로봇 시스템을 사용 하 여 처리 하 고 저 승 Murine 샘플 조직학 분석 포함

Summary

Murine 조직 처리에 대 한 표준화의 부족 인간의 표본에 비해 murine histopathological 분석의 품질을 줄일 수 있습니다. 여기, 선물이 murine 염증 및 uninflamed 저 승 조직 처리 및 인간의 샘플을 포함에 대 한 정기적으로 사용 하는 로봇 시스템의 타당성을 보여의 histopathological 검사를 수행 하는 프로토콜.

Abstract

인간의 질병의 이해 동물 모델의 연구 덕분에 크게 확장 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 실험 모델의 histopathological 평가 인간의 샘플에 대 한 적용으로 엄격한 될 필요가 있다. 실제로, 안정적이 고 정확한 결론 비판적으로 조직 섹션 준비의 품질에 의해 좌우 된다. 여기, 우리 histopathological 분석 murine 조직 절차 동안, murine 샘플의 파라핀 포함에 초기 준비에서 몇 가지 자동화 된 단계를 구현 하는 프로토콜을 설명 합니다. 자동화 된 절차에서 엄격한 프로토콜 표준화를 통한 방법론 변수 감소 murine 병 적인 분석의 향상 된 전반적인 안정성에 기여 한다. 특히,이 프로토콜 자동된 처리의 활용에 설명 합니다 하 고 조직 처리 및 파라핀 인간의 샘플의 포함 murine 표본 장 염증의 처리를 정기적으로 사용 로봇 시스템을 포함. 우리는 murine 조직의 histopathological 검사의 신뢰성 표준화 하 고 자동화 된 기법의 도입에 따라 크게 증가 결론.

Introduction

마지막 십 년간에서 인간의 질병^1,2를 선도 하는 병원 성 메커니즘을 해 부를 몇 가지 실험 모델 개발 되었습니다. 질병의 심각도 평가, 연구원은 처리의 효과 평가 하 고 cytological 및 조직학 건축 변화 또는 염증³양의 공부 해야 합니다. 그 실험 모델을 사용 하 여 수행 하려면 자세한 histopathological 분석 murine 인간과 샘플^4,5종종 비교 필요 하다.

또한, 인간의 샘플 일반적으로 처리 되 고 histopathology 핵심 시설에 의해 득점 하 고 경험이 인간의 병리학을 통해 표준화 histopathological 기준 및 방법. 반대로, murine 조직은 보통 고정, 임베디드 및 histopathological 프로토콜의 제한 된 경험을 가진 연구원에 의해 분석. 품질 및 histopathological 검사의 신뢰성 높은 품질 조직 단면도의 준비로 시작 합니다. 여러 가지 요인을 비판적으로 증가 또는 감소 등 고정, 거시적인 최종 분석의 품질 구분, 처리, 파라핀, 포함 및 샘플^6,7의 포함에 기여.

샘플의 조작 관련 된 이러한 모든 구절 수동 샘플의 포함을 포함 하 여 수동 오류 및 낮은 범위, 단면 및 얼룩 수동 톰 대상이 됩니다. 현재, 조직학 평가 murine 조직 준비의 모든 과정은 다양 한 연구소에서 실험실 프로토콜 및 수동 프로토콜 의존 합니다. 이 연구의 목표 오류와 murine histopathological 시험에 다양성을 줄이기 위해 표준화 자동화 프로토콜을 구현 하는 것입니다.

우리의 지식, 여기 완전 자동된 조직 처리 및 murine 조직;의 조직학 평가 대 한 포함에 대 한 첫 번째 프로토콜 설명 이러한 인간의 표본 분석에 대 한 병 리 단위에서 정기적으로 사용 됩니다. 방법의 타당성의 실용적인 예를 들어, 창 자 염증의 murine 모델 분석 된, 즉, , 만성 대 장 염 모델으로 인 한 식 수^{8 에서에서 dextran 나트륨 황산 염 (DSS)의 반복된 관리 9}. DSS 처리 동물 예를 들면, 체중 감소, 느슨한 대변 또는 설사, 및 섬유 증 ^{뿐만 아니라 콜론의 단축 창 자 염증의 표시를 전시 하기 때문에 인간의 선 동적인 장 질병 (IBD)10 유사한 밀접 하 게이 실험 설정 8,,911}. 인간의 IBD 환자에 대 한 관찰, DSS 처리는 복잡 한 질병 과정을 생성 합니다. 이러한 맥락에서 정교한 조직학 평가 조직 아키텍처의 심오한 변화를 이해 해야 합니다. 따라서, 샘플 준비 품질을 높이기 위한 기술된 프로토콜의 구현 조직학의 해석에 의존 하는 연구자를 유익할 수 있습니다 고 immunohistochemical murine 실험 설정에 대 한 분석. 조직 구조의 변경에 관련 된 인간 질병의 murine 실험 모델, 세포 조직 침투 또는 다른 조직 및 장기 (내장, 뇌, 간, 피부)에 염증의 존재의 증가 품질 사용할 수 있는 histopathological 검사를 위한 샘플 준비입니다.

