우리는 봄에는에 셀 무료 유전자 식 실험을 수행 하기 위해 사용 될 수 있는 표면에 유전자 길이 DNA 분자의 동원 정지에 대 한 간단한 석판 절차를 설명 합니다.
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방법 논문
다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
있고 구조화 된 표면에 유전자의 동원 정지에 오픈 미세 생물 반응 기 시스템에서 식 프로세스를 compartmentalized 유전자의 연구 수 있습니다. 인공 세포 시스템으로 다른 접근, 달리 등 설치 유전자 표현 시 약 및 동시 배출 폐기물의 지속적인 공급에 대 한 수 있습니다. 이 동적 유전자 규정 피드백 시스템의 실현을 위한 중요 한 시간의 연장된 기간 동안 셀 무료 유전자 식 프로세스의 구현을 지원 합니다. 여기 우리 기술을 사용 하 여는 사용 하기 간단 석판 DNA 가닥 변위 반응에 따라 독점적으로 상업적으로 사용 가능한 구성 요소를 사용 하 여 유전 봄에는 제작에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 우리 또한 제공 하는 프로토콜 compartmentalized 유전자의 통합에입니다 (PDMS)-미세 시스템을 기반으로. 또한, 우리는 시스템 DNA와 식 믹스에 포함 된 분자 사이 분자 상호 작용의 직접적인 관측을 위해 사용 될 수 있는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경과 호환 되는지 보여줍니다.
서론
세포-유전자 발현 반응 생화학, 생명 공학, 및 합성 생물학에 다양 한 응용 프로그램에 대 한 큰 관심은 무료. 단백질 세포 자유로운 표현의 구조 생물학에서 수많은 연구를 위한 기초를 했다 순수 단백질 견본의 준비를 위한 수단이 되었다. 예를 들어, 셀-무료 시스템 성공적으로 어려운 셀 기반으로 식을 사용 하 여 생산 하는 단백질 단지1 또는 막 단백질2의 식에 사용 되었다. 특히, 셀-무료 유전자 발현 반응 했다 또한 19613Nirenberg 그리고 Matthaei에 의해 획기적인 실험과 함께 시작 하는 유전 코드의 구조를 명료 하 게 하는 데 사용 됩니다.
최근, 생명 공학 및 합성 생물학4,,56셀 자유로운 방법에 관심을 갱신된 되었습니다. 셀-무료 시스템 비 생물학 화합물, 증강 될 수 및 다양 한 생물학 근원의 부품을 보다 쉽게 결합 될 수 있다7. 비록 셀 무료 시스템 명백한 단점은 "성장 하 고....
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프로토콜
참고: 다른 섹션에서 단계에 대 한 시간 일정 보충 정보 (제 1)에서 주어진 다.
1. 칩 제조
참고: 기판, 실리콘이 산화물 또는 유리 슬라이드 (24 mm x 24 mm, no. 1.5; 22 m m x 50 m m, 제 4 호)의 50 nm 두꺼운 층으로 사용 하 여 실리콘 웨이퍼 (100 m m 직경, 0.525 m m 두께)로. 응용 프로그램에 따라 다른 크기와 두께 더 적합 한 수 있습니다.
- 기판 통해 는 RCA 청소 절차를 청소 (물, 암모니아 솔루션 NH3(aq) 30%와 30% 과산화 수소 H2O2 비율 5:1:1)
- 유리 비이 커에에서 물과 암모니아 솔루션을 혼합 하 고 혼합 교 반 하면서 뜨거운 접시에 70 ° C에가 열.
- 과산화 수소와 기판 추가 합니다. 더 높은 처리량에 대 한 소계 (PTFE) 보유자에 여러 기판 (특히 작은 유리 슬라이드)를 배치 합니다.
- 30 분 후 꺼내 기판, 철저 하 게 세척 병에서 물으로 린스와 질소 총 건조. 기판의 PEGylation 즉시 진행.
주의: 피부와 눈 보호를 착용 하 고 증기 두....
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결과
2 단계 리소 그래피: 그림 5 겹치는 붙일 레이블된 표시 가닥의 패턴 유리 슬라이드에는 두 단계로 석판의 결과 보여 줍니다.
형광 단백질 유전자 브러시에서의 표현: 그림 6 고정된 DNA에서 형광 단백질 YPet의 식을 보여 줍니다. 여러 지점에서 시간에 우리는 부분적으로 형광 단백질을 표백 하 고 형광 신호의 복구를 관찰 하 여 진 식 속도 평가, 단백질 식에서 발생 하지 않는 즉각적인 복구 무시. 첫 번째 표백 후 식의 2 시간에서 형광 강도 신속 하 게 복구 고 그 값 보다는 표백 하기 전에. 4 ~ 6 시간 후 형광은 신선한 식 혼합의 공급 없이 반응 약 3-4 시간 후 종료를 나타내는 그것의 이전 강도에 복구 되지 않았다.
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토론
Bephore 리소 그래피는 DNA 또는 RNA의 꽃무늬 동원 정지에 대 한 강력 하 고 다재 다능 한 기술입니다. 그러나, 절차-변경-실패에 대 한 원천이 될 수 있습니다 몇 가지 단계를 포함 하거나 시스템의 성능 감소.
Bephore 칩의 제조에 중요 한 단계는 표면의 생체 적합성을 제공 하는 기판의 PEGylation 이다. 여기, RCA 절차와 청소 단계 중요 하다, 때문에 그것은 또한 후속 silanization에 대 한 표면 활성화. 실제 PEGylation 동안 기판 밖으로 건조 하지 해야 합니다. 또한, Silane 못 Biotin 저장 되어야 한다 제대로 그것의 반응성 (섹션 1.2)를 보존 하 고 가교를 피하기 위하여. PEGylation의 결과 평가 하기 위해 기판 붙일 레이블된 streptavidin과 인 큐베이 팅 고 비 PEGylated 컨트롤에 비해 수 수 있습니다. 성공적으로 PEGylated 기판 컨트롤 보다 상당히 더 많은 streptavidin을.......
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공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.
감사의 글
우리는 기꺼이 폭스바겐 재단 (부여 번호 89 883)와 유럽 연구 위원회 (보조금 계약 번호 694410-AEDNA)이이 프로젝트에 대 한 재정 지원을 인정 한다. 석사-미 지원을 통해 GRK 2062 DFG 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 50nm 이산화규소가 있는 실리콘 웨이퍼(Bephore 기판) | Siegert 웨이퍼 | 두께(&마이크로; m): 525 &플러스mn; 25, 직경 (mm) : 100 | |
| 실리콘 웨이퍼 (PDMS 마스터 몰드 용) | Siegert 웨이퍼 | 두께 (µ m): 525 &플러스mn; 25, 직경 (mm) : 76.2 (3 ") | |
| 유리 슬라이드 번호 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| 유리 슬라이드 번호 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| 비오틴-PEG-실란 | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| 무수 톨루엔 | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
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참고문헌
- Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
- Jaehme, M., Michel, H.
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