방법 논문

르니포름 선충 저항을 위한 면 유전자형 검열

DOI:

10.3791/58577

⸱

2019년 5월 2일

 , 
1Crop Genetics Research Unit, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 레니포름 선충 저항을 위한 면 유전자형의 신속한 비파괴 스크리닝을 위한 프로토콜이 제시된다. 프로토콜은 감염 반응을 결정하기 위하여 선충 감염한 면 묘목의 뿌리를 시각적으로 검토하는 관련시킵니다. 각 식물에서 식물 싹은 다음 종자 생산을위한 식물을 복구하기 위해 전파된다.

초록

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선충 관리를 개선하기 위해 내성면(Gossypium hirsutum)품종의 개발을 위해서는 신속한 비파괴성 선충(Rotylenchulusreniformis)스크리닝 프로토콜이 필요하다. 대부분의 프로토콜은 목화 뿌리 시스템에서 vermiform 선충 또는 계란을 추출하거나 인구 밀도 또는 번식 속도를 결정하기 위해 토양을 포팅하는 것을 포함합니다. 이 접근은 일반적으로 평가된 유전자형의 소수와 함께 시간 소모적입니다. 다른 접근법은 뿌리 시스템이 선충 감염을 위해 시각적으로 검사되는 여기에서 기술됩니다. 이 프로토콜은 버미폼 선충으로 심은 후 7 일 동안 면모종을 접종하고 접종 후 28 일 후에 뿌리 시스템에 부착 된 여성의 수를 결정합니다. 데이터는 뿌리 성장의 변화에 대 한 조정 하는 신선한 루트 무게의 그램 당 여성의 수로 표현 됩니다. 상기 프로토콜은 선충이 감염 부위를 확립하는 능력과 관련된 숙주 식물 저항을 평가하기 위한 훌륭한 방법을 제공한다; 그러나, 선충 재생을 방해 하는 저항 평가 되지 않습니다. 그밖 검열 프로토콜과 같이, 변이는 실험 내의 그리고 사이 개별적인 유전자형 중 선충 감염에서 일반적으로 관찰됩니다. 데이터는 프로토콜을 사용하여 관찰된 변이의 범위를 설명하기 위해 제시된다. 이 변이를 조정하기 위하여는, 통제 유전자형은 실험에서 포함됩니다. 그럼에도 불구하고, 프로토콜은 호스트 식물 저항을 평가하는 간단하고 신속한 방법을 제공한다. 이 프로토콜은 G. arboreum 세균 수집 및 저항의 유전학을 결정하기 위해 300 개 이상의 개인의 분리 인구를 평가합니다. 저항 번식을 위한 식물회수용 식물 번식방법도 개발되었다. 선충 평가를위한 뿌리 시스템을 제거 한 후, 식물 촬영은 새로운 루트 시스템의 개발을 허용하기 위해 이식된다. 촬영의 95 % 이상은 일반적으로 성숙에 도달 식물과 새로운 루트 시스템을 개발한다.

서론

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로틸렌출루스 르니포르니스 (린포드와 올리베이라) 일반적으로 레니폼 선충으로 불리며, 미국 남동부 의 토양에 존재하는 주요 기생 선충 종 중하나이다 1,2,3. 선충은 의무, 앉아있는 반 내분체는 그것의 수명 주기를 완료하기 위하여 호스트식물을 요구합니다 2,4. Vermiform preadult 여성 선충은 비석2,3에공급 사이트를 확립하기 위해 숙주 루트 시스템을 관통합니다. 선충이 공급되고 성숙함에 따라 숙주 뿌리 외부에 남아있는 후부 부분은 계란 생산 시 부풀어 오르며특징적인 신장 모양을 형성합니다 (그림 1). 로틸렌출루스 레니포르는 면 4를 포함하여 300종 이상의 식물종의 뿌리계통을 공급할 수 있다. 업랜드코튼(Gossypium hirsutum L.)은 미국 남동부에서 널리 재배되고 있지만 R이 부족합니다. 레니포름 내성 품종은 선충 관리2,3을방해합니다. 비숙주 작물 종에 대한 네마티드 처리 및 회전과 같은 관리 전략은 토양 R을 감소시키는 데 사용되어 왔다. 레니포름 인구 밀도5,6,그러나 종자 면 수율 손실은 일반적으로 1에서 5 %2까지다양할 수 있습니다. R의 증상 . 르니포르니스 감염에는 식물 기절, 억제된 뿌리 성장, 영양 결핍, 과일낙태 및 지연된 성숙도 2가 포함될 수 있습니다. 그러나, 현상은 필드를 통해 현상의 균일성 때문에 명백하지 않을 수 있습니다; 따라서 R을 평가하는 접근 방식. 레니포름 감염은 내성 고지대 면화 품종을 식별하고 개발하는 데 필요합니다. R의 평가 . 식물이 감염의 증상을 보일수 있더라도 감염된 루트 시스템이 정상으로 나타날 수 있기 때문에 면화의 reniformis 저항은 어려운 7로 간주됩니다8.