Protocol

동물 건강 (Auth. 127/15, 27/13)의 이탈리아 정부에 의해 승인 과정과 종양학 IACUC (기관 동물 관리 및 사용 위원회)의 유럽 연구소의 동물 보호 지침을 따라

1. 만성 대 장 염 유도 반복 DSS 관리

1. 별도 연령과 성별 쥐 2 그룹 (치료 DSS 제어 H₂O 대, 실험적인 그룹 당 적어도 5 쥐 littermates)에 일치합니다.
2. 2.5% 관리 DSS (40 kDa) 치료 그룹에 7 일 및 물 컨트롤 그룹에 대 한 식용 수에서.
   참고: 이 모델은 과거 만성 장 염증⁹을 유도합니다.
3. 7 일 후, DSS 치료를 중지 하 고 14 일에 대 한 두 그룹에 게 물. 3 번이이 프로세스를 반복 합니다.
   참고: DSS의 반복적인 관리 밀접 하 게 닮은 인간 IBD, 즉, 섬유 증⁹장 점 막의 변경을 유도 합니다.
4. CO₂ 흡입에 의해, 즉 제도적 IACUC에 의해 승인 절차에 따라 쥐를 희생.
5. 메스와 마우스 복 부와 복을 엽니다.
   참고: 불 임은 좋지만 엄격 하 게 필요한.
6. 집게, 핀셋으로 작은 창 자에서 콜론을 구분 합니다. 족집게와 집게 콜론 삭제하시오
   참고: 콜론 길이 측정 (그림 1A) colitis DSS 처리 쥐에서 발생 하는 경우 확인 하는 방법입니다.
7. 린스 차가운 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x의 10 mL를 페 트리 접시에 콜론 누르고 부드럽게 찌 재료를 제거 하.

2. murine 조직 고정

1. 10%의 10 mL에 각 murine 콜론 견본을 담가 중립 버퍼링 포 르 말린 (NBF) RT (실내 온도)에.
   참고: 불 임은 좋지만 엄격 하 게 필요한.
2. 실시간에서 18-24 h에 대 한 조직 수정

3. 콜론 구분 및 조직 준비

1. 작은 핀셋으로 고정된 조직 NBF 컨테이너에서 제거 하 고 배양 접시에 넣어. 작은 핀셋으로 단면 작업 접시에 콜론을 넣어.
2. 살 균 메스와 파편 (0.3 c m 길이 0.2 c m)에서 콜론을 잘라. 이 조각 길이 카세트의 두께 초과 하기에 최적입니다.
3. 작은 핀셋 (그림 2A)으로 한 콜론 세그먼트를 선택 합니다. 작은 핀셋 (그림 2B)와 카세트를 포함 하는 방향의 파라핀의 끝을 돌출 하는 플라스틱 중 하나에 하나의 콜론 세그먼트를 삽입 합니다.
4. 카세트 당 추가 3 콜론 세그먼트 (3.2-3.3) 작업을 반복 합니다. 직물의 중복을 최소화 하기 위해 인접 튀어나온 팁에 세그먼트를 삽입 하지 마십시오
5. 신중 하 게 4 개의 가장자리 (그림 2C)을 추진 하 여 카세트를 단단히 닫습니다. 조직 손상을 방지 하기 위해 조직을 압박 하지 마십시오.
6. 플라스틱 지원 프레임에 표를 삽입 합니다. 샘플을 식별 하기 위해 지원 프레임 레이블을 지정 합니다. 각 생물 학적 샘플에 대 한 반복 합니다.

