여기에서, 우리는 마우스에 있는 잠/각성 상태의 감시 도중 뉴런의 특정 모형의 광유전학 조작의 방법을 기술합니다, 예를 들면 stria 말단의 침대 핵에 우리의 최근 일을 제시하.
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방법 논문
마우스에서 수면/각성 상태를 모니터링하는 동안 신경 회로의 광유전학 적 조작
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
최근 몇 년 동안, 광유전학널리 신경 과학 연구의 많은 분야에서 사용되어왔다. 많은 경우에, 채널 로독신 2(ChR2)와 같은 opsin은 다양한 Cre-driver 마우스에서 특정 유형의 뉴런 세포에서 바이러스 벡터에 의해 발현된다. 이러한 opsins의 활성화는 광학 케이블을 통해 레이저 또는 LED에 의해 전달되는 광 펄스의 응용 프로그램에 의해 트리거되며, 활성화의 효과는 매우 높은 시간 해상도로 관찰된다. 실험자는 쥐에 있는 행동 또는 다른 생리적인 결과를 감시하는 동안 신경세포를 급격하게 자극할 수 있습니다. 광유전학은 마우스에 있는 잠/각성 상태의 규칙에 있는 신경 회로의 기능을 평가하는 유용한 전략을 가능하게 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 마우스의 수면 단계를 평가하기 위하여 뇌전도 (EEG) 및 근전도 (EMG) 감시 도중 특정 화학 동일성을 가진 뉴런의 광유전학 조작의 효력을 검토하기 위한 기술을 기술합니다. 일례로, 우리는 줄무늬 말단의 침대 핵에 있는 GABAergic 뉴런의 조작을 기술합니다 (BNST). 이러한 뉴런의 급성 광유전학적 흥분은 NREM 수면 중에 적용될 때 깨어있는 것으로 급속한 전이를 유발합니다. EEG/EMG 기록과 함께 광유전학적 조작은 수면/깨어 상태를 조절하는 신경 회로를 해독하기 위해 적용될 수 있습니다.
서론
수면은 최적의 인지 기능에 필수적입니다. 최근 연구 결과는 또한 수면 장애가 광범위한 질병 1,2,3과관련이 있음을 시사합니다. 수면의 기능은 아직 크게 해결되지 않았지만, 수면/각성 상태를 제어하는 신경 회로 및 메커니즘을 이해하는 데 상당한진전이 최근 이루어졌다 4. 포유류에서는, 경계의 3개의 국가가 있습니다: 깨어, 비 급속한 눈 운동 (NREM) 잠 및 급속한 눈 운동 (REM) 잠. 깨어있는 것은 의도적이고 지속적인 운동 활동과 낮은 진폭의 빠른 EEG 진동 (5-12 Hz)을 특징으로합니다. NREM 수면은 의식 부족과 의도적인 운동 활동으로 높은 진폭 (델타 파)의 느린 진동 (1-4 Hz)에 의해 정의됩니다. REM 수면은 낮은 진폭과 거의 완전한 양측 근육 원반5의 비교적 빠른 진동 (6-12 Hz)을 특징으로합니다.
Borbely는 두 개의 프로세스 모델6,7로알려진 수....
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프로토콜
이 곳의 모든 실험은 NIH 지침을 준수하여 츠쿠바 대학의 동물 실험 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동물 수술, 바이러스 주입, EEG /EMG용 전극 및 광섬유 이식
주의 사항: 적절한 보호 및 취급 기술은 사용할 바이러스의 생체 안전 수준에 따라 선택되어야 합니다. AAV는 주입을 위해 격리된 P1A 등급의 방에서 사용해야 하며, AAV를 운반하는 튜브는 모든 부피가 소진된 후 오토클레이브로 멸균되어야 합니다. 수술 부위와 모든 이식 된 물질은 사용 중에 깨끗하고 멸균되어야합니다.
참고: 그림1을 참조하십시오.
- 오토클레이브로 수술 장비를 소독하십시오.
- 마취 기화기를 사용하여 이소플루란으로 마우스를 마취. 마우스가 원하는 마취 깊이에 도달 할 때까지 관찰, 집게로 꼬리를 꼬집어에 대한 응답의 손실에 의해 결정. 안과 연고를 눈에 바르면 건조하지 않도록 하십시오.
- 요오드 용액 또는 70 % EtOH (3x)로 수술 분야를 소독하고 충분히 건조하십시오. 수술이 수행되는 동안 바이러스가 얼음에 해동할....
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결과
본 연구는 수면 상태 전환에 GABABNST 뉴런의 광유전학적 흥분의 효과를 보였다. ChR2-EYFP는 BNST에서 GABA 뉴런에서 국구적으로 발현되었다. 내부 하이브리드화 운동 화학 연구는 ChR2-EYFPGAD 67 mRNA 신호를 발현 하는 뉴런에서 동국화 했다 보여주었다, 이들은 GABAergic 뉴런을 나타내는. 면역성 화학 적 슬라이스 샘플은 BNST25바로 위에있는 광섬유의 위치를 확인했습니다.
