여기는 vivo에서 쥐에 있는 태아의 분석에 대 한 높은 주파수 초음파의 기법에 설명합니다. 이 메서드는 태아의 속 행 및 placental 매개 변수 뿐만 아니라 임신에 걸쳐 임산부 및 태아 혈액 흐름의 분석을 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
초음파 이미징 인간과 동물 조직에서 기관 예외 및 종양을 검출 하는 데 사용 하는 광범위 한 방법입니다. 방법은 비-침략 적, 무해 한, 그리고 고통, 그리고 응용 프로그램은 쉽게, 빠르고, 모바일 디바이스와도 어디서 나 할 수 있습니다. 임신 중 초음파 이미징 standardly 면밀히 모니터 하는 태아의 개발에 사용 됩니다. 이 기술은 자궁내 성장 금지 (IUGR), 단기 및 장기 건강 결과와 어머니와 태아 둘 다에 대 한 임신 합병증을 평가 하기 위해 중요 하다. IUGR의 과정을 이해 하는 것은 효과적인 치료 전략 개발을 위한 불가결입니다.
이 원고에 사용 되는 초음파 시스템 작은 동물의 분석에 대 한 생산 하는 초음파 장치 이며 임신 연구를 포함 한 다양 한 연구 분야에서 사용할 수 있습니다. 우리가 자연 킬러 (NK) 세포/돛대 세포 (MC)에서 태아의 비보에 분석을 위한 시스템의 사용을 설명 하는 여기-성장 제한 새끼를 낳을 결핍 어머니. 시스템의 준비를 포함 하는 프로토콜, 전에, 측정, 그리고 B 모드의 사용 중 쥐의 처리, 컬러 도플러 모드 및 펄스 파 도플러 모드. 태아 크기, placental 크기 및 태아에 게 혈액 공급이 분석 되었다. 우리는 감소 이식 크기와 작은 반응과 중간 임신 이후에서 NK/MC-불충분 한 쥐에서 발견. 또한, MC/NK-결핍 결 석 연관 되었다 고 태아 지 umbilicalis(우) 및 높은 저항 인덱스에서 끝 확장기 흐름 반전. 프로토콜에서 설명 하는 방법 관련 및 비-관련 연구 주제에 대 한 쉽게 사용할 수 있습니다.
서론
초음파는 이상 인간의 귀, 약 20 kHz1보다 더 높은 가청 범위 주파수를 가진 음파 이다. 동물 처럼 박쥐, 웨일즈, 돌고래2,3, 쥐4,5, 쥐 그리고 쥐 여우 원숭이6 모든 방향이 나 통신에 대 한 초음파를 사용 하 여. 인간은 여러 가지 기술 및 의료 응용 프로그램에 대 한 초음파의 활용. 초음파 장치는 사운드 웨이브를 만들고 배포 하 고 신호를 나타내는 수 있습니다. 초음파 발생 하면 장애물, 소리 반사, 흡수 또는 그것을 통해 갈 수 있다. 초음파, 불리 한 이미징 방법으로 초음파의 응용 프로그램은 인간의 유기 조직 또는 마음 (심장 초음파)7,8, 폐9, 상선10 같은 수의학의 분석에 사용 되 ,11신장 및 비뇨 기 및 생식 책자12,13; 담 석14 및 종양15; 검색 그리고 혈관 이나 장기16,17의 관류를 평가. 초음파는 임신 중 태아 치료에 표준 방법 그리고 태아 발달 장애 또는 일찍 인식 될 수 있다. 특히, 태아의 성장 밀접 하 게 인식 가능한 IUGR를 정기적으로 모니터링 합니다. 마지막으로, 태아 혈이 성장을 제한18,19,,2021지적 수로, 모니터링할 수 있습니다.
방사선 같은 다른 방법에 비해 초음파 이미징의 주요 이점은 분석 조직의 사운드의 harmlessness 이다. 이 간단 하 고 빠른 방법은 비-침략 적, 고통, 그리고 수를 여러 번 사용. 초음파 장치의 초기 지출 비싸요; 그러나, 필요한 소모 재료는 저렴 한. 이 원고에 사용 하는 초음파 시스템은 다양 한 동물 모델에 대 한 적합 한 (즉, 쥐와 생선) 인 간에 대 한 초음파 장치는 3-15 m h z의 주파수를 필요, 15-70 mHz의 주파수는 마우스에 대 한 필요.
