변화를 설명하기 위해 제시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 대조군으로서 포함된 2개의 면 유전자형에 대한 레니포름 선충 감염 반응에서 관찰된 변이. 이러한 데이터는 영향을 받기 쉬운 G.hirsutum 유전자형 PI 529251 및 내성 G에대한 실험 내에서 그리고 실험 사이에서 발생할 수 있는 변이를 보여줍니다. 아보륨 유전자형 PI 615699; 그러나, 데이터 수단은 유전형이 저항하거나 영향을 받기 쉬운으로 쉽게 분류될 수 있도록, 현저하게 달랐습니다.

표 2: 50개의 유전자형의 서브세트에서 관찰된 르니포름 선충 감염 반응 G. 수목 F2 인구. 이러한 데이터는 모집단분리를 위해 관찰할 수 있는 변형 범위를 보여 줍니다. 루트 무게, 선충 수, 그리고 루트의 그램 당 여성의 수는 각 유전자형에 대 한 제시, 저항으로 분류 하는 식물, 적당 하 게 저항, 적당 하 게 취약 한, 또는 취약.

저자는 공개 할 것이 없다.