도 3A는 NREM 수면 동안 의 사진 자극 전후의 대표적인 EEG/EMG 트레이스를 나타낸다. EMG 신호가 없는 고전압 및 저속 EEG는 NREM 수면을 나타냅니다. 광자극(20초 동안 20Hz에서 10 ms 펄스)을 안정된 NREM 수면.......
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토론
우리는 여기에서 잠/각성의 국가 전환에 특정 화학 정체성을 가진 뉴런의 광유전학 자극의 효력을 평가하는 방법을 제시하고 GABABNST 뉴런의 조작의 보기를 주었습니다. 우리의 데이터는 GABABNST 뉴런의 광유전학 적 흥분은 NREM 수면에서 깨어있는 즉각적인 전환을 초래한다는 것을 보여주었습니다.
다양한 실험 설계는 광유전학 적 도구의 수많은 유형의 개발로 인해 사용할 수 있습니다. ChR2, SSFO, 할로호도신, ArchT 및 iChloC27과같은 다양한 종류의 옵신을 사용하여 특정 뉴런의 뉴런 활동을 활성화 또는 억제할 수 있다. ChR2는 광 자극 후 몇 밀리초 동안 뉴런을 활성화할 수 있으며, 이는 펄스 발생기에 의한 위상 잠금 방식으로 동작 전위를 불러일으켜 특정 수면 단계의 급성 영향을 조사하는 데 사용될 수 있습니다. 자극 후 15 내지 30분 동안 뉴런의 탈분극을 유도하는 안정.......
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공개 사항
이 프로젝트는 머크 & Co.에 의해 부분적으로 재정적으로 지원되었습니다.
감사의 글
이 연구는 머크 조사자 연구 프로그램 (#54843), 혁신적인 영역에 대한 과학적 연구를위한 KAKENHI 보조금 지원, "윌다이내믹스"(16H06401) (T.S.), 그리고 혁신적인 영역에 대한 탐사 연구를위한 KAKENHI 그랜트 인 에이드 (T.S.) (18H02595).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1x1 광섬유 로터리 조인트 | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | for optogenetics |
| 6핀 헤더 | KEL Corporation | DSP02-006-431G | |
| 6핀 소켓 | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D 컨버터 | Nippon koden | N/A | 아날로그-디지털 컨버터 |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70&타임스; 1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82× 1013(genomic copies/ml) | ||
| 암피실린 | 후지 필름 | 014-23302 | |
| 증폭기 | Nippon koden | N/A | EEG/EMG 기록용 |
| 마취 기화기 | 무로마치 | MK-AT-210D | |
| 자동 주입기 | KD 과학 | 780311 | |
| 카바이드 커터 | Minitor | B1055 | &파이; 0.7 밀리미터. 치과 드릴로 언급되며, 고속 로터리 마이크로 모터와 함께 사용됩니다. |
| 시아노아크릴레이트 접착력 (아론 알파 A) 및 가속 | Konishi | #30533 | |
| 치과 경화광 | 3M | Elipar S10 | |
| 에폭시 접착제 | Konishi | #04888 | 6핀 및 차폐 케이블의 솔더 주변 절연 |
| 광섬유 패치 코드(분기) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre 마우스 | . Kenji Sakimura 제공 | Cre recombinase 유전자는 Gad67 대립 유전자 | |
| Hamilton 주사기 | Hamilton | 65461-01 | |
| 고속 로터리 마이크로 모터 키트 | FOREDOM | K.1070 | 카바이드 커터 |
| 상호 연결 슬리브 | Thorlab | ADAF1 | . 2.5mm 세라믹 |
| 이소플루란 | 화이자 | 871119 | |
| 레이저 | Rapp OptoElectronic | N/A | 473 nm 파장 |
| 레이저 인테시티 검사기 | COHERENT | 1098293 | |
| 레이저 자극기 | 바이오 연구 센터 | STO2 | 텍스트에서 펄스 발생기로 참조됨 |
| 페룰이 있는 광섬유 | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| 패치 코드 | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m 길이, 레이저 간 레이저 도체 및 로터리 조인트 |
| pHelper | Stratagene | ||
| 광경화 치과 시멘트 | 3M | 56846 | |
| Serafin 클램프 | 스톨팅 | 52120-43P | |
| 차폐 케이블 | mogami | W2780 | EEG/EMG 기록용 6핀 소켓에 납땜 |
| 수면 기록 챔버 | N/A | N/A | Custum-made (21 cm× 29 cm × 19 cm) 물 탱크 홀더 |
| 포함 수면 표시 소프트웨어 | KISSEI COMTEC | N/A | EEG/EMG 분석 슬립 |
| 링 | neuroscience,inc | N/A | EEG/EMG 분석 |
| 스테인리스 스크류 | Yamazaki | N/A | φ 1.0 x 2.0 |
| 스테인레스 와이어 | 쿠너 와이어 | AS633 | 0.0130 인치 직경 |
| 입체 프레임 디지털 콘솔 | Koph | N / A | 모델 940 |
| 주사기 바늘 | Hamilton | 7803-05 | |
| EEG / EMG 기록 용 | KISSEI COMTEC | N / A |
참고문헌
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature? Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K.
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