다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지

Summary

우리는 봄에는에 셀 무료 유전자 식 실험을 수행 하기 위해 사용 될 수 있는 표면에 유전자 길이 DNA 분자의 동원 정지에 대 한 간단한 석판 절차를 설명 합니다.

Abstract

있고 구조화 된 표면에 유전자의 동원 정지에 오픈 미세 생물 반응 기 시스템에서 식 프로세스를 compartmentalized 유전자의 연구 수 있습니다. 인공 세포 시스템으로 다른 접근, 달리 등 설치 유전자 표현 시 약 및 동시 배출 폐기물의 지속적인 공급에 대 한 수 있습니다. 이 동적 유전자 규정 피드백 시스템의 실현을 위한 중요 한 시간의 연장된 기간 동안 셀 무료 유전자 식 프로세스의 구현을 지원 합니다. 여기 우리 기술을 사용 하 여는 사용 하기 간단 석판 DNA 가닥 변위 반응에 따라 독점적으로 상업적으로 사용 가능한 구성 요소를 사용 하 여 유전 봄에는 제작에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 우리 또한 제공 하는 프로토콜 compartmentalized 유전자의 통합에입니다 (PDMS)-미세 시스템을 기반으로. 또한, 우리는 시스템 DNA와 식 믹스에 포함 된 분자 사이 분자 상호 작용의 직접적인 관측을 위해 사용 될 수 있는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경과 호환 되는지 보여줍니다.

Introduction

세포-유전자 발현 반응 생화학, 생명 공학, 및 합성 생물학에 다양 한 응용 프로그램에 대 한 큰 관심은 무료. 단백질 세포 자유로운 표현의 구조 생물학에서 수많은 연구를 위한 기초를 했다 순수 단백질 견본의 준비를 위한 수단이 되었다. 예를 들어, 셀-무료 시스템 성공적으로 어려운 셀 기반으로 식을 사용 하 여 생산 하는 단백질 단지¹ 또는 막 단백질²의 식에 사용 되었다. 특히, 셀-무료 유전자 발현 반응 했다 또한 1961³Nirenberg 그리고 Matthaei에 의해 획기적인 실험과 함께 시작 하는 유전 코드의 구조를 명료 하 게 하는 데 사용 됩니다.

최근, 생명 공학 및 합성 생물학^4,,56셀 자유로운 방법에 관심을 갱신된 되었습니다. 셀-무료 시스템 비 생물학 화합물, 증강 될 수 및 다양 한 생물학 근원의 부품을 보다 쉽게 결합 될 수 있다⁷. 비록 셀 무료 시스템 명백한 단점은 "성장 하 고 분할" 하지 않습니다, 그것은 오픈 셀 무료 bioreactors 기본적인 신진 대사 기능을 준비 하 고 합성 대사 간단한 탄소 및 에너지 제공 하는 때 그들을 입력⁸. 합성 생물학의 신흥 분야, 내 셀 무료 시스템 예측 "섀시" 구현 위한 합성 생물학 기능 되도록 약속 드립니다.

현재, 셀-무료 유전자 식 반응 중 하나를 사용 하 여 수행 됩니다 (다른 소스에서 박테리아, 효 모, 곤충 등), 셀 추출 또는 다른 응용 프로그램 (예를 들어, 최적화 된 전사/번역 시스템 간결한 대 진 핵 유전자 식, 막 단백질 등의 생산). 세균성 세포 추출 물 (일반적으로 TXTL에 게 불리는)의 준비에 대 한 인기 있는 프로토콜 V. Noireaux와 동료^9에의해 최근 제공 했다. 생물 속성 철저 하 게 특징이¹⁰, 그리고 TXTL 시스템은 이미 성공적으로 사용 되어 일련의 복잡 한 생 화 확 적인 작업을 수행 하기 위해: 예를 들어, 을 통해 기능 살 균 소의 어셈블리 셀-무료 식 살 균 소 게놈¹¹, 세균성 단백질 필 라 멘 트¹², 합성 또는 셀 무료 유전자 회로^13,14의 구현입니다.

셀-무료 합성 생물학에서 인기 있는 또 다른 시스템은 정화 부품^15,16에서 재구성 순수한 시스템. TXTL 시스템에 비해, 그것은 포함 하지 않는다 nucleases 또는 단백질 저하 기계. 동안 선형 DNA의 저하, RNA 분자 또는 단백질은 문제점의 더 적은 순수한 시스템에서 충 경로 실제로 동적 기능 구현에 대 한 중요 한. (RecBCD)를 통해 TXTL 시스템에서 선형 유전자 템플릿의 exonuclease 저하의 영향을 줄이기 위해 최종 보호 GamS 단백질을 추가할 수 있다. TXTL와 순수 시스템 모두 상업적으로 사용할 수 있습니다.