현재 원고 B 모드, 컬러 도플러 모드 및 펄스 파 도플러 모드의 사용에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 설명은 마우스 뿐 아니라 성능, 데이터 수집 및 저장의 준비를 포함 한다. 이 방법은 성공적으로 적용 된 다른 마우스 긴장 전혀 임신 일 되었으며 태아 및 태 반 개발 뿐만 아니라 산 모와 태아 혈액 매개 변수를 조사 하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 모든 응용 프로그램 임신 MC/NK 결핍 및 제어 마우스를 사용 하는 우리의 연구에 따라 설명 되어 있습니다.
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프로토콜
여기서 설명 하는 모든 방법에 의해 승인 된 "Landesverwaltungsamt 뉴 스타트 인섹 센 안할트: 42502-2-1296UniMD."
1. 실험 절차
- 6 8 주 오래 된 여성 MC 불충분 한 C57BL/6J-Cpa3-친구Cre /+ (Cpa3Cre /+) 생쥐와 엠씨 충분 한 C57BL/6J-Cpa3+/+ (식민지 컨트롤; Cpa3+/+) BALB/c 남성.
- 임신 일 (gd) 0 질 플러그의 확인 후 정의 하 고 여성 플러그 확인 후 즉시 치료.
참고: 플러그는 여자의 질 구멍에 남자의 정자 이다.- PBS 제어 Cpa3에서 intraperitoneally+/+ 의 250 µ L를 주사 여성.
- Intraperitoneally 엠씨 불충분 한 Cpa3에서 안티-CD122 (0.25 mg)의 250 µ L를 주사Cre /+ 여성.
참고: 안티-CD122의 0.25 밀리 그램의 주사 depletes 주변 NKs와 엠씨 불충분 한 Cpa3에서 uNKsCre /+ 여성 앞에서 설명한22.
- Gd5 때까지 기다립니다.
참고: gd5에 있다 주입 분석에 대 한 초기 가능성.- 초음파 분석에 대 한 2-5 단계를 진행 합니다.
- Gd5에서 초음파 이미징 수행 8, 10, 12, 및 14.
2입니다. 초음파 시스템의 준비
- 시스템 설정 (그림 1A; 뒤로 컴퓨터에 주 전원 왼쪽된 사이트에서 대기), 온수 플랫폼 (그림 1B; 컨트롤 패드에서), 그리고 따뜻한 젤 (그림 1C).
참고: 초음파 젤 약 0.5 h까지 따뜻하게 해야 합니다. - Isoflurane 단위 충분히 채워 확인 하십시오 (그림 1D).
- 브라우저에서 기존 연구에서 새로운 연구 또는 새로운 시리즈 를 엽니다. 필요한 모든 정보 (소유자, 연구 이름, 계열 이름, 동물 데이터) 연구 정보 창에서 입력 합니다. 확인을 클릭 합니다.
- 확인을 클릭 하면 확인 B 모드 이미지 창이 나타납니다 B 모드에서 이미지를 자동으로 시작 됩니다.
3. 마우스 처리
- 마우스의 anesthetization
- 최저의 상자 (그림 1E)에 마우스를 놓고, 상자를 닫습니다, 그리고 isoflurane 튜브 최저의 상자를 열고 isoflurane (농도 3.5%)에 설정 합니다.
- 때 마우스 마 취, (낮은 농도 1.5%)와 난방 플랫폼의 방향에서 튜브를 열어서 isoflurane 흐름을 리디렉션 이며 최저의 상자 흐름을 닫습니다.
참고: 충분 한 마 취를 도달 하는 추가 10 기다릴 s 마우스는 더 이상 이동 후. - 등 쪽 위치에 난방 플랫폼 (그림 1 층)에 녹아웃 상자에서 신속 하 게 마우스를 전송 하 고 부드럽게 플랫폼 상단에 위치한 마 취 코 튜브에 그것의 코를 배치 합니다.
- 고정, 탈모, 및 측정에 대 한 마우스의 준비
- 눈 보호 장소 건조 한 눈을 방지 하기 위해 마우스의 각 눈에 크림.
- 각각의 온수 플랫폼 (그림 1 층)에 4 개의 구리 영역에 전극 젤의 한 방울을 배치 합니다.
- 외과 테이프 난방 플랫폼의 전극 젤 코팅 분야에 발을 누릅니다.
- 심전도 확인 [최적의 값 = 450-550 박동/분 (BPM)]과 항상 호흡 생리학.
참고: 직장 프로브를 사용 하 여 신체 온도 측정은 가능 하지만 필요 하지 않습니다. - 장소 depilatory 크림 마우스의 복 부에, 맛사지 크림 면봉 및 대기 약 1 분 물에 젖은 압축으로 크림을 제거 합니다. 모든 머리는 사라 졌 어 요 경우이 단계를 반복 합니다.
