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방법 논문

단일 벽 탄소 나노튜브 (SWCNT)에 의해 생체 내에서 여러 Myeloma 세포 성장 억압-MALAT1 센스 Oligos 전달

5.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58598

⸱

2018년 12월 13일

 ,  , 
1Department of Cancer Biology, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Medical Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 원고는 단일 벽 탄소 나노튜브 (SWCNT)의 합성에 설명 합니다-는 SWCNT의 안정적인 납품과의 강력한 치료 효과 보여 주는 MALAT1 센스 gapmer DNA oligonucleotide (SWCNT-안티-MALAT1) 활용 안티-MALAT1 생체 외에서 그리고 vivo. 합성, 수정, 활용, 사용 하는 방법 그리고 주입 SWCNT-안티-MALAT1의 설명.

초록

단일 벽 탄소 나노튜브 (SWCNT)는 새로운 유형의 나노, 세포, 단백질, oligonucleotides, 합성 작은 분자 약물 등으로 약의 여러 종류를 제공 하는 데 사용 되었습니다. SWCNT 사용자 정의 크기, 큰 표면 영역 있고 유연 하 게 표면;에 다른 수정 마약으로 바인딩할 수 있습니다. 따라서, 셀으로 마약을 수송 하는 이상적인 시스템 이다. 긴 noncoding RNAs (lncRNAs)는 200 이상 noncoding RNA의 클러스터 nt는 단백질에 번역 될 수 없습니다 하지만 생물 학적 및 병 태 생리 과정에 중요 한 역할. 전이 관련 된 폐 선 암 사본 1 (MALAT1)은 매우 보존된 lncRNA 이다. 그것은 상부 MALAT1 여러 발성 (MM)를 포함 한 다양 한 암에서의 빈약한 예 지에 관련 된 시연 했다. 우리 MALAT1 mm; DNA 수리 및 세포 죽음 통제 밝혀졌다 따라서, MALAT1 m M에 대 한 치료 대상으로 간주 될 수 있습니다. 그러나, 센스 oligo의 억제/최저 MALAT1 vivo에서 효율적인 배달 여전히 문제입니다. 이 연구에서 우리 못 2000 SWCNT 수정 그것에 안티 MALAT1 올리고 켤레, 테스트 생체 외에서 화합물의 배달, 전파 m M 마우스 모델, 정 맥 주입 하 고 나타내는 m M 진행의 중요 한 금지를 관찰 그 SWCNT 안티 MALAT1 gapmer DNA에 대 한 이상적인 배달 셔틀 이다.

서론

SWCNT 소설을 접한 제공할 수 있는 다양 한 유형의 약물, 단백질, 작은 분자, 핵 산 등 안정적이 고 효율적으로 이상적인 tolerability와 시험관1 에 vivo에서2최소 독성입니다. 기능성된 SWCNT 좋은 생체 적합성 및 물 가용성, 작은 분자에 대 한 셔틀으로 사용 될 수 있으며 세포 막3,,45에 침투 하는 그들을 가져올 수 있다.

lncRNAs는 RNA의 클러스터 (> 200 nt) 게놈에서 mRNA를 복사할 수는 있지만 단백질에 번역 될 수 없습니다. LncRNAs 유전자 식6 의 규칙에 참여 하 고 개시와 대부분의 유형의 암, m M7,8,9등의 진행에 관련 된 증거를 증가 보이고 있다. MALAT1 핵 농축 noncoding 사본을 2 (NEAT2)은 매우 보존된 lncRNA10. MALAT1 전이성 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC)11, 처음 인식 하지만 수많은 종양5,,1213;에 overexpressed 되었습니다. 그것은 가장 높은 표현된 lncRNAs 중 하나 이며 m M8,14에서 가난한 예 후와 상관 된다. MALAT1 식 수준 치명적인 코스 extramedullary m M 환자 m M15로 진단만 그에 비해 크게 높은 수준 이다.

이전 연구에서 우리는 안티-MALAT1 oligos 튼튼하게 이어질 DNA 손상 및 m M16 에서 apoptosis gapmer DNA 센스 oligonucleotides MALAT1 타겟팅을 사용 하 여 확인 했습니다 (안티-MALAT1) MM 셀에서. Gapmer DNA 센스 DNA의 구성 이며 2'-오메-RNAs, RNase H 한 번 바운드 활동17여 MALAT1 분열을 프롬프트 수 있는 연결. 센스 oligos의 생체 조건 납품 효율성은 아직도 그것의 임상 사용을 제한합니다.