주제를 밀접 하 게 관련 셀 무료 생물학 문제에 생 화 확 적인 반응에 구획의 효과 및 추가 인공 세포와 같은 구조 또는 protocells^{17,18,19의 창조의 연구 ,20}. 인공 세포에 대 한 연구는 일반적으로 내부 기공을 구획 인지질 또는 다른 amphiphiles에서 만든 생 화 확 적인 반응 시스템의 캡슐화를 포함 한다. 동안 이러한 시스템 구획의 근본적인 측면 또는 cellularity 각자 복제의 출현을 탐구 하는 데 도움이, 그들은 폐쇄 시스템의 일반적인 문제를 직면 하는 것: 작동 물질 대사 및 적절 한 부재에 막 전송 메커니즘, 그것은 한정된 반응 시간의 연장된 기간에 대 한 실행을 계속 하기 어려운-연료 분자 사용 되 고 폐기물 축적.

이러한 셀을 흉내 낸 구획 내부 구획에 흥미 있는 대안 photolithographic 방법을 사용 하 여 유전 물질의 공간 조직 이다. "칩에 유전자"의 동원 정지 바이 츠만 연구소에 바-Ziv 그룹으로 10 여 년 전 개척 했다²¹. 주요 문제를 확인할 수 있도록 했다 중 DNA의 일반적인 흡착 및 칩 표면에 단백질의 잠재적인 변성 했다. 바-Ziv 외. "데이지", immobilization 이산화 규소 표면에 저항 분자의 긴 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 스페이서 보장에 대 한 반응성 터미널 실 란의 구성 되었다 불리는 전용된 사진 평판 저항 개발 생체 적합성, 그리고 방사선 자외선 (UV) 빛에 따라 반응 아민으로 개조 되었다 photocleavable headgroup. 그것은 데이지 유전자 길이 DNA 분자 (몇 킬로 기본적인 쌍 (kbp)의 길이)와 칩 표면에 고정 하는 데 사용 될 수 표시 되었습니다. 고분자 물리학의 관점에서 시스템 고체 기판에 융합 하는 고분자 브러쉬 표시. DNA의 전해질 특성상 이러한 브러시의 구조는 삼 투 및 기타 이온 특정 효과^22,23강력 하 게 영향을.

가장 중요 한 것은, 그것은 기판 움직일 유전자 여전히 작동 하 고 베낀 고로 번역 해 RNA와 단백질 수 표시 되었습니다. 유전자 브러쉬 솔루션²⁴에서 RNA polymerases 액세스할 수 있습니다 그리고 녹음/번역의 복잡 한 고분자 혼합물은 표면에 변성 되지. 기판에 유전 구성의 동원 정지의 장점 중 하나는 그들은 작은 선구자 분자와 어떤 폐기물 제거²⁵ 수에서 지속적으로 제공 하는 열린 미세 반응 기 시스템에서 동작할 수 있습니다. ^{, 26}.

우리는 최근 변종 (생체 전자 빔 및 감광 제)에 대 한 Bephore²⁷, 상업적으로 사용 가능한 구성 요소에 독점적으로 근거 했다 하 고 시퀀스 특정 DNA 가닥 침공에 대 한 반응을 활용 되 나이 방법의 개발 칩 기반 인공 세포의 생성에 대 한 간단한 구현 다단계 리소 그래피 절차의 실현. 절차의 개요 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 그것은 DNA 머리 핀 분자 photocleavable 그룹을 포함 하는 생체 못 레이어에 움직일을 기반으로 합니다. Photocleavage는 머리 핀의 어떤 DNA를 통해 ("전치" 표시 시퀀스를 포함 하는)의 분자 발 중재 가닥 침략에 연결 된 를 통해 수 단일 가닥 발 시퀀스를 제공 합니다.

데이지의 매우 조밀 하 고 깨끗 한 수 Bephore 잠재적으로 간단 하 게 구현 하는, "유전자 브러쉬", 특정 응용 프로그램에서 장점을. 그러나 원칙적으로,, 데이지와 Bephore 석판 수 쉽게 결합. DNA를 구성 하기 위한 DNA 가닥 변위 골드 브러쉬 활용 관련된 리소 그래피 방법 이전 황 외.에 의해 개발 되었다 하지만 하지 셀 무료 유전자 식^28,29의 문맥에서 이용 되었다.

다음 프로토콜 Bephore 메서드를 사용 하 여 셀 무료 유전자 발현에 대 한 브러쉬 DNA의 생산에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 우리는 유전자 칩 조작 방법과 칩에 유전자의 공간 구조적된 동원 정지에 대 한 다단계 포토 리소 그래피의 사용을 설명 합니다. 우리는 또한 반응 챔버의 제조 및 마이크로 칩에 유전자 식 반응의 성능에 대 한 응용 프로그램 토론.

Protocol

참고: 다른 섹션에서 단계에 대 한 시간 일정 보충 정보 (제 1)에서 주어진 다.

1. 칩 제조

참고: 기판, 실리콘이 산화물 또는 유리 슬라이드 (24 mm x 24 mm, no. 1.5; 22 m m x 50 m m, 제 4 호)의 50 nm 두꺼운 층으로 사용 하 여 실리콘 웨이퍼 (100 m m 직경, 0.525 m m 두께)로. 응용 프로그램에 따라 다른 크기와 두께 더 적합 한 수 있습니다.

