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방법 논문

쥐의 뇌에서 로커 스 Coeruleus의 지역화

18.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58652

⸱

2019년 3월 7일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Johns Hopkins University, School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Johns Hopkins University, 3Department of Molecular and Medical Genetics, OHSU, 4X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

이 논문에서

정오 공지

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

요약

로커 스 coeruleus는 다양 한 생리 적 과정에에서 관여 하는 신경의 작은 클러스터. 여기, 우리는 단백질이이 핵에 금속의 연구에 대 한 마우스 뇌 섹션을 준비 하는 프로토콜을 설명 합니다.

초록

로커 스 coeruleus (LC)는 다양 한 생리 기능을 조절 하는 신경 세포를 생산 하는 노르의 주요 허브 이다. LC의 구조적 또는 기능적 이상 피 질, 해 마와 소 뇌를 포함 하 여 여러 가지 뇌 영역에 영향을 하 고 우울증, 양극성 장애, 불안로 파 킨 슨 질환과 Alzheimer 질병에 기여할 수 있습니다. 이 질환은 종종 금속 misbalance와 관련 된 하지만 lc에서의 역할은 부분적 으로만 이해. LC의 형태 론 적과 기능 연구는 더 나은 인간의 병 리와 금속의 기부를 이해 필요 합니다. 마우스는 널리 사용 되는 실험적인 모델 이지만 마우스 LC 작은 (~0.3 m m 직경)와 비-전문가 대 한 식별 하기 어렵다. 여기, 우리는 쥐의 뇌에 LC를 지역화 하는 단계별 immunohistochemistry 기반 프로토콜을 설명 합니다. 도파민-β-hydroxylase (DBH), 및 양자 택일로, 티로신 hydroxylase (TH), 액정, 높은 표현 두 효소 뇌 조각에서 immunohistochemical 표식으로 사용 됩니다. LC 포함 된 섹션에 인접 한 섹션 x 선 형광 현미경 검사 법 (XFM) 하 여 형태학 연구, 신진 대사 테스트로 금속 영상 조직학을 포함 하 여 추가 분석을 위해 사용할 수 있습니다.

서론

로커 스 coeruleus (LC) brainstem에 노르 (NE) 생산1의 주요 사이트는 중요 한 지역 이다. LC 피 질, 해 마와 소 뇌3 뇌2 에 걸쳐 예측을 전송 하 고 circadian 리듬4,5, 주 및 메모리6를 포함 하 여 주요 생리 적 프로세스 조절 7,8, 인지 과정 및 감정9,10스트레스. LC의 부전 신경 정신병 무질서11, 파 킨 슨 병12,13,14, Alzheimer 질병14, 우울증15 포함 하 여 연루 되어 ,,1617, 양극성 질환18,19및 불안20,,2122,23, 24. 이러한 역할을 감안할 때, LC의 분석은 그것의 기능과 역 기능을 공부 하 고 중요 한.

생쥐는 생리 및 pathophysiologic 프로세스의 연구에 널리 사용 됩니다. 그들의 작은 크기로 인해 마우스 액정 구조를 찾는데 어려움을 선도 하는 ~ 300 μ m의 평균 직경이 있다. 뇌 단면, 동안 LC 코로나 또는 화살 섹션에서 쉽게 놓칠 수 수 있습니다. 사용할 수 연구 동물에서 LC의 식별을 설명 하는 단계별 프로토콜을 제공 하지 않습니다 비-전문가1,25를 따를 수 있습니다. 따라서, LC의 지역화에 대 한 지침을 제공, 우리는 몇 가지 애플 리 케이 션 (그림 1, , 그림 2 그림 3)에 대 한 쥐의 뇌에서이 영역을 찾으려고 개발 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜은 DBH26,27, 또는 양자 택일로 회24, 신중 하 게 제어 뇌 단면 및 immunohistochemical 검출을 두 효소 LC28에서 높게 풍성 하 게 적용 됩니다. LC는 immunohistochemistry 여 일단, 인접 한 뇌 조각 추가 연구, 형태학 및 대사 분석 뿐만 아니라 x-선 형광 현미경 검사 법 (XFM)29통해 금속 이미징 연구를 포함 하 여 사용할 수 있습니다. 우리는이 프로토콜 (그림 3)에서 예를 들어 XFM를 설명합니다.