배달 테스트 안티 MALAT1 gapmer oligos, DNA DSPE-PEG2000-아민에 활용 된 안티 MALAT1 gapmer에 대 한 SWCNT의 효과 기능성 SWCNT. SWCNT 안티 MALAT1 다음 주입 정 맥 MM 전파 마우스 모델; 눈에 띄는 억제 4 치료 후 관찰 됩니다.

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프로토콜

모든 실험 동물 관련 된 사전 (기관 동물 관리 및 사용 위원회) 클리블랜드 클리닉 IACUC에 의해 승인 되었다.

1입니다. 기능성된 SWCNTs의 합성

  1. SWCNTs, DSPE-PEG2000-아민의 5 mg 및 유리 섬광 유리병 (20 mL) 소독된 nuclease 무료 물 5 mL의 혼합 1 밀리 그램. 흔들어 모든 시 약을 완전히 분해 하는 게.
  2. 실 온에서 1 h 40 W의 전력 레벨에서 물 목욕 sonicator에 유리병을 sonicate (RT, 20 분 x 3, 과열 방지를 위해 물 매 20 분을 변경). 그리고, 24000 x g 6 h에서 원심 표면에 뜨는 솔루션을 수집 합니다. 이 기능 SWCNT 솔루션 2 개월 동안 4 ℃에 저장할 수 있습니다.
  3. 이어서 소독된 nuclease 무료 물 4 mL 100 kDa MWCO 원심 필터 장치, 단계 1.2에서에서 SWCNT 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 여분의 DSPE-PEG2000-아민을 제거 하는 RT에 4000 x g 에서 10 분 원심 분리기. 물과 원심 분리 5의 4 mL의 추가 반복 x. 남은 SWCNT 솔루션의 0.5 mL 이상 각 원심 분리 후 필터에 남아 있을 것입니다.
  4. 808에 UV/VIS 분 광 계를 사용 하 여 필터에 남은 SWCNT 용액의 농도 측정 최종 세척 후 nm. 최종 농도 일반적으로 약 50 mg/L (캄 외.18에 의해 개발 된 방법에 따라 계산).
    참고: DSPE-말뚝-기능성된 SWCNTs 수용 단계 1.4 후는 몇 주 후 보이는 집계 없이 다른 생물학 솔루션 안정 확인 하십시오.

2. 안티 MALAT1 Gapmer DNA의 활용 기능성된 SWCNT 2'-O 수정된 RNAs에 의해 형벌

  1. DSPE-PEG2000-아민의 450 µ L에 0.5 mg Sulfo-LC-SPDP의 공업화 SWCNT를 추가 합니다. 10 x PBS의 50 µ L을 추가 하 고 실시간에 2 h에 대 한 품 어
  2. 여분의 Sulfo-LC-SPDP를 제거 하려면 다음 nuclease 무료 물 4 mL 100 kDa MWCO 원심 필터 장치, 단계 2.1에서에서 반응을 추가 합니다. 물과는 원심 분리의 실시간 반복 4 mL의 추가에서 4000 x g 에서 10 분 원심 5 배.
  3. 200 nM thiol 수정 안티 MALAT1 Cy3 gapmer DNA 상업 DTT 솔루션의 1.5 mL에 추가 하 고 제조 업체의 프로토콜에 따라 NAP-5 열 제품 실시간 Purify에서 90 분 동안 품 어. 500 µ L의 멸 균된 nuclease 무료 1와 안티 MALAT1 Cy3 elute PBS x.
    참고: 기능성된 SWCNT 이황화 결합 thiolated 안티 MALAT1 gapmer DNA의 저장 동안 쪼개 다 수 추가 된 DTT와 함께 저장할 수 있습니다. 추가 된 DTT aNAP-5 열 SWCNT와 활용 하기 전에 제거할 수 있습니다.
  4. 필터에 남아 sulfo LC-SPDP-대우 DSPE-PEG2000-아민 SWCNT 솔루션을 수집 하 고 안티 MALAT1 Cy3 솔루션의 500 µ L로 희석. 그런 다음, 24 h 4 ° C에서 품 어. 활용 된 SWCNT-안티-MALAT1 3 주 동안 4 ℃에 저장할 수 있습니다. 동일한 절차에 따라 출 격 센스 올리고 함께 활용된 SWCNT 합성 고 SWCNT 제어로 사용 될 수 있습니다.