R.식별을 위해서는 효과적인 선충 스크리닝 프로토콜이 필요합니다. 면 세균 컬렉션에서 reniformis 저항하는 착오, 및 이 착오에 대한 저항 유전학의 측정을 위해. 이러한 프로토콜은 고지대 면화에 대한 저항성 유전자의 전달에 도움이 될 것이다. 다양한생물학적 분석 방법이 R. 면 8,9,10,11,12,13,14,15의 레니포르마 감염 . 일반적으로 R. 식별에 두 가지 주요 접근 법이 사용되었습니다. 레니포르스 내성 면 유전형. 가장 자주 사용되는 접근 방식은 감염된 식물 이나 토양 에서 계란 및 / 또는 vermiform 선충을추출 하는 포함 8,11,12,14,15. 이 접근법에 대한 일반적인 방법은 별도의 냄비에 개별 면화 유전형에 대한 씨앗을 심는 것을 포함하며, 묘목이 7 일에서 14 일 동안 발달 할 수 있게하고, R의 vermiform 단계의 혼합물을 추가하여 묘목을 접종합니다. 토양에 reniformis, 선충이 30~60일 동안 루트 시스템을 감염시킬 수 있도록 한다. 다음으로, vermiform 선충 및 계란각 식물의 감염 된 루트 시스템에서 추출 또는 화분 토양에서. 추출된 선충 또는 계란의 수는 저항하는 유전형을 확인하기 위하여 대조군 유전자형과 비교되는 인구 밀도 및 재생 비율을 추정하기 위하여 결정됩니다.

여기서 설명한 바와 같이, 다른 접근법은, 뿌리를 기생시키는 여성 선충의 수를 결정하기 위해 선충에 감염된 면화 뿌리 시스템을 현미경으로 검사하는 것을 포함한다10,16. 다른 접근법과 마찬가지로 면 유전자형은 별도의 냄비에 심고 심은 후 약 7 일 후에 vermiform 선충으로 접종됩니다. 접종 후 30 일 이내에 뿌리 시스템은 개별 식물에서 제거되고 토양은 뿌리에서 헹구집니다. 다음으로, 뿌리 시스템에 부착된 선충은 붉은 색소로 염색되고, 뿌리는 현미경으로 검사되어 내성 면 유전자형을 가진 감염 부위의 수를 결정한다(그램당 선충의 수에 기초하여 확인) 의 뿌리)에 비해 취약 제어16. 이러한 제2 접근법은 평가에 필요한 일수를 줄이고 단일 실험에서 평가된 개별 유전자형의 수를 증가시킴으로써 처리량 증가의 장점이 있다. 인구 밀도 또는 재생률을 평가하는 선별 방법론은 감염 징후의 시각적 관찰에 기초한 방법보다 종종 더 많은 시간이 소요되는경우가 많다7. 그러나, 이 접근법의 한 가지 제한은 계란 생산에 의해 결정된 선충 재생을 방해하는 숙주 식물 저항이 평가되지 않는다는것이다13.

R. 에대한 스크리닝 프로토콜. 레니포르니스 저항은 종종 평가7 동안 루트 시스템을 파괴하고 폐기되는 식물 촬영을 포함한다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 종자 생산을 위한 식물의 회수를 허용하는 식물번식의 방법이 개발되었다(18). 선충 평가를 위한 뿌리 시스템의 제거 후, 식물 싹은 뿌리 시스템이 재성장할 수 있도록 포팅 토양에 심어진다. 이 메서드에는 대부분의 R. 르니포르니스 스크리닝 프로토콜. 식물 번식의 간단하고 빠른 방법은 R. 자손의 회복이 다음 세대에 내성 유전형을 사전에 필요한 르니 포르 니스 내성 고원 면 품종.

르니포름 선충 저항을 위한 면 유전자형의 대규모 스크리닝을 위한 프로토콜이 제시된다. 목표는 내성 고지대 면품종의 사육을 돕기 위해 선충 저항에 대한 면 사육 인구를 평가하는 간단하고 신속한 비파괴 선별 방법을 개발하는 것입니다. 이 프로토콜을 사용하여, 데이터는 전형적으로 35 일 안에 장악되고, 단 하나 실험에서 평가된 300개 이상의 유전자형과 함께. 데이터는 이러한 방법을 사용하여 일반적으로 관찰되는 변이를 설명하기 위해 내성 및 감수성 유전형에 대해 제시된다.