1. 기판 통해 는 RCA 청소 절차를 청소 (물, 암모니아 솔루션 NH₃(aq) 30%와 30% 과산화 수소 H₂O₂ 비율 5:1:1)
   1. 유리 비이 커에에서 물과 암모니아 솔루션을 혼합 하 고 혼합 교 반 하면서 뜨거운 접시에 70 ° C에가 열.
   2. 과산화 수소와 기판 추가 합니다. 더 높은 처리량에 대 한 소계 (PTFE) 보유자에 여러 기판 (특히 작은 유리 슬라이드)를 배치 합니다.
   3. 30 분 후 꺼내 기판, 철저 하 게 세척 병에서 물으로 린스와 질소 총 건조. 기판의 PEGylation 즉시 진행.
      주의: 피부와 눈 보호를 착용 하 고 증기 두건에서 작동. 할 닫지 폐기물 컨테이너 단단히 혼합물에서 가스 방출에 대 한 허용 하기 위하여.
2. 기판의 PEGylation
   참고: 반복 중지 및 재개 Biotin-말뚝-Silane의 공기 수 분의 응축으로 인해 silane의 반응성을 감소 시킨다. 따라서, 적절 한 양의 Biotin-말뚝-실 란 5 mL 튜브 준비 (예: 10-20 밀리 그램) 건조 아르곤 사용까지 그들을 동결 하기 전에 그들을 채울.
   1. Vortexing (5 mg/mL)에 의해 건조 톨루엔에 Biotin-말뚝-Silane을 디졸브.
   2. 증기 두건에서 (120 cm 직경, 높이 2cm) 유리 페 트리 접시에 기질을 놓습니다.
   3. 플라스틱 표면 전체를 덮고 기판에 솔루션 (단일 유리 커버 슬립에 대 한 ≈200 µ L, 대형 실리콘 웨이퍼에 대 한 몇 mL) 하지만 기판의 가장자리를 통해 흐르는 하는 솔루션을 피하십시오.
   4. 페 트리 접시를 닫습니다. 기판의 건조를 줄이기 위해, 젖은 종이 타월로 추가 커버를 추가 합니다.
   5. 30 분 후 이소프로필 알콜의 약 40 ml를 추가 기판 밖으로, 이소프로필 알콜으로 다시 그것을 철저 하 게 씻어 그리고 질소 총 건조 (유리 슬라이드에 대 한 기억 PEGylated 쪽). 어둠 속에서 사용까지 기판을 저장 합니다.
      주의: 피부와 눈 보호를 착용 하 고 증기 두건에서 작동.

2입니다. 동원 정지에 대 한 유전자의 준비

참고: 뇌관 시퀀스, DNA 수정과 모범적인 PCR 프로토콜 보충 정보 (섹션 2-4)에 부여 됩니다.

1. 수정 된 프라이 머를 사용 하 여 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 관심사의 유전자를 증폭 하는. 한 뇌관 운반 fluorophore 시각화를 위한 형광 현미경 검사 법, 그리고 다른 뇌관은 구분 표시 순서에서 triethylene 글리콜 스페이서 PCR 통해 단일 가닥 표시 순서를 유지 하기 위하여.
2. 스핀 열 정화 키트를 사용 하 여 DNA를 정화 하 고 흡수 광도 계를 사용 하 여 그것의 농도 측정. 농도 100 보다 훨씬 낮은 해서는 안 nM.
3. 집중된 5 M NaCl 솔루션을 사용 하 여 1 m NaCl의 농도 조정 합니다. 높은 소금 농도 DNA 브러쉬 어셈블리 프로세스²²를 촉진 한다.

3입니다. 사진 평판

참고: photocleavable DNA (PC)만 노란 빛 환경에서에서 처리 되어야 합니다. Cleanrooms 노란색 호 기존의 흰 빛 램프의 빛을 필터링을 사용할 수 있습니다.