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프로토콜

동물의 연구는 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용 (ACUC) 프로토콜 번호 M017M385에 의해 승인 되었다.

1. 두뇌 슬라이스

  1. 고정, 3 %isoflurane의 응용 프로그램에서 마우스를 anesthetize.
    1. 15 mL microcentrifuge 튜브에와 isoflurane 방울과 면봉을 담근 다. 튜브에 동물의 코를 놓고는 isoflurane 흡입을 합니다. 발가락-핀치에 응답의 부족에 의해 마 취의 깊이를 확인 합니다.
  2. 그것의 뒤에 동물을 놓고 그것의 복 부에 액세스 하는 동안 T 핀 그것의 사지를 고정 하 여 고정 합니다.
  3. 복 부 피부에서 캡처 하 여 동물 수술가 위로 잘라 고 가슴 지역에 피부를 통해 잘라. T 핀을 사용 하 여 피부를 고정 합니다. 다음에 가슴까지 복 막 휴식. 심장 격 막 흉 강을 크래킹 하 여 노출 합니다.
  4. 동물에서 흐르는 혈액을 있도록 오른쪽 아 트리 움 잘라. 좌 심 실에 25 게이지 바늘 10 mL 주사기를 삽입 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 10 mL와 함께 perfuse.
    참고:이 솔루션 전신 순환 및 출구를 통해 흐름을 수 있습니다 통해 오른쪽 아 트리 움.
  5. 10 mL 주사기를 제거 하 고 60 mL 주사기에 부착 된 25 게이지 바늘을 삽입. 얼음 차가운 4 %paraformaldehyde (PFA)의 50 mL와 좌 심 실을 통해 perfuse.
    1. H2O 10 %PFA 솔루션을 희석 하 고 놀 아 요 4 ° c.에 마지막 4 %PFA 솔루션으로 얼음 찬 4 %PFA 솔루션을 준비
  6. 마우스의 머리를 분리 하 고 두개골에서 뇌를 제거.
    1. 목에서 피부를 잘라내어 다음 두개골 노출 눈 쪽으로 잘라. 코, 목에서 그리고 다른 한 안구에서 두개골 균열. 두개골 밖으로 껍질 그리고 전체 두뇌를 삭제할.
  7. 4%에서 뇌를 품 어 PFA 4 ° c.에 24 h에 대 한
  8. 가득한 30% 자당 해결책의 25 mL 50 mL 원뿔 튜브에 집게와 두뇌를 전송. 뇌 관의 바닥에 싱크 될 때까지 48-72 h 4 ° C에서 그것을 유지.
  9. 잘라 성인 마우스 뇌 슬라이서와 뇌 midbrain (bregma의 후부 ~ 3 m m)를 통해 매트릭스 화관. 포함 하는 brainstem 뇌 섹션을 유지 합니다.
    참고:이 두 개의 뇌 섹션-피 질 (컷의 앞쪽)의 brainstem/소 뇌 (컷의 후부) 포함 한 포함 대부분 발생 합니다. Brainstem 섹션을 사용 하 여 다음 단계에 대 한.
  10. (10 월); 최적의 절삭 온도 화합물에 의해 포위, 포함 금형의 하단에 배치 잘라 표면 brainstem 섹션 포함 -80 ° C 냉동 고에 포함 된 뇌를 이동 하 고 더 사용까지 적어도 12 h-동결.
  11. cryostat에서: 장소 cryostat;로 10 월에 뇌를 포함 된 금형 포함 cryostat는 cryostat의 두뇌 블록의 온도 조정 하는 몇 시간 동안에 그것을 품 어.
  12. 껍질 멀리 두뇌를 포함 하는 10 월 블록 노출 포함 형.
  13. 면도날을 사용 하 여 뇌를 건드리지 않고 10 월의 초과 블록의 표면에서 제거.
  14. 10 월 블록 앞쪽 뇌의 절단된 표면 노출 cryostat의 척에 탑재 합니다.
  15. 그것은 cryostat의 razorblades 동시에 지향은 뇌의 절단된 표면을 조정 합니다.
  16. 100 µ m 섹션 rostrally 절단 정도에서 시작 하는 뇌를 잘라 주세요.
  17. 소 뇌 및 brainstem 하나의 연속 조각으로 잘라 때까지 rostrally를 잘라 주세요. 50 µ m 두께에서 조각을 수집 시작 합니다.
    참고: 하나의 모 수에서 rostrally 트림로 brainstem 및 소 뇌 것입니다 잘라 두 개의 별도 섹션으로. Rostral 단원의 brainstem 및 소 뇌 결국 병합 됩니다 4번째 심 실 수준에서. 일단 4번째 심 실의 측면 가장자리 제대로 구성 된 다음 소 뇌 및 brainstem 하나의 연속 조각으로 나올 것 이다.
    1. 집게와 함께 10 월 포위 뇌 조각을 수집 하 고 PBS (그림 2a)으로 가득 24-잘 접시의 우물에. LC는 소 뇌와 열 등 한 colliculus ~-5.52 mm bregma (그림 1b)의 후부에 서로 만날 때 가장 눈에 띄는 될 것입니다.
      참고: LC의 가장 앞쪽 부분에는 소 뇌 완전히 구분 하 고 더 이상 열 등 colliculus ~-5.34 mm bregma (그림 1c)의 후부에 주변 사라질 것 이다.