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프로토콜

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1. R의 소스를 유지 레니포르스 이노쿨룸 (이노쿨룸)

  1. 테라 코타 점토 냄비 (직경 15cm, 높이 13.5cm)를 1 부분의 모래 로밍과 2 부분 모래의 스팀 저온 살균 혼합물로 채웁니다. 각 냄비에 다양한 토마토(Solanum lycopersicon)를심고 냄비를 유리 하우스에 놓습니다.
    참고 : 면과 같은 다른 영향을 받기 쉬운 식물 품종은 토마토 대신 사용할 수 있습니다.
  2. 토마토 식물을 버미폼 레니폼 선충으로 접종합니다(3.3단계 참조). 약 28 °C의 온도에서 유리 하우스의 식물을 유지합니다.

2. R에 대한 면 유전자형을 심기 . 레니포르스 저항 평가

  1. 2부로 된 미세한 모래와 밭에서 채취한 1부분의 모래 로밍을 결합하여 토양을 준비합니다.
  2. 증기는 토양이 선충과 토양 매개 식물 병원균이없는 것을 보장하기 위해 토양 혼합물을 저온 살균.
  3. 원유 플라스틱 냄비에 토양 혼합물을 추가합니다 (직경 4cm, 높이 21cm). 냄비를 채우기 전에 토양 손실을 방지하기 위해 냄비 바닥에 면봉을 놓습니다. 냄비를 위에서 약 2cm 정도 토양으로 채웁니다.
  4. 각 냄비에 플라스틱 스테이크를 준비하여 심을 유전자형을 지정합니다.
  5. 평가를 위해 선택된 면 유전자형의 식물 종자.
    1. 분리 인구의 평가를 위해 각 냄비에 단일 씨앗을 심고, 각 종자마다 고유한 유전자형을 나타냅니다.
    2. 면화 품종 또는 세균 성 우송의 경우, 선충 접종 전에 냄비에서 제거 된 다른 묘목과 함께 적어도 하나의 식물의 발아를 보장하기 위해 단일 냄비에 2 ~ 3 개의 씨앗을 심습니다.
      참고 : 또는, 씨앗은 실행 불가능한 씨앗 냄비의 수를 최소화하기 위해 심기 전에 24 ~ 72 시간 동안 발아 할 수 있습니다.
  6. 선택된 저항하고 영향을 받기 쉬운 통제 유전자형의 식물 종자.
    참고: 대조군 유전자형은 스크리닝 방법론에 내재된 자연적인 변이를 평가하기 위해 5~10회 복제됩니다.
  7. 각 냄비에 씨앗을 덮기 위해 추가 토양으로 냄비를 채웁니다.
  8. 냄비를 성장 챔버에 놓습니다. 성장 챔버에 대해 주변 공기 온도인 28°C의 일정한 온도를 유지합니다. 16 시간 포토 기간형광등과 백열램프의 혼합물로 인공 조명을 제공합니다.
  9. 각 냄비에 물 방출기를 놓고 자동 급수 시스템을 사용하여 하루에 두 번 냄비에 물을. 식물이 성장함에 따라 추가 물을 공급하기 위해 급수 시스템을 조정합니다.