- 미리 데워 진된 초음파 젤 depilated 피부에 적용 됩니다.
4. 측정 및 이미지와 동영상의 수집
- 손에서 트랜스듀서 (그림 1G) 또는 지주 장치에 그것을 클램프 (그림 1 H; 장치 권장 들고).
- 변환기와 방광을 식별 하 고 참조 지점으로 사용. 추적 implantations 복 부의 왼쪽 및 오른쪽 사이트에 변환기를 이동 합니다.
- 2D 회색 음영 이미지에 해 부 구조의 시각화를 위한 B 모드
- 변환기를 이동 하거나 플랫폼 테이블 마우스 집착된 첫 번째 이식 최대 크기로 화면에 표시 될 때까지 열 합니다.
- 이미지 레이블 을 선택 하 고 단일 프레임, 또는 씨 네 스토어 전체 이식 측정을 위한 cineloop를 저장 하는 이름 또는 프레임 스토어 (이름 없이 저장) 입력.
- 변환기 또는 태 반 혈은 UmA에서 표시 위치를가지고 테이블을 이동 합니다. 단일 프레임 또는 cineloop (단계 4.3.1.1 참조) placental 측정.
참고: Placental 측정 이후 gd10에서 가능 하다. - 모든 implantations 동일한 방법을 사용 하 여 계속 합니다.
- 변환기를 이동 하거나 플랫폼 테이블 마우스 집착된 첫 번째 이식 최대 크기로 화면에 표시 될 때까지 열 합니다.
- 컬러 도플러 모드 시각화 하 고 혈액의 흐름의 방향을 결정합니다
- 색 단추를 누릅니다.
- 색 상자 이동 (이 지역에서 신호 표시 됩니다) 트랙볼을 사용 하 여 필요한 위치에. 필요한 경우 업데이트 를 눌러 상자의 크기를 변경 하 고 트랙볼을 이동 (오른쪽/위쪽에 큰 =, =는 왼쪽 측면/아래쪽에 작은). 상자는 적당 한 크기, 선택누릅니다.
- 4.3.1.1 단계에 설명 된 대로 단일 프레임 또는 cineloops를 저장 합니다.
- 지 uterina (자 궁 동맥, UA)에 혈관을 통해 혈액의 흐름을 계량 펄스 파형 (PW) 도플러 모드 및 UmA
- 컬러 도플러 인수에 관심 영역을 찾습니다.
참고: UA는 꼬리, 방광에 있으며는 UmA은 태아와 태 반 사이 위치 합니다. - 비밀 번호, 언론과 파선 표시 됩니다. 이 줄의 혈관을 이동 하 고 혈액의 흐름에 맞춰 "도플러 각도" 노브를 사용 하 여 라인의 각도 조정. 업데이트를 누릅니다.
참고: 변환기와 혈액 흐름의 방향 사이의 각도 일치 해야 모든 동물에서 보다 큰 60 °의 각도 사용 하는 경우에 특히 (여기, UAs 70 °와 45 ° UmAs 사용). - PW 도플러 수집 창에 나타나는 도플러 라인의 cineloop를 저장 합니다.
- 컬러 도플러 인수에 관심 영역을 찾습니다.
5. 검토 및 데이터 수집을 완료 하 고 저장 하는 일련
- 데이터를 검토 하려면 누릅니다 연구 관리. 관심의 축소판 이미지를 스크롤한 업데이트를 두 번 클릭 합니다.
- 먼저 연구 관리 누른 다음 누릅니다 가까운 브라우저 창에서 데이터 수집을 저장 기록된 시리즈.
참고: 시리즈를 닫은 후 아니에요이 시리즈에서 프레임 또는 cineloops를 더 이상 저장할 수 없습니다.
6입니다. 마우스 다음 데이터 수집 처리
- 건조 압축의 도움으로 anaesthetized 동물에서 젤을 제거 합니다.
- 발에서 신중 하 게 수술 테이프를 제거 합니다.
- Isoflurane 튜브 (농도 0%)를 닫습니다.
- Gd5에서 다음 초음파 분석 진행 8, 10, 12.
- 장소는 동물 혼자 5 분의 최소 장에 그래서 그것이 일어나 고 찾으시는 시간.
- 원래 장에 다시 마우스를 놓습니다.
참고: 끄지 마십시오는 isoflurane 젤과 외과 테이프를 제거 하기 전에 마우스를 매우 빠르게 일어 났로 서 (약 20 s)는 isoflurane 해제 후.