1. 기판의 준비
   1. Bephore-혼합 (1 µ M streptavidin, 1.5 µ M PC DNA, 7.5 µ M PH DNA 1 x PBS (인산 염 버퍼 염 분)에) 준비 및 패 시 베이 션 믹스 (10 µ M 1 x PBS에 DIS DNA, 1 mg/mL BSA (소 혈 청 알 부), 레이블 없음). 모두 몇 주 동안 냉장고에서 어둠 속에 저장할 수 있습니다.
   2. 유리 커터를 사용 하 여 또는 메스와 가장자리에 눌러 크리스탈 라인 실리콘 웨이퍼를 끊어서 기판 (몇 cm²) 작은 조각으로 잘라. 간단한 정렬 표시로 서 유리 커터를 사용 하 여 기판의 가장자리 쪽으로 센터에서 짧은 스크래치를 만듭니다. 불어 작은 입자에서 질소 총 칩.
   3. 2 구성 요소 실리콘 접착제, 예: 피 펫 팁, 감동 두 방울을 혼합 하 고 칩, 스크래치의 팁 주변을 비워 (그림 2A)의 표면에 접착제를 적용. 접착제는 세척 단계를 용이 하 게 하 고 외피에 필요한 DNA의 양을 줄여 소수 성 장벽을 제공 합니다. 나중 단계에서 접착제 수 수 쉽게 벗 겨.
   4. 10 µ L을 품 어 (또는 칩을 충당 하기 위해 필요한 만큼) 칩에 상 온 (RT) Bephore-믹스의. 외피, 동안 장소 예: 피 펫 팁 상자 상자에서 칩은 부분적으로 증발을 줄이기 위해 물으로 가득 합니다.
   5. 1 h, 칩 세척 후 제거 1 x PBS와 pipetting으로 여러 (5 x 50 µ L) 번 Bephore-믹스 언바운드.
   6. 칩 건조 하지 않고 가능한 많은 버퍼를 이륙 하 고 실시간에 칩에 패 시 베이 션 믹스의 10 µ L을 품 어
   7. 2 시간 후 씻어 칩와 언바운드 패 시 베이 션 에이전트를 제거 하려면 1 x PBS에 pipetting으로 몇 (10 x 50 µ L) 시간.
2. 투영 리소 그래피
   참고: 리소 그래피를 위한 물 침수 목표 x 60 똑바로 현미경 사용할 수 있습니다. 조명 시간 목적, 광원, 마스크에 따라, 기판 (실리콘 칩 또는 유리 슬라이드) 및 원하는 DNA 표면 밀도. 60 x 목표와 함께 일반적인 노출 시간 겹치는 영역 2 단계 리소 그래피에 대 일 분까지 원거리 (15 실리콘 칩, 45에 대 한 s s 유리 슬라이드에 대 한) 전체 노출에 대 한 2-3 분. 때문에 자외선 차단에 기판 위에 (융합 된 석 영)를 제외 하 고 커버 슬립을 사용 하지 마십시오.
   1. 인쇄 포토 마스크를 잘라 (모범적인 리소 그래피 마스크와 보조 섹션 5 보조 파일 참조) 적합 한 마스크 홀더에 맞게 적절 한 크기로 필드 정지 (그림 2B)의 위치에 삽입할 수 있습니다. 정확한 다단계 리소 그래피에 대 한 정렬 표시 소유자와 마스크를 맞춥니다.
   2. 현미경 슬라이드에 기질을 놓고 현미경 단계로 이동 합니다. Bephore 유리 슬라이드의 패턴에 대 한 현미경 슬라이드와 리소 그래피에 대 한 어두운 배경 수 있도록 Bephore 슬라이드 사이의 검은 호 일 (예: 예비 포 일에서 인쇄 포토)를 삽입 합니다.
   3. 조명 경로, 기판 표면에 초점에 빨간색 필터를 삽입 하 고 노출 될 기판의 지역 예: 스크래치의 끝 지역 이동 합니다.
   4. 마스크 홀더, 조명 차단 넣고 UV 필터 (그림 2C)로 변경 합니다. 낮은 광도에 셔터 열고 카메라를 사용 하 여 기판에 마스크를 신속 하 게 초점.
   5. 카메라 빛 경로 차단 하 고 원하는 노출 시간에 대 한 높은 빛의 강도에 기판 조명.
   6. 현미경에서 샘플을가지고 고 조심 스럽게 제거 많은 버퍼 가능한 기판에서 그것을 건조 하지 않고.
   7. 표시 순서를 가진 DNA의 10-20 µ L를 추가 합니다. 장소는 젖은 상자에 기판 건조에서 그것을 유지. 2 h (micromolar 집중에 oligonucleotides) 또는 실시간에 몇 시간/하룻밤 (약 100 nM 농도에서 kbp 긴 DNA) 기판에 DNA를 품 어
   8. 칩에서 DNA를 제거 하 고 1 x PBS로 여러 번 씻. (특히에 대 한 긴 조각) DNA의 낭비를 줄이기 위해 기판에서 가져온 DNA를 저장 하 고 다시 사용 합니다.
3. 여러 단계 리소 그래피
   참고: 단일 영역에 두 개 이상의 노출의 정확한 정렬, 각도 오차를 피하기 위해 무대에서 샘플을 유지. 칩 건조 하지 않고 다는 것을 확인 하십시오. 드라이브에 전동된 스테이지를 사용 하 여 지정 된 지역에 여러 DNA 브러시는 기판에 여러 지역에서의 위치에 대 한 적절 한 정렬 표시 기판 사용할 수도 있습니다.
   1. 첫 번째 노출 (3.2 단원), 후 기판에 표시 순서 DNA를 품 어. 첫 번째 노출에서 유래 하는 모든 바인딩 사이트 점유 된다 중요 하다. 따라서, oligonucleotides (10 µ M) 약 3 h 실시간에 품 어
   2. 표시 표시 유전자를 무력화 하 몇 시간 동안 그들을 기판에 배치 또는 RT에서 하룻밤 다음 세척 샘플 하 고 실시간 진행에 다음 노출을 추가 하는 또 다른 2 시간을 위한 패 시 베이 션 믹스.
   3. 추가 노출에 대 한 이전 단계를 반복 (3.2.3-3.3.2).