3. 면화 의 선충 접종 및 뿌리 샘플의 준비

  1. 추출 vermiform reniform 선충은 접종 전날 용출19 및 원심 부양20 방법론을 사용하여 취약한 토마토 식물 (1 단계 참조)에 유지됩니다. 추출된 선충을 4°C에 저장합니다.
    참고: Baermann 깔때기 추출(21)은 선충 추출을 위한 대체 방법이다.
  2. 100 μL 하위 샘플에서 선충의 수를 계산하여 추출 된 선충의 수를 결정하고 접종을위해 수돗물에 1,000 선충 / mL의 현탁액을 준비하십시오.
  3. 선충 현탁액으로 심은 후 면 모종을 7 d 접종합니다. 식물 옆의 토양에 작은 우울증을 만들고, 기중선 염현의 피펫 1 mL을 우울증으로 만듭니다.
  4. 선충 평가를 위해 접종 후 냄비 28 d에서 식물을 제거합니다.
    참고 : 이 단계에서 식물은 키가 약 15cm이며 4 ~ 6 개의 잎이 완전히 확장됩니다.
    1. 냄비에서 식물을 제거하기 전에 가위를 사용하여 식물에서 완전히 확장 된 잎의 대부분을 제거합니다.
    2. 냄비에서 식물을 제거하려면 냄비를 짜내고 토양을 손으로 밀어 냅니다.
    3. 10L 용기에 수돗물에 뿌리 시스템을 교반하여 뿌리에서 토양을 부드럽게 제거합니다. 깨끗한 수돗물 용기에 뿌리 시스템을 간략하게 헹구어 보시고 자릅니다.
    4. 가위를 사용하여 토양 선 아래 약 1cm 의 식물에서 루트 시스템을 제거합니다.
  5. 루트 시스템을 식별에 사용되는 냄비의 플라스틱 스테이크와 함께 120 mL 플라스틱, 비 멸균, 일회용 표본 용기에 넣습니다.
    참고: 3.7 단계로 진행하기 전에 여러 샘플이 처리됩니다. 식물 싹의 식물 번식을 위한 4단계로 진행한다.
  6. 뿌리 시스템에 부착 된 선충을 염색하기 위해 수돗물에 붉은 식품 착색17의 12.5 %(v / v) 용액을 준비하십시오.
  7. 적색 식품 착색 액의 약 30 mL를 표본 용기의 루트 샘플에 추가하여 루트 시스템을 완전히 덮습니다.
  8. 시편 용기를 전자레인지에 넣고 염색용액이 끓기 시작할 때까지 뿌리 샘플을 가열합니다. 전자레인지에서 시료를 꺼내실체가 실온에서 식힙니다.
  9. 뿌리 샘플에서 붉은 식품 착색 액을 장식하고 여분의 얼룩을 제거하기 위해 시편 용기에 약 100 mL의 수돗물을 추가합니다. 덮개를 시편 용기에 놓고 샘플을 4°C의 냉장고에 보관합니다. 루트 감염 평가를 위해 5 단계로 진행하십시오.
    참고: 5단계로 진행하기 전에 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

4. 종자 생산을위한 식물을 복구하는 식물 전파

  1. 원유 플라스틱 냄비 바닥에 면봉을 놓고(2.3단계 참조) 토탄 이끼 포팅 매체로 냄비를 부분적으로 채웁니다. 그런 다음, 냄비에 식물 촬영을 배치하고 단단히 냄비를 채우기 위해 포팅 매체를 추가합니다. 각 냄비에 새 라벨이 부착된 플라스틱 스테이크를 놓아 면 유전자형을 지정합니다.
  2. 냄비 트레이를 플라스틱 용기(길이 73.6cm x 너비 45.7cm x 높이 15.2cm)에 물로 넣고 식물에 물을 주어 화분 매체에 적시다. 16 시간 포토 주기를 사용하여 28 °C의 일정한 온도로 성장 챔버에 냄비를 놓습니다. 토양 수분을 유지하기 위해 필요에 따라 플라스틱 용기에 물을 추가합니다.
  3. 약 30 d. 포팅 매체 (단계 4.1 참조)로 6L 플라스틱 냄비를 부분적으로 채우고, 작은 냄비에서 식물을 제거하고, 6L 냄비에 식물을 넣고, 냄비를 채우기 위해 포팅 매체를 단단히 추가한 후 종자 생산을 위해 식물을 더 큰 냄비에 이식하십시오.
  4. 유리 집에 식물을 놓고 포팅 매체를 적시기 위해 물을 추가하십시오. 약 28 °C에서 유리 하우스의 온도를 유지하십시오 (인공 조명이 필요하지 않습니다).
    1. 약 30 d에 대 한 필요에 따라 손으로 물 식물.
    2. 식물의 약 75%가 매일 급수를 필요로 할 때, 자동 급수 시스템을 사용하여 매일 물 식물. 식물 성장에 필요에 따라 자동 급수 시스템을 더 자주 물로 조정합니다.
    3. 꽃이 시작되기 전에 각 냄비에 약 10g의 느린 방출 비료를 넣습니다.
  5. 성숙시 식물을 수확하고 추가 평가를 위해 씨앗을 얻기 위해 면종 자 샘플을 처리합니다.
    1. 면 씨앗을 수확하려면 식물의 열린 볼에서 면을 손으로 제거하고 라벨이 붙은 종이 봉투에 넣습니다. 씨앗은 다음 단계에서 제거되는 면 섬유에 부착됩니다.
    2. 10톱 실험실 진을 사용하여 종자 샘플에서 보풀 섬유를 제거합니다.
    3. 농축 황산을 사용하여 종자 샘플에서 퍼지 섬유를 제거합니다. 탄산나트륨의 15% (v/v) 용액에서 종자 샘플을 중화하고, 수돗물로 시료를 헹구고, 강제 공기 건조기에서 시료를 건조시다.
    4. 시드 샘플을 보관을 위해 레이블이 붙은 봉투에 놓습니다.

