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방법 논문

Photoactivatable 태그 갇힌된 분자 접착제를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 spatiotemporally 제어

10.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58631

⸱

2019년 1월 17일

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering, University of Tokyo, 2Riken Center for Emergent Matter Science

이 논문에서

요약

이 프로토콜에 갇힌된 분자 접착제 태그를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌를 빛 트리거 설명 합니다. 이 방법은 사이트 선택적 핵 타겟팅 약물 전달에 대 한 약속입니다.

초록

세포 핵 하나 가장 중요 한 세포의 subcellular 마약 배달 대상으로 유전자 복제의 이후 이며 식 다양 한 질병 치료에 효과적입니다. 여기, 우리를 사용 하 여 고객님의 핵 전 좌 빛 트리거 갇힌 분자 접착제 (갇힌접착제-R) 태그, 그 여러 guanidinium 이온 (+번) 펜 던 트 (낙 산 염 대신 음이온 photocleavable 그룹에 의해 보호 됩니다 설명 nitroveratryloxycarbonyl; 바 NVOC)입니다. 우리에 갇힌접착제-R 태그로 손님을 생활 고려 통해 endocytosis 세포 및 endosomes. 그러나, photoirradiation, 시 우리에 갇힌접착제-R uncaged 분자 접착제 (Uncaged접착제-R) 여러 번+ 펜 던 트를 들고 endosomal 탈출 및 손님 들의 후속 핵 전 좌 용이로 변환 됩니다. 이 방법은 사이트 선택적 핵 타겟팅 약물 전달에 대 한 약속 때문에 태그 손님 세포질 세포 핵 다음으로 마이그레이션할 수 있습니다 경우에만 photoirradiated. 갇힌 접착제-R 태그는 작은 분자 손님 뿐만 아니라 고분자 손님 양자 점 (QDs) 등을 제공할 수 있습니다. 갇힌 접착제-R 태그는 자외선 뿐만 아니라 조직에 깊이 침투 수 2 광자 근처-적외선 (NIR) 빛으로 갇힌 수입니다.

서론

유전 정보를 전달, 세포 핵 하나 가장 중요 한 세포의 subcellular 마약 배달 대상으로 유전자 복제의 이후 이며 식 암 등 다양 한 질병 치료에 효과적 이며 유전 장애1,2,3. 약물의 핵 전달, 펩 티 드의 활용 태그 같은 핵 지 방화 신호 (NLS)4,,56 광범위 하 게 조사 되었습니다. 그러나, 원치 않는 부작용을 줄이기 위해 핵 전 좌의 spatiotemporal 제어 필요 하다.

이전, 빛-트리거 전 좌 단백질의 세포 핵에 갇힌된 NLS7,,89를 사용 하 여 달성 되었습니다. NLS 세포질 수송 단백질6에 바인딩하여 세포 핵으로 마이그레이션합니다. 보고 방법에 갇힌된 NLS 베어링 이용 단백질 직접 microinjection8 세포질에 통합 또는 유전자 코드 확장 기법9를 사용 하 여 대상 셀에 표현. 따라서, 세포질 통풍 관 및 사진 유도 핵 전 좌를 얻을 수 있는 방법을 실용적인 응용 프로그램에 대 한 유리 하다.

여기, 우리 수지상 갇힌된 분자 접착제 (우리에 갇힌접착제-R, 그림 1) 태그를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 빛 트리거 설명 합니다. 수용 성 분자 접착제10,11,12,13,14,15,16,,1718 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 여러 번+ 펜 던 트 베어링 이전 개발 되었습니다는 단단히 단백질11,12,13,,1415, 준수 16,17, 핵 산18,,1920, 인지질 막21및 찰 흙 nanosheets22,23 통해는 그들의 구+ 펜 던 트 및 대상에 oxyanionic 그룹 사이의 여러 염 다리의 형성. 우리에 갇힌접착제-R의 구+ 펜 던 트 음이온 photocleavable 그룹, 낙 산 염 대체 nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC)에 의해 보호 됩니다. 우리에 갇힌접착제-R 태그로 손님을 생활 고려 통해 endocytosis 및 endosomes (그림 2)에서 세포. Photoirradiation에 바NVOC 그룹의 우리에 갇힌접착제-R는 uncaged 분자 접착제 (Uncaged접착제-R) 여러 번+ 펜 던 트를 들고 다음 태그 이용의 마이그레이션을 용이 하 게 하를 떨어뜨려합니다 에 세포질 세포 핵 (그림 2)에 의해 따라. 우리에 갇힌접착제-R 태그는 UV 또는 심각한 phototoxicity 없이 2 광자 근처-적외선 (NIR) 빛에 노출에 의해 갇힌 수입니다. 양자 점 (QDs) 및 형광 염료 (nitrobenzoxadiazole;를 사용 하 여 우리에 갇힌접착제-R 태그, 작은 분자의 손님 뿐만 아니라 고분자 손님 spatiotemporally 제어 핵 전달 설명 NBD), 예제로 각각.