2. Immunohistochemistry 도파민 β-Hydroxylase 또는 티로신 Hydroxylase (그림 2)에 대 한

  1. 주 1
    1. PBS에서 5 분에 대 한 세 번 선택 된 분할 영역을 씻어.
    2. 0.5% 버퍼링 인산 염 세제 (PBSD) 4 ° c.에 24 h permeabilize
      1. 125 µ L 세제 25 mL PBS의에서 희석.
  2. 주 2
    1. 0.5%에서 5 분에 대 한 세 번 조각 씻어 PBSD.
    2. 0.5%에서 1: 500의 희석에서 1 차적인 항 체, 안티 DBH 또는 안티-일 18 h 조에 대 한 추가 4 ° c.에 PBSD
  3. 3 일
    1. 0.5%에서 3 시간 10 분 대 한 슬라이스를 씻어 PBSD.
    2. 0.5%에서 1:1000의 희석에 원하는 이차 항 체 (488 당나귀 방지를 위한 토끼 녹색 형광) 추가 16 h에 대 한 PBSD.
    3. 알루미늄에 4 ° c.에서 24 잘 접시 포장
    4. 0.5%에서 5 분에 대 한 세 번 조각 씻어 PBSD.
    5. PBS에서 5 분 동안 세척.
    6. 물 컨테이너에 연필 브러시와 분할 영역을 전송 합니다.
    7. 탑재 된 슬라이드에 물에 떠 있는 조각.
    8. (없이 DAPI) hard-set 설치 미디어 Coverslip 섹션입니다.
    9. 건조 실 온에서 30 분 동안 탑재 뇌 섹션.
    10. 설정을 적절 한 이차 항 체 fluorophore 파장에서 신호를 검출 하는 confocal 또는 형광 현미경에서 이미지 뇌 조각.
    11. 뇌 조각의 초점면에 현미경을 조정 하 고 단일 이미지를 10 배 확대에 걸릴.
    12. 찾으려면 가능한 LC 지역 두뇌 조각에서 사용 하십시오 4번째 심 실 방향; 소 뇌는 심 실 위에 위치 하 고 있으며, 폰 스 및 brainstem는30아래 발견 된다.
    13. LC를 찾으려면 4번째 심 실;의 측면 가장자리에 초점 4번째 심 실과 폰으로 포인트의 가장자리에서 유래 하는 LC / brainstem 지역 (그림 2b, 2c).
    14. 다음 이미징 및 특정 뇌 조각에 LC의 지역화 뇌 조각 4 ° c.에 포함 된 슬라이드 저장