4. PDMS 장치

참고: 선호, 클린 룸에서 작동 합니다. 맥도날드 외 에 의해 설명 같은 PDMS 장치 제조 표준 프로토콜을 다음과 ³⁰

1. 사진 평판을 통해 마스터 금형의 제작
   1. 쥡니다 아세톤 높은 전력에서 5 분에 의해 실리콘 웨이퍼 (76.2 m m 직경, 525 µ m 두께)을 청소 하 고 이소프로필 알콜와 드 이온된 물으로 린스. 나중에 15 분 동안 150 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 놓습니다.
   2. 필요에 따라 개선 하기 위해 웨이퍼에 레지스트의 접착, 2-3 mL 접착 촉진제를 추가 하 고 2 분 동안 120 ° C를 웨이퍼 30 미 열에 대 한 3000 rpm에 회전 키를 누릅니다.
   3. 2-3 mL 포토 레지스트에 대 한 추가 ( 재료의 표참조). 15에 대 한 웨이퍼를 회전 s 500 rpm에서 다음 30 3000 rpm에서 s. 이 인해 20 µ m 두꺼운 층의 감광 한다. 감광 레이어를 10 분 동안 실내 온도에 휴식을 보자.
   4. 사전 노출 빵에 대 한 다음 5 분 동안 85 ° C에서 2 분 동안 50 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 놓습니다.
   5. 구획의 청사진 포토 마스크에서 웨이퍼를 놓습니다. 가급적, 마스크 동기 기를 사용 하 여. 포토 마스크는 64000 dpi의 해상도 있어야 (리소 그래피 마스크와 보조 섹션 5 보조 파일 참조).
   6. 포토 마스크를 통해 자외선 (난-5-10 mW/cm²)과 1 분 동안 웨이퍼를 노출 합니다.
   7. 사후 노출 빵에 대 일 분 동안 50 ° C에서 그리고 5 분 동안 85 ° C에서 웨이퍼를 놓습니다. 진정 하 고 실 온에서 1 h 동안 휴식 웨이퍼를 하자.
   8. 부드럽게 비 커를 교 반 하면서 3 분에 대 한 개발자와 함께 접시에 웨이퍼를 놓습니다. 이소프로필 알콜으로 웨이퍼를 헹 구 고 질소 총 건조. 45 분 동안 130 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 놓습니다.
2. PDMS 장치 준비
   1. 믹스 PDMS 기지 고 PDMS 경화제 10:1 비율에 부 어 약 5 mm의 계층까지 닫힌된 컨테이너에서 웨이퍼에 웨이퍼 위에 형성 했다. 유일한 1 m m 두께의 PDMS 장치를, 대신 코트 2 분 100 rpm에서 PDMS와 웨이퍼를 회전 합니다.
   2. desiccator에 컨테이너를 놓고 진공 (약 85 kPa) 약 30 분에 대 한 적용 합니다. 그런 다음, 약 70 ° c 오븐에 1-2 h에 대 한 PDMS 열.
   3. 웨이퍼에서 PDMS 장치를 분리 합니다. 각 구획의 1 세트에 포함 되도록 석판으로 된 PDMS를 잘라. 경우는 PDMS 미세 설치에 연결 될 것입니다, 펀치 구멍 (직경 1 m m) 입구와 콘센트 공급 채널의 끝에.
   4. 이소프로필 알콜와 드 이온된 수 PDMS를 청소 하 고 질소 총 건조. 먼지가 PDMS를 저장 합니다.

5.로 한정된 유전자 발현

참고: 다음 절차 설명 합니다 샘플 홀더 (그림 3)의 어셈블리를 compartmentalized 유전자 발현의 관찰에 대 한 거꾸로 현미경에 케이지 인큐베이터 온도 제어와. 홀더 쉽게 사용할 수 있는 재료와 도구 (3.5-5 m m 두꺼운 폴 리 염화 비닐 (PVC) 플라스틱, 나사 및 너트, 드릴)을 사용 하 고, 현미경의 종류에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다. 5.1 및 5.2에서 설명 하는 단계는 소유자의 두 부분을 동시에 준비가 수행 되어야 한다.