- Gd14에서 다음 초음파 분석 진행.
- 자 궁 경부 전위에 의해 깨어나 전에 여성을 희생. 동물, 자 궁을 제거, 태아와 반응과, 열고 태아 및 태 반 무게를 측정 합니다.
7. 복사 및 데이터 가져오기
- 내보내기를 클릭 하 여 하나 이상의 계열을 표시 하 고 하드 디스크에 데이터를 복사 하려면 저장 공간을 선택 합니다.
- 컴퓨터에 소프트웨어 및 복사에서 를 클릭 열고 선택 연구/시리즈 소프트웨어 연구/시리즈를 가져오는 하드 디스크에서.
- 소프트웨어와 데이터를 분석 합니다.
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결과
이 원고에 사용 되는 초음파 시스템의 개별 구성 요소는 그림 1에 나와 있습니다. 그림 2 는 대표 초음파 이미지 획득 B 모드에서 gd5, 8, 10, 그리고 12 (B) 및 해당 이식 영역 측정 결과 (A)의 중요 한 감소 주입 영역을 보여주는 안티 CD122 처리 Cpa3Cre / + gd10 이후에서 쥐.
그림 3 쇼 (decidua basalis, 태 반, 태아)는 이식의 단일 부품 B 모드 (그림 3A)에 인수, placental 측정 (지역, 두께, 직경) co...
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토론
우리의 초음파 시스템을 사용 하 여, 우리 시연 했다 태아 성장 제한 MC/NK 불충분 한 어머니에서 gd10에서에. 또한, gd10 및 12, 우리가 관찰 감소 placental 차원, 그리고 gd14에서 부재 또는 uMC/uNK 불충분 한 쥐의 일부 태아의 UmAs 끝 확장기 흐름의 복귀. 이 기호의 가난한 vascularization IUGR를 나타내는 동맥의 중요 한 저항 인덱스와 연관 되었다. 결과 임신과 태아 복지에 고 IUGR의 과정 이해에서 uMCs와 uNKs의 중요 한 역할을 확인 합니다.
프로토콜은 해당 임신 매일에서 gd5에서 이후 (후 이식). 고려 되어야 하는 프로토콜의 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 머리 제거는 신중 하 게 수행 되어야 합니다. 예를 들어 과도 한 접촉 탈모 크림을 피부 자극을 발생할 수 있습니다. 그러나, 불완전 한 머리 제거 신호 간섭 표시 화면에 그림자로 이끌어 낸다. (그림자 또는 낟 알 사진) 부족 한 신호에 대 한 또 ...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
많은 악기 이미징 회사 (특히 하 막달레나 스타 이너, 카트린 Suppelt, 산드라 메이어) 쾌적 하 고 빠른 지원에 대 한 신속 하 고 완전히 이미징 시스템 및 그것의 사용에 관한 우리의 모든 질문에 응답 하기 위한 감사 합니다. 우리는 Cpa3 식민지를 제공 하기 위한 교수 한스 Reimer Rodewald와 박사 Thorsten 파이어아벤트 (DKFZ 하이델베르크, 독일) 감사. 또한, 우리 감사 스테파니 Langwisch, 누가 마우스 식민지 담당 이었고 누가 그림 1에서 그림을 생성 합니다.
작업 및 이미징 시스템 교부 금에 의해 도이치 가운데 (DFG)에서 A.C.Z. (ZE526/6-1과 AZ526/6-2)에 DFG 우선 프로그램 1394 "돛대 세포 건강과 질병."에 포함 된 프로젝트를 했다 투자 했다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| LEAF anti-Maus CD122 (IL-2Rb) | BioLegend | 123204 | Klon TM-β 1; 500 &마이크로; g |
| Vevo 2100 시스템 | 후지필름 비주얼소닉스 Inc. | 트랜스듀서 MS550D-0421 | |
| Vevo LAB 소프트웨어 | 후지필름 비주얼소닉스 Inc. | ||
| 이소플루란 | 박스터 | PZN: 6497131 | |
| 전극 젤 | 파커 | 12_8 | |
| 서지컬 테이프 | 3M 트랜스포어 | 1527-1 | |
| 아이 크림 | 바이엘 | PZN: 1578675 | |
| 코튼 팁 애플리케이터 | Raucotupf | 11969 | 100개 |
| 제모 크림 | Reckitt Benckiser | ||
| 압축 | Nobamed Paul Danz AG | 856110 | 10 x 10 cm |
| 초음파 젤 | Gello GmbH | 246000 |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