3. 뇌 조각에 LC의 탐지

  1. 그림 2a와 같이 LC를 포함 하는 뇌 섹션, 찾아서, 위에서 설명한 대로 쥐의 뇌를 슬라이스 PBS에 섹션을 수집 24 잘 요리를 가득.
    1. LC의 적절 한 지역화 있도록 잘 당 하나 뇌 섹션을 배치 합니다.
  2. 뇌 당 immunostained 것 48 뇌 조각의 총을 수집 합니다.
    참고: 그림 2a 에 표시 된 두 개의 요리의 모든 우물 한 동물에서 뇌 조각 포함 됩니다.
  3. Immunostain DBH, 또는 목에 대 한 모든 제 3 5 조각 가급적, 수행 분석은 그에 인접 한 그 뇌 조각의 immunohistochemistry (x 선 형광 현미경 검사 법, XFM)를 통해 추가.
    참고:이 절차는 최종 분석 결과 조각에 LC의 정확한 지 방화에 대 한 수 있습니다 (그림 2a; 우물 사이의 숫자와 함께 표시).
  4. LC, 또는 그냥 거친 근사치의 가장자리와 센터의 정확한 위치를 필요로 하는 그들이 든 예를 들어, 응용 프로그램에 따라 immunostained는 뇌 조각 수를 조정 합니다.
  5. Immunohistochemistry, 다음 4번째 심 실 (그림 2b, 2c)의 양쪽에 식의 독특한 패턴을 통해 LC를 포함 하는 뇌 조각 검색. 그림 2d, 2e; 연속 뇌 조각의 lc DBH 신호의 확대 표시 됩니다. 일에 표시 스테인드 LC의 확대 이미지 그림 2f.
  6. 사용 하 여 섹션 추가 연구-그 포함 LC에 인접 한이 경우에 XFM에 대 한 계량 금속 수준 (그림 3).
  7. XFM 수행, 고분자 박막은 샘플 보유자에 장착 하 여 수는 싱크 로트 론에서 몇 군데에 10-30 µ m (설치)에 따라 얇은 코로나 두뇌 분할 영역을 수집 합니다.
  8. 실 온에서 XFM에 대 한 고분자 박막에 준비는 하 고 XFM 수행 두뇌 분할 영역을 저장 합니다.

4. 금속 이미징 XFM 통해 lc

  1. 위에서 설명한 예제 마우스 뇌를 슬라이스 하 고 결정 LC, LC를 포함 하는 이러한 뇌 조각에서 XFM 통해 금속 수준을 측정.
  2. 이미지 beamline 2 ID-전자에는 고급 광자 소스 (아르곤 국립 연구소, 아르곤 IL)에서 원소 배포판.
  3. '비행'에 데이터 기록31위에서 설명한 대로.
  4. LC 프로그램 지도32,33를 사용 하 여 포함 된 뇌 조각에 원소 농도 결정 합니다.

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결과

변경 (예: Cu, Fe, Zn, 그리고 미네소타) 금속 항상성에서 LC34,35에 변화를 포함 한 신경학 적 장애에서 자주 관찰 된다. 따라서, 뇌의 금속 수준 결정은 질병 메커니즘의 이해를 위해 필요 합니다. 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 뇌 섹션 잘라내기 및 LC에서 다른 금속 수준의 계량 LC 외부 지역에서 수준에 그들을 비교 하 사용할 수 있습니다. (그림 3)입니다. 우리의 예제에서는 LC, 인산, 칼륨, 극복 했다 두뇌 슬라이스 염화과 구리를 측정 했다. 유일한 구리 특히 LC에 상승 했다. (여기에 표시 되지) 높은 해상도 XFM 이미징 금속 레벨의 subcellular 분포의 검출에 대 한 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜의 가능한 응용 프로그램 풍요로 움과 세포내 분포 DBH (