1. 하단 홀더 어셈블리
   1. 맞춤 표시 (예: 스크래치) Bephore 칩을 준비 하 고 양면 접착 테이프 (그림 3B)를 사용 하 여 칩 홀더에 접착제. 칩 그것을 다룰 것입니다 PDMS 장치 보다 더 큰 해야 합니다.
   2. 하나 또는 여러 개의 유전자 칩에 고정 (2 및 3 참조).
   3. 다음 하단 보유자의 중앙 구멍 주위 일부 진공 그리스 추가 칩 홀더를 연결 합니다.
      참고: 칩 홀더 지금 준수 하단 홀더는 그리스에 의하여 다시 x y 평면에서 칩의 위치에 대 한 가능성을 유지 하면서 합니다.
2. 최고 홀더 어셈블리
   1. 단계 4.2.1에서에서 스핀 코팅 절차를 사용 하 여 구획 얇은 PDMS 칩을 준비 합니다. 채널을 보급 하 여 낭비와 선구자 분자의 교환 수 있도록 한쪽을 열어두고 PDMS, 가능한 작게 잘라.
   2. 유리 커버 슬립 (24 mm x 24 mm, no. 1.5) 및 산소 플라즈마 42에 대 한 PDMS 칩 (구획 없이 쪽)의 뒷면을 청소 s (200 W와 패러데이 케이지 샘플 0.8 mbar에서 운영 하는).
   3. 위쪽으로 가리키는 구획 PDMS 칩 유리 슬라이드의 가운데에 배치 합니다. 70 ° c.에 1 시간에 대 한 PDMS와 유리를 구워
   4. 일부 진공 그리스 최고 소유자의 큰 구멍 주위를 추가 합니다.
   5. 실험을 시작 하기 전에 깨끗 한 유리 슬라이드와는 PDMS 칩 42 산소 플라즈마와 친수성는 PDMS를 렌더링 하는 s.
   6. 최고 홀더 ( 그림 3C) 위에 PDMS와 유리 슬라이드를 놓고 그리스 (그림 3C)에 유리를 조심 스럽게 누릅니다.
3. 홀더 어셈블리
   1. 셀-무료 식 시스템의 100 µ L를 준비 하 고 얼음에 그것을 유지.
   2. 조심 스럽게 칩에서 버퍼를 제거 하 고 세포 무료 식 시스템의 10 µ L로 한 번 씻. 다음으로, 칩에 셀 무료 식 시스템의 60 µ L을 추가 하 고 (이미 그림 3B에서 제거 되는) 칩의 가장자리에서 두 구성 요소 실리콘 접착제를 제거.
   3. PDMS에 식 시스템의 20 µ L를 추가 합니다. PDMS에 물방울을 배치 후 신속 하 게 검사는 구획은 잘 젖은 입체 현미경에서 기포 없이. 공기 방울 경우 셀 무료 식 시스템의 나머지와 함께 그들을 씻어 보십시오.
   4. 2 조립 나사 2 개 소유자의 챔버 및 DNA 브러쉬 정렬, 입체 현미경 작동 하 고 그래서 그리퍼 팔 아래쪽 홀더를 고정 하 조각 및 wingnuts 양손으로 쉽게 액세스할 수 있습니다 (그림 3D-F ).
   5. 하단 보유자에 상위 홀더를 삽입 하 고 셀 무료 식 시스템 방울 퓨즈 (그림 3D) 때까지 낮은. 여부는 구획 및 정렬 마크 x y 평면에서 비슷한 지역에는 입체 현미경을 통해 확인, 그렇지 않으면 최고 보유자와 다시 위치 최고 소유자 유리 슬라이드를 올려.
   6. 밑에서 나사로 죈 다는 wingnuts 그들은 소유자의 하단 쪽 터치까지. 신중 하 게 구획 및 칩은 x-y-비행기 를 통해 칩 홀더 (그림 3E)의 하단에 핸들에 정렬 하는 동안, wingnuts를 조입니다. 한 번 접촉, 강화는 wingnuts 매우 부드럽게 (그림 3 층).
      참고:이 단계는 몇 가지 경험을 요구 하 고 실험 설정에 따라 다릅니다. 현미경, PDMS와 유리 사이의 액체에서 발생 하는 간섭 패턴 적용 된 힘은 너무 작고, 너무 높은에서 구획 힌트의 중심에 (DNA 브러시 또는 표현된 단백질)에서 낮은 형광 강도 동안 나타낼 수 있습니다. 압력 (보충 정보, 섹션 6 참조).
   7. 물으로 안티 증발에 스폰지를 스프레이 상자에 소유자를 삽입. 2 구성 요소 실리콘 접착제 5 mL 주사기를 봉인 상자 (그림 3G)를 사용 하 여.
   8. 온도 제어 현미경 상자를 전송 및 이미지 DNA 브러시 및 형광 현미경 검사 법에 반응. 조명 없이 DNA 브러시의 형광 셀 무료 식 시스템에 사라져 요. 그럼에도 불구 하 고, 브러시 같은 브러쉬에서 반복 된 유전자 발현에 의해 표시 될 수로 그것의 활동을 유지 합니다.
      참고: Bephore 유리 슬라이드를 사용 하 여 실리콘 칩 대신, PDMS 및 Bephore 칩의 위치 (위/아래) 교환할 수 있습니다, 작은 작업 거리를 가진 목표의 사용에 대 한 허용.

6. 지속적인된 식 미세 장치

참고: 실험적인 체제는 그림 4A에 표시 된 부분에서 조립 된다. 온도 제어 스테이지의 어셈블리에 대 한 내용은 보충 정보 (섹션 7)에 부여 됩니다.