figure-introduction-1
우리에 갇힌접착제-R.의 도식 구조를 그림 1: 9 guanidinium 이온 (+번) 펜 던 트 우리에 갇힌접착제-R의 낙 산 염 대체 nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) 그룹에 의해 보호 됩니다. BANVOC 그룹은 UV 또는 2 광자 NIR 빛 조사에 의해 죽 습. 우리에 갇힌접착제-R의 초점 핵심은 공업화 nitrobenzoxadiazole (NBD) 또는 dibenzocylooctyne (DBCO). 참조20허가 매 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-introduction-2
그림 2: 고객님의 핵 전 좌 빛 발생의 개요 그림 우리에 갇힌접착제-R 태그 활용. 손님이우리에 갇힌접착제-R 공액 생활으로 채택 / 셀 통해 endocytosis. Photoirradiation에 우리에 갇힌접착제-R 태그는 태그의 endosomal 탈출을 용이 하 게 수 한 Uncaged접착제-R 태그를 감 금. 그 후, 태그 이용 세포 핵으로 마이그레이션합니다. 참조20허가 매 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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프로토콜

1. 준비 갇힌접착제-R와 함께 고객님의 태그

  1. 우리에 갇힌접착제 NBD 솔루션을 준비 합니다.
    1. 우리에 갇힌접착제-NBD (그림 1) 다음 절차를 앞에서 설명한20음성 합성.
    2. 우리에 갇힌접착제-NBD (10mm) 건조 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 재고 솔루션을 준비 합니다.
      참고: 어둠 속에서 재고 솔루션을 저장 합니다. 솔루션은 수성 버퍼 또는 셀 문화 미디어 사용 시 희석 수 있습니다.
  2. 우리에 갇힌접착제-qd는 솔루션을 준비 합니다.
    1. 우리에 갇힌접착제-dibenzocylooctyne (우리에 갇힌접착제-DBCO)를 합성 (그림 1)20을 설명한 이전 절차에 따라.
    2. 우리에 갇힌접착제-DBCO (10 mM) 건조 DMSO에의 재고 솔루션을 준비 합니다.
    3. 우리에 갇힌접착제-QD의 준비를 위해 먼저 아 지 드 기능성된 QDs (아 지 드-QD; 준비 그림 3)입니다. DMF의 400 µ L를 100 µ L 아 지 드-PEG4-NHS 에스테 르 (그림 3)의 디 메 틸 formamide (DMF, 125 µ M) 솔루션의 추가 (500 nM) 아민 기능성된 페그 (아민-QD; 코팅 양자 점 (QDs)의 솔루션 그림 3)입니다. 실 온에서 1 h에 대 한 혼합물을 저 어.
    4. 재생된 셀 룰 로스 막 3500 분자량 컷오프 (MWCO)와 함께 사용 하 여 DMF의 800 mL에 대 한 24 시간에 대 한 결과 솔루션 dialyze
    5. 우리에 갇힌접착제-DBCO 50 µ m와 DMF의 재고 솔루션을 희석. 포스트 투 석 해결책 (그림 3)에 솔루션의 200 µ L을 추가 하 고 실 온에서 3 h에 대 한 혼합물을 저 어.
    6. 재생된 셀 룰 로스 멤브레인 (25000 MWCO)를 사용 하 여 DMF의 800 mL에 대 한 24 시간에 대 한 결과 솔루션 dialyze
    7. 200 결과 솔루션을 희석 DMF nM.