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토론

제대로 방향을 표본이이 프로토콜의 중요 한 단계입니다. 우리를 사용 하는 뇌의 등 쪽 표면에의 해 부 기능 LC (소 뇌와 열 등 한 colliculus 사이 경계)를 찾을 수 있기 때문에 섹션 제대로 정렬 될 중요 하다. 이 마우스 뇌 슬라이서 매트릭스로 뇌를 제대로 설정에 주의 해야 합니다. 앞쪽 및 후부 LC 핵 누락을 피하기 위해 더 많은 조직 ~ 500 μ m을 절단 하는 것이 좋습니다. 가장 일반적인 실수는 LC를 완전히 실종 귀착되는 너무 몇 가지 섹션을 잘라 것 이다. 따라서, 하나의 처음으로이 프로토콜에 따라, 필요한 것 보다 더 많은 부분을 절단 것이 좋습니다. 얼룩이 지기 전에 뇌 아틀라스 이미지의 주의 깊은 학문은 매우 유용 합니다. Brainstem의 외관 변경 모든 몇 백 미크론 분명 하 고, 몇 가지 경험, 그것은 섹션 가치가 단순히 거시적인 외관에 의해 얼룩이 지는 알 수 있습니다.

LC를 지역화 하는 과정에 따라 얼마나 잘 뇌 지향적인 단면 동안 신...

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감사의 글

우리는 마우스 식민지의 유지 보수에 대 한 Abigael Muchenditsi 감사합니다. 아르곤 국립 연구소에서 고급 광자 소스를 사용 하 여 미국 에너지 부, 과학의 사무실, 사무실의 기본적인 에너지 과학, 계약 번호 아래에 의해 지원 되었다: 드-AC02-06CH11357. 우리 감사 올가 Antipova와 박사 스테판 Vogt 사용자 지원 및 고급 광자 소스에서 지원. 이 작품은 SL에 건강의 국가 학회 교부 금 2R01GM101502에 의해 투자 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
성인 마우스 뇌 슬라이서 매트릭스Zivic InstrumentsBSMAS001-1
Anti-rabbit secondary 항체, Alexa Fluor 488 (source - donkey)Thermo Fisher ScientificA-21206
Charged glass slidesGenesee29-107
컨포칼 현미경ZeissLSM 800
CryostatMicrom GmbHHM 505E
저온 유지 장치 절단 블레이드Thermo Fisher ScientificMX35
가위 Mini, 9.5cmAntech Diagnostcs503241
DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌)Sigma-AldrichD9542-10MG
도파민 &베타;-하이드록실라제(DBH) 항체 - 자체 생산(출처 - 토끼)B. 아이퍼-
도파민 β - 하이드 록실 라제 (DBH) 항체 - 상업적으로 사용 가능 (출처 - 토끼)Cell Signaling8586
Falcon tubes, 50mlUSA Scientific339652
Forane (isofluorane)BaxterNDC 1019-360-60
Forceps Micro AdsonAntech Diagnostcs501245
Hardset mounting mediaEM sciences17984-24
현미경PascalLSM 5
Multi-well plates, 24 wellsThermo Fisher Scientific930186
최적 절단 온도 화합물 (OCT)VWR / tissue tech102094-106
파라 포름 알데히드 (PFA) / 포르말린 10 %Fisher ScientificSF98-4
Peel-A-Way 일회용 임베딩 금형Polysciences Inc. 18646A
연필 브러시
인산염 완충 식염수(PBS)Life Tech14190250
면도날AmazonASIN: B000CMFJZ2
주걱Antech Diagnostcs14374
T 핀Office Depot344615
입체 좌표의 마우스 뇌, Paxinos 및 Franklin, 3rd EditionAmazonISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (PBSD 준비용)Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP7949-500ml
Tyrosine hydroxylase (TH) 항체(출처 - 토끼)EMD MilliporeAB152
SPEX 샘플 준비용 초경량 박막3525
광시야 형광 현미경ZeissAxio Zoom.V16
XRF

참고문헌

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재인쇄 및 허가

정오


Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 4/08/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Evan Maxey was updated from:

Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

to:

X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

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쥐의 뇌에서 로커 스 Coeruleus의 지역화
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