1. 셀-무료 식 시스템 및 튜브
   1. 샘플 튜브 (약 200 µ L) 셀 무료 식 시스템을 준비 합니다. 형광 염료로 표시 된 폴리스 티 렌 구슬 공급 채널을 통해 유량 나중에 모니터를 추가할 수 있습니다.
   2. 압력 컨트롤러에 튜브를 연결 합니다. 약 12 시간 동안 차가운 유지 하는 큰 얼음 저수지에 튜브를 놓습니다. 필요한 경우에 얼음을 리필.
      참고: 압력 컨트롤러 대신, 주사기 펌프 흐름 저항 변화 예: 장기적으로 도움이 될 수도 있는 기포 때문에 실험 하는 경우에 셀 무료 식 시스템의 일정 한 흐름 율을 제공.
   3. PTFE에 셀 무료 식 시스템 들어 있는 튜브를 연결 튜브 (내부 직경 0.8 m m)가 열된 단계에 도달. PTFE 튜브 원피스 삽입을 무딘 끝 1-2 cm 조각으로 주사기 바늘 (0.9 m m의 직경)를 끊고. 그것은 나중에 PDMS에 커넥터 될 것입니다. 무대와 튜브 (그림 4C) 사이의 배관의 길이 최소화 하십시오.
   4. PTFE 튜브를 냉각, 얼음 물 저수지와 연동 펌프에 연결 된 더 큰 고무 튜브 주위 랩. 스카치 테이프 (그림 4C)와 함께 그들을 테이프.
2. 최고 홀더 어셈블리
   1. 산소 플라즈마와 PDMS 칩의 편평한 측을 청소 (42 s) 피팅 입구 및 PDMS (그림 4B)의 콘센트 구멍 현미경 슬라이드 위에 놓습니다. 머리 드릴링 유리 유리에 구멍을 미리 뚫고 수 수 있습니다. 마이크로-챔버 유리 슬라이드에 직면 하지는 다는 것을 확인 하십시오.
   2. PDMS 소유자의 편평한 측에 양면 접착 테이프를 적용 됩니다. 접착 테이프에서 배경 형광을 피하기 위해 소유자의 두 구멍 사이 지역에서 한 조각의 검은 호 일 (예: 리소 그래피 마스크에서)를 스틱.
   3. 스틱 홀더에 PDMS 칩 유리 슬라이드.
   4. 치료는 PDMS와 연결 된 유리를 가진 PDMS 홀더 청소기 산소 플라즈마는 플라즈마에 슬라이드 (42 s).
   5. 진공 그리스에 가기 홀더 큰 구멍 주위를 적용 하 고 삽입 PDMS 홀더 (그림 4B). PDMS 홀더 지금 다시 x-y 방향으로 위치에 대 한 가능성을 유지 하면서 최고 홀더 준수 합니다.
   6. PTFE 튜브 주사기 바늘 커넥터 PDMS 칩의 입구를 연결 합니다. 상위 홀더를 통해 PDMS에 대 한 액세스를 촉진 하기 위하여 상단 플라스틱 플레이트는이 고 다음 단계에 대 한 간단히 제거할 수 있습니다.
   7. PTFE 주사기 바늘 커넥터 (그림 4D) 콘센트에 (약 5cm) 튜브의 두 번째 작품을 삽입 합니다.
   8. 그래서 그것은 모든 방향으로 이동 하 게 자유롭게 가기 홀더에서 PDMS 홀더를 배치 합니다. 장소 열띤된 무대에 느슨하게 최고 홀더는 어떤 wingnuts 강화 없이 그림 4E 에서처럼.
   9. 현미경, PDMS 구획의 위치를 이동 하 고 카메라의 시야에 센터. 이 시점에서 단계를 이동 하지 마십시오.
   10. 무대에서는 PDMS와 상위 홀더를 제거 합니다.
3. 열띤된 무대와 Bephore 유리 슬라이드
   1. 열띤된 무대의 온도 37 ° C를 설정
   2. 현미경의 시야의 중심에서 약 맞춤 표시로 이중 양면된 접착 테이프를 사용 하 여 거꾸로 형광 현미경의 온도 제어 단계로 유전자 브러쉬로 Bephore 유리 슬라이드를 (4 호)를 붙입니다. 맞춤 표시의 포지셔닝이 구획은 동일한 지역에 대략 인하 될 보장 합니다.
   3. 유전자의 해당 형광 채널에서 이미지를 받아 고 카메라 이미지에서의 위치를 표시 합니다.
   4. 유전자 브러시에서 버퍼를 제거 하지만 그것을 건조 하지 마십시오. 유전자 브러시에 셀-표현의 자유 시스템의 20 µ L을 추가 하 고 실리콘 접착제 프레임을 제거 하는 핀셋을 사용.
4. 미세 설정의 조립
   1. 셀 무료 식 시스템은 PTFE 튜빙 채워지고 PDMS 장치의 아래쪽에 나타납니다 때까지 샘플 튜브에 압력을 추가 합니다. 또한, 10 µ L는 PDMS에 마이크로 챔버에 세포 무료 식 시스템의 플라스틱. 구획은 공기 방울의 무료 다는 것을 확인 하십시오.
   2. 신중 하 게 낮은 유리 슬라이드에 최고 소유자와 유전자 브러시로 마이크로 챔버를 맞춥니다. PDMS와 정렬 마크 같은 초점면에 도달 하기 전에 PDMS 홀더 뒤 작은 나사를 사용 하 여 x-y-위치 및 PDMS 장치 유전자 브러쉬 (그림 4E)의 방향을 정확 하 게 맞춥니다.
   3. 위치 하 고 (그림 4E) 현미경 단계로 가기 홀더를 연결 하는 나사를 따라 wingnuts 강화 하 여 유리 슬라이드 위에 PDMS를 누릅니다.
   4. (그림 4 층) 셀 무료 식 시스템 모니터 공급 채널 (시간당 0.5 ~ 5 µ l 사이 속도 권장 흐름)을 통해 형광 구슬의 흐름을 포함 하는 튜브에 압력을 증가. 필요한 경우는 wingnuts 강화 하 여 유리에 PDMS의 압력을 증가.