figure-protocol-1
그림 3: 우리에 갇힌접착제-QD의 준비의 회로도 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 현미경 관찰 Hep3B 세포 샘플의 준비

  1. 이 글의 최소한의 필수 매체 (EMEM) 포함 하는 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 37 ° C에서 5% 미만에서 인간의 간세포 암 Hep3B 세포 유지 CO2.
  2. 씨 셀 실험 전날입니다. EMEM에 8 연 발 유리 기판의 당 씨 5.0 × 103



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결과

Photoirradiation, 전에 우리에 갇힌접착제 NBD와 incubated Hep3B 세포 전시 그들의 내부에서 punctate 형광 방출 (λext = 488 nm; 그림 4A 고 4 C, 녹색). 유사한 현미경 사진 543에서 여기에 얻은 우리에 갇힌접착제 NBD는 endosomes에 지역화 나타내는 빨간색 형광 염료 (그림 4B , 4c, 빨간색)에 대 한 nm. 따라서, 형광 방출 우리에 갇힌접착제-NBD (그림 4D, 녹색)에 할당할 수 Hoechst 33342와 가시화 했다 세포 핵 밖에 서 관찰 되었다 (λext = 7...

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토론

빛-트리거 전 좌 단백질의 세포 핵으로의 이전 조사 갇힌된 NLS7,,89를 사용 하 여 달성 되었습니다. 앞에서 설명 했 듯이, 이러한 방법을 세포질에 NLS 태그 단백질 통합을 추가 기술 해야 합니다. 반면, 우리의 우리에 갇힌접착제-R 태그 사진 유도 핵 전 좌 뿐만 아니라 손님 들의 세포질 통풍 관을 수 있습니다. 이 우리에 갇힌접착제-R 태그 기능은 vivo에서 응용 프로그램에 대 한 유리입니다.

우리에 갇힌접착제-R 태그 세포 핵에 QDs 같은 고분자 손님을 제공할 수 있습니다. QDs 여기 고용은 더 큰 직경에서 (DH = 15-20 nm) 핵 숨 구멍 보다 (~ 5 nm)24...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 NanoBio 통합, 도쿄의 대학에 대 한 중심을 인정합니다. 이 작품은 특정 여 대 한 젊은 과학자 (B) (26810046)를 ko로 부분적으로에서 및 지원 특정 특별히 승진 연구 (25000005)에 대 한 T.A. R.M. 덕분에 일본 사회 연구 장학 과학 (JSP의 승진에 대 한 ) 젊은 과학자와 최고의 대학원 (GPLLI) 프로그램에 대 한.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Azide-PEG4-NHS 에스테르클릭 화학 도구AZ103
Q-dot 655 ITKInvitrogenQ21521MP
재생 셀룰로오스 멤브레인 (MWCO 3,500)NIPPON GeneticsTOR-3K
재생 셀룰로오스 멤브레인 (MWCO 25,000)하버드 장치7425-RC25K
Hep3B 세포ATCCHB-8064
8챔버 유리 기판Nunc155411JP
96웰 배양 플레이트Nunc167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)Thermo Fisher Scientific10370-021
소 태아 혈청(FBS)GE HealthcareSH30406.02
Dulbecco의 인산 완충액 식염수(D-PBS)Wako Pure Chemical 산업: 045-29795
LysoTracker RedLonza WalkersvillePA-3015
Hoechst 33342DojindoH342
Cell Counting Kit -8DojindoCK04
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경Carl-ZeissLSM 5102 광자 여기 레이저 장착 (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경LeicaTCS SP8
크세논 광원Asahi SpectraLAX-102
Microplate reader분자 장치SpectraMax 패러다임

참고문헌

  1. Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
  2. Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
  3. Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
  4. Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
  5. Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
  6. Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
  7. Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
  8. Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
  9. Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
  10. Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
  11. Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
  12. Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
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  14. Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
  15. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
  16. Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
  17. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
  18. Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
  19. Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
  20. Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
  21. Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
  22. Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
  23. Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
  24. Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
  25. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  26. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

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