5. R의평가 . 레니포르스 루트 감염

  1. 시편 용기에서 루트 샘플을 제거하고 입체 현미경 (20 배확대)을 사용하여 루트 시스템에 부착 된 여성 선충의 수를 계산합니다.
    참고 : 여성 기운 선충만이 식물 뿌리를 감염시킬 수 있습니다.
  2. 여분의 수분을 제거하기 위해 약 10 분 동안 종이 타월에 뿌리 시스템을 놓습니다. 루트 시스템의 무게를 측정하여 새로운 루트 가중치를 결정합니다.
  3. 선충 수와 신선한 루트 체중 데이터를 컴퓨터 스프레드시트 프로그램에 입력하고 루트 그램당 여성 수를 계산합니다.

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결과

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두 가지 품종에 대한 루트 시스템의 로틸렌출루스 르니포름 감염은 도1에 제시되어 있다. 상대적으로 적은 수의 여성 성선충은 영향을 받기 쉬운 유전자형에 비해 내성 면 유전자형에 대한 공급 부위를 확립할 수 있다. 그림2에 나와 있는 것처럼 루트 성장의 변화는 접근 간에 공통됩니다. 신선한 뿌리 중량에 의해 측정된 이러한 변화는 동일한 유전자형의식물 사이에서도 관찰될 수 있다(표 1). Gossypium arboreum 유전형은 종종 고지대 면질 형보다 낮은 뿌리 성장 속도를 보여줍니다. 이 변이를 보상하기 위해 데이터는 각 유전자형에 대한 그램 루트 조직 당 여성 레니포선 선충의 수를 계산하는 데 사용되는 신선한 뿌리 가중치에 수집됩니다. 저항하는 유전형을 위한 뿌리의 그램 당 여성 reniform 선충...

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토론

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효과적인 스크리닝 프로토콜은 1) R의식별을 위해 요구된다. 저항성의 유전학및 2) 내성 품종의 사육을 평가하기 위해 내성 면 유전자형. 대부분의 프로토콜은 R. 목화 뿌리 시스템에서 해충 선충 또는 계란을 추출하거나 토양을포팅 8,11,12,14,15로 추출하여 reniformis 인구 밀도 또는 번식 속도 . 이러한 접근 방식은 종종 더 많은 시간이 소요되며, 결과는 실험 내에서 그리고 실험 사이에 더 다양해지는 경향이 있습니다. 부가적으로, 면 유전형은 이들 프로토콜(11)을 사용하여 비복제된글래스하우스 실험에서 더 자주 잘못 분...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 농업의 미국 부서에 의해 투자 되었다, 농업 연구 서비스. 이 문서의 상품명 및 상업용 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하기 위한 목적으로만 사용되며 미국 농무부의 권장 사항 또는 보증을 의미하지 않습니다. USDA는 동등한 기회 제공자이자 고용주입니다. 저자는 선언할 이해상충이 없습니다. 기술 지원은 크리스티 요르단에 의해 제공되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
레이 리치 콘 테이너Stuewe and Sons Inc.SC10U
콘 테이너 트레이Stuewe and Sons Inc.RL98
모래다양한
면봉,다양한
4인치 식물 라벨(4인치 L x 5/8인치, W),Pylon PlaticsL-4-W, 모든 브랜드 또는 공급업체를 사용할 수 있습니다.
4온스 표본 용기Fisher Scientific16-320-731모든 브랜드 또는 공급업체를 사용할 수 있습니다.
빨간 식용 색소McCormick & Co., Inc.
1mL 피펫 팁다양한
10L 용기다양한저렴한 버킷이 잘 작동합니다.
6L 냄비보육 용품 Inc.Poly-Tainer-Can No2A모든 브랜드 또는 공급업체를 사용할 수 있습니다. 다양한 크기의 냄비를 사용할 수 있습니다 :
포팅 미디어Sun Gro HorticultureMetro-Mix 360모든 브랜드 또는 공급 업체를 사용할 수 있습니다.
비료Everris NA Inc.Osmocote Plus모든 브랜드 또는 공급업체를 사용할 수 있습니다.
플라스틱 용기 (73.6 cm L x 45.7 cm W x 15.2 cm D)Rubbermaid3O29 모든 브랜드 또는 공급업체를 사용할 수 있습니다.
, 철탑, , , , ,

참고문헌

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