3. 꼬리 정 맥 주입 SWCNT-안티-MALAT1의

  1. MM 전파 마우스 모델을 생성 합니다.
    1. 비교의 최상의 결과 얻기 위해 임의로 14 끄 덕을 정렬 합니다. 재판 또는 컨트롤 그룹 (각 그룹에서 7) 같은 남성/여성 비율으로 CB17-Prkdcscid/J 쥐 (8 주 정도)
    2. 작업 벤치를 청소 하 고 70% 알코올로 소독.
    3. 나타나는 정 맥 꼬리 수 있도록 마우스를 따뜻하게 하는 난방 램프를 사용 합니다. 꼬리 주입 restrainer와 마우스를 제대로 제 지.
    4. 주사 마 취 없이 꼬리 정 맥을 통해 PBS의 50 µ L에서 5 x 106 MM.1S-뤽-mCherry 셀. 30 s. 마크 삽입 된 마우스에 대 한 알코올 면봉으로 사출 사이트를 누르고 깨끗 한 케이지를 반환 합니다.
  2. 하루 7 MM.1S 세포 주입 후에 치료를 시작 합니다.
    1. 마우스의 꼬리 정 맥에 SWCNT-안티-MALAT1를 포함 하는 PBS의 50 µ L을 주입. 사용 하 여 PBS SWCNT 컨트롤로 제어 포함.
    2. 30 대 알코올 면봉으로 사출 사이트를 눌러 s.
    3. 꼬리와 1 분에 대 한 마우스의 일반적인 동작에 로컬 출혈을 관찰 하 고 깨끗 한 케이지를 반환 합니다. 다시 주사 잘 용납 되도록 랙에 케이지를 반환 하기 전에 모든 주입 된 쥐를 관찰 합니다.
  3. 주사는 실험 종료까지 7 일 마다 반복 합니다.
    1. 마우스의 일반 건강 저하 때 실험을 종료: 때 안 먹고 마시거나, 창백한 발 모양, 피하 출혈, 호흡 곤란 감소 활동, 더 낮은 사지에 만질 수 있는 질량의 마비는 복 부는 관찰 했다.

4입니다. 질병의 진행의 평가

  1. MM.1S-뤽-mCherry 세포 주입 후 매일 쥐의 일반적인 상태를 평가 합니다. 특정 주의 쥐 개발 하는 경우 더 낮은 사지의 마비.
  2. 종양의 성장 시스템을 사용 하는 vivo에서 이미징 1 주, x SWCNT-안티-MALAT1 주입 하기 전에 평가 합니다.
    1. 1 x PBS와 신선한 15 mg/mL D 소를 준비 합니다.
    2. Isoflurane 기화 기 (유도 대 한 3-5% 및 유지 보수, 쥐의 상태에 따라 1-3%)와 마우스 anesthetize
    3. Intraperitoneally D 소 각 마우스에 150 mg/kg을 주사, 이미징; 하기 전에 5 분, 그런 다음는 스펙트럼 이미징 시스템 경향이 위치에 마우스를 이미지.
    4. 냉 광 채도 도달할 때까지 마우스 마다 2 분의 연속 이미지를 수집 합니다. D-소 글귀/신호에 따라 간격을 조정 합니다.
  3. CO2 를 사용 하 여 실험의 종료에 도달 하면 쥐를 희생.
  4. 이 MM 전파 모델 이므로, 쥐를 다음과 같이 처리 합니다.
    1. 해 부 하기 전에 마우스 무게.
    2. 완전 한 혈액 검사 (CBC) 분석 결과 혈액 세포 카운터 기계에 의해 수행에 대 한 마음에서 말 초 혈액을 수집 합니다. 백혈구와 적혈구의 뿐만 아니라 림프 톨의 비율은 기본 인덱스.
    3. 비장을 분리 하 고 그것의 무게. 비장/몸 무게;의 비율을 계산 고려 > 비장 확대로 0.5%.
    4. 골 수, 비장, 림프절, 신장, 조직 및 보이는 전이 함께 조직 수집 합니다.
    5. 마우스는 더 낮은 사지의 마비를 개발 하는 경우 척추를 수집 합니다.
    6. 골 수 샘플에서 RNA와 단백질을 추출 합니다.
    7. 포 르 말린에 모든 나머지 조직 수정.
    8. Decalcification, 정착의 24 h 후 5 일 동안 0.25 M EDTA 용액 (pH 8.0)에 뼈 샘플을 담가.
    9. 모든 샘플 장기 저장을 위한 75% 알코올에 담가.
  5. 두 그룹에 같은 시간 지점에서 luciferase의 신호 강도 비교 합니다. 두 그룹에서 각 마우스의 희생 날짜를 기록 하 고 소프트웨어와 함께 두 그룹의 생존 곡선을 계산 합니다.
    참고: 모든 절차는 그림 1에서 요약 된다.