Results

2 단계 리소 그래피: 그림 5 겹치는 붙일 레이블된 표시 가닥의 패턴 유리 슬라이드에는 두 단계로 석판의 결과 보여 줍니다.

형광 단백질 유전자 브러시에서의 표현: 그림 6 고정된 DNA에서 형광 단백질 YPet의 식을 보여 줍니다. 여러 지점에서 시간에 우리는 부분적으로 형광 단백질을 표백 하 고 형광 신호의 복구를 관찰 하 여 진 식 속도 평가, 단백질 식에서 발생 하지 않는 즉각적인 복구 무시. 첫 번째 표백 후 식의 2 시간에서 형광 강도 신속 하 게 복구 고 그 값 보다는 표백 하기 전에. 4 ~ 6 시간 후 형광은 신선한 식 혼합의 공급 없이 반응 약 3-4 시간 후 종료를 나타내는 그것의 이전 강도에 복구 되지 않았다.

Discussion

Bephore 리소 그래피는 DNA 또는 RNA의 꽃무늬 동원 정지에 대 한 강력 하 고 다재 다능 한 기술입니다. 그러나, 절차-변경-실패에 대 한 원천이 될 수 있습니다 몇 가지 단계를 포함 하거나 시스템의 성능 감소.

Bephore 칩의 제조에 중요 한 단계는 표면의 생체 적합성을 제공 하는 기판의 PEGylation 이다. 여기, RCA 절차와 청소 단계 중요 하다, 때문에 그것은 또한 후속 silanization에 대 한 표면 활성화. 실제 PEGylation 동안 기판 밖으로 건조 하지 해야 합니다. 또한, Silane 못 Biotin 저장 되어야 한다 제대로 그것의 반응성 (섹션 1.2)를 보존 하 고 가교를 피하기 위하여. PEGylation의 결과 평가 하기 위해 기판 붙일 레이블된 streptavidin과 인 큐베이 팅 고 비 PEGylated 컨트롤에 비해 수 수 있습니다. 성공적으로 PEGylated 기판 컨트롤 보다 상당히 더 많은 streptavidin을...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50nm 이산화규소가 있는 실리콘 웨이퍼(Bephore 기판)	Siegert 웨이퍼		두께(&마이크로; m): 525 &플러스mn; 25, 직경 (mm) : 100
실리콘 웨이퍼 (PDMS 마스터 몰드 용)	Siegert 웨이퍼		두께 (µ m): 525 &플러스mn; 25, 직경 (mm) : 76.2 (3 ")
유리 슬라이드 번호 4	Menzel		22 mm x 50 mm
유리 슬라이드 번호 1.5	Assistent		24 mm x 24 mm
비오틴-PEG-실란	Laysan Bio		MW 5,000
무수 톨루엔	Sigma Aldrich (Merck)	244511
Streptavidin	Thermo-Fisher Scientific	S888
DNA	Integrated DNA Technologies ( IDT)
Phusion High-Fidelity PCR 마스터 믹스와 HF 버퍼	New England Biolabs	M0531S	PCR 키트
Wizard SV Gel 및 PCR Clean-Up System	Promega	A9281	스핀-컬럼 PCR 클린업 키트
PURExpress	New England Biolabs	E6800S	세포-무료 발현 시스템
PDMS	Dow Corning	Slygard 184
FluoSpheres	Thermo-Fisher Scientific	F8771
PTFE 튜빙 (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)	Bola	S 1810-10
EpoCore 20	마이크로 레지스트 기술		포토레지스트
mr-Dev 600	마이크로 레지스트 기술		포토레지스트 개발자
Ti-Prime	MicroChemicals		접착 촉진제
두 구성 요소 실리콘 접착제	Picodent	Twinsil
자외선 차단 황색 호일	Lithoprotect(MicroChemicals를 통해)	Y520E212
Equipment
Masks for photolithography	Zitzmann GmbH		64.000 dpi, 180x240 mm
Upright microscope	Olympus	BX51	포토리소그래피 및 형광 이미징
60x Water Immersion Objective	Olympus	LumPlanFl	Olympus BX51, NA 0.9
20x 침수 대물렌즈	Olympus	LumPlanFl	Olympus BX51, NA 0.5
카메라	광도 인식	Coolsnap HQ	Olympus BX51
Ligtht source	EXFO	X-Cite 120Q	와 함께 사용 Olympus BX51
도립 현미경	Nikon	Ti2-E	형광과 함께 사용 유전자 발현 이미징
4x 대물	Nikon	CFI P-Apo 4x Lambda	Nikon Ti2-E
카메라	및 Neo5.5		사용 Nikon Ti2-E
광원	Lumencor	SOLA SM II	Nikon Ti2-E
케이지 인큐베이터	Okolab	굵은 선	Nikon Ti2-E
압력 컨트롤러	Elveflow	OB1 MK3와 함께 사용
NanoPhotometer	Implen		DNA 농도 측정
플라즈마 클리너	Diener	Femto	200 W, 패러데이 케이지의 샘플과 함께 0.8mbar에서 작동