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결과

안티 MALAT1 gapmer m M에서 DNA의 억제 효과 보여, 우리 MALAT1의 식을 무 너 뜨 하 고 H929 및 MM.1S 세포에 그것을 사용. 48 시간 후, 셀 눕 힘 효율성의 분석을 위해 수집 하 고 안티 MALAT1 gapmer 또는 컨트롤 DNA transfected 세포에 있는 apoptosis 상태. qRT-PCR 결과 안티 MALAT1 gapmer DNA 뜨 MALAT1 식 H929 및 MM.1S 세포에 효율적으로 나타났다 (그림 2A). Apoptosis의 상태 cytometry 아래로 MALAT1 크게 apoptosis 유도 공개에 의해 결정 되었다 (그림 2B).

이 ...

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토론

LncRNAs m M7,,89;를 포함 하 여 암에 수많은 생리 및 병 태 생리 절차의 규칙에 참여를 보이고 있다는 증거 그들은 센스 oligonucleotides20,,2122에 의해 실현 될 수 있는 암 치료에 대 한 타겟이 될 가능성이 있다. 미국 식품 및 의약품 안전 청 (FDA)는 세포 망막23, homozygous 가족성 콜레스테롤 혈 증24에 대 한 nusinersen mipomersen fomivirsen를 포함 하 여 여러 센스 oligonucleotide 약물 승인 척추 근육 위축

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자 러너 연구소 proteomic, 게놈, 및 그들의 지원에 대 한 이미징 코어를 감사 하 고 지원 합니다. 자금:이 작품 NIH/NCI 부여 R00 CA172292 (J.J.Z.) (J.J.Z.)을 창업 자금 및 임상 및 변환 과학 공동 (CTSC) 케이스 서쪽 예비 대학 코어 사용률 파일럿 부여 (J.J.Z.)의 의해 재정적으로 지원 되었다. 이 작품 활용 건강 SIG의 국가 학회 교부 금 1S10OD019972-01 자금 구입 했던 Leica SP8 confocal 현미경.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
SWCNTsMillipore-Sigma704113
DSPE-PEG2000-AmineAvanti Polar Lipids880128
bath sonicatorVWR97043-992
4 mL 원심 필터Millipore-SigmaZ740208-8EA
UV/VIS 분광분석기Thermo Fisher ScientificaccuSkan GO UV/Vis Microplate 분광광도계808nm에서 0.0465L/mg/cm의 흡광 계수
Sulfo-LC-SPDPProteoChemc1118
DTT 용액Millipore-Sigma43815
NAP-5 컬럼GE Healthcare17-0853-01
생체 내 이미징 시스템PerkinElmer
NOD. CB17-Prkdcscid/J 마우스Charles River lab250
유세포 분석기Becton Dickinso
LipofectamineInvitrogen11668019Lipofectamine2000
Fetal bovine serum (FBS)Invitrogen10437-028
RMPI-1640 mediumInvitrogen11875-093
MALAT1-QF:IDT에 의해 합성 회사5'- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3'
MALAT1-QR:IDT Company5'- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3'
GAPDH-QF :IDT Company5 '- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3 '
GAPDH-QR:IDT Company5'- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3'
SYBR Green PCR 마스터 믹스를 사용한 정량적 PCRThermo Fisher ScientificA25780
RevertAid first-stand cDNA 합성 키트Thermo Fisher ScientificK1621
anti-MALAT1synthesized by IDT Company5'-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T
*G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3'
세포 생존도 분석 키트Promega CorporationG7570CellTiter-GloLuminescent 세포 생존도 분석 키트
accuSkan GO UV/Vis 마이크로플레이트 분광 광도계Thermo Fisher Scientific
원심 필터Millipore-SigmaUFC910008
SPSS 소프트웨어IBM버전 24.0
D-LuciferinMillipore-SigmaL9504
에 의해 합성에 의해 합성 에 의해 합성됨 (영어)

참고문헌

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