4. 조직 처리

1. (그림 3A, 3B) 전원 버튼을 누르면 자동된 프로세서를 켭니다.
2. 파라핀 왁 스 용 해 되도록 1 시간 워밍업. 악기는 파라핀은 완전히 녹아, 전용된 아이콘 (그림 3C)의 존재를 관찰 하 여 확인 될 때까지 기다립니다.
3. 자동화 된 프로세서 (그림 3D)에서 제공 하는 금속 바구니에 각 방향된 카세트 (조직 표본 포함) 수동으로 삽입 합니다. 바구니 인 최적화를 서로 가까이 줄 카세트를 세로로 배치 합니다.
4. 금속 바구니 (그림 3E)를 닫습니다.
5. 말 대 꾸 (그림 3 층)의 뚜껑을 엽니다. 쌈 바구니 기계를 삽입 하는 곳입니다. (그림 3) 프로세서의 전용된 주택에 바구니를 삽입 합니다. 말 대 꾸 (그림 3 H)의 뚜껑을 닫습니다.
6. 악기 컴퓨터에 터치 스크린을 사용 하 여 (그림 3I) 작업 프로토콜 정의. 솔루션, 타이밍 및 표 1에 제공 된 스키마에 따라 구현할 온도 시퀀스를 선택 합니다.
7. 전용된 컴퓨터 아이콘 (그림 3J)를 클릭 하 여 바구니를 포함 하는 통 렬 한 반박에서 실행 될 프로토콜을 지정 합니다. 시작 버튼 (그림 3 L)를 클릭 하 여 프로토콜을 시작 합니다.
8. 악기는 프로토콜의 끝을 확인 하는 전용된 아이콘의 존재 여부를 관찰 하 여 고 기계에서 나오는 경보 음색을 듣고 여 때까지 기다립니다.
9. 말 대 꾸 뚜껑을 엽니다. (그림 3 M) 프로세서에서 바구니를 제거 합니다.

5. 조직 포함

1. (그림 4A) 전원 버튼을 누르면 자동된 embedder를 켭니다.
2. 파라핀 왁 스 용 해 되도록 1 시간 워밍업. 악기는 파라핀 악기의 내부 온도계에 표시 된 파라핀 욕조의 온도 관찰 하 여 녹아 완전히 확인 될 때까지 기다립니다.
3. Embedder 선반에 모든 처리 카세트 프로세서 바구니에서 수동으로 전송. 각 랙 최대 32 카세트를 포함할 수 있습니다. (그림 4B, 4c).
4. (그림 4C, 4d, 4E) 주요 embedder 뚜껑을 엽니다.
5. 악기 컴퓨터에 터치 스크린을 사용 하 여 신호는 로봇 시스템 랙 되는 삽입 (그림 4 층).
6. 입구 주택 뚜껑 (그림 4G)를 엽니다. 랙 입구 주택에 삽입 합니다. 각 embedder는 동시에 최대 4 선반을 포함할 수 있습니다 (그림 4 H, 4I). (그림 4J) 입구 주택 뚜껑을 닫습니다.
7. 표 2 (그림 4 K)에 따라 포함 절차를 시작 하려면 악기 컴퓨터에서 터치 스크린을 사용 합니다.
   참고: 32 카세트의 각 랙 포함 45 분 걸립니다.
8. 악기 전용된 아이콘 (그림 4 L)의 존재를 관찰 하 여 프로토콜의 끝을 확인 될 때까지 기다립니다.
9. 콘센트 랙 (그림 4 M)를 제거 합니다. 주요 embedder 뚜껑을 닫습니다.
10. 선반에서 포함 된 블록 (방향 격자 포함)를 제거 합니다. 스토리지 골 판지 상자에 포함 된 블록을 전송 합니다.

6. 마이크로미터 단면

1. 톰의 냉각 접시를 켭니다. -8 사이의 온도 설정-10 ° c
2. 증류수 2 L를 포함 하는 톰의 서 모스 탯 물 목욕을 켭니다. 42-45 ° c.에 사이 물 목욕의 온도 설정
3. 장소는 파라핀 블록 냉각 플레이트에 포함. 블록을 수 있도록 적어도 5 분 기다립니다.
4. 냉각 접시에서 한 블록을가지고 고 톰 블록 홀더에 배치.
5. 10 µ m 두께 6 번을 절단 하 여 두께 10 µ m. 트림 블록을 절단 하는 톰을 설정 합니다.
6. 10 µ m에서 3 µ m. 컷 한 3 µ m에 대 한 섹션 Hematoxylin과 오신 (H & E)에 얼룩이 지는 톰의 두께 설정을 변경 합니다.
7. 작은 브러시로 3 µ m 섹션을 수집 합니다. 3 µ m 섹션 조직 주름을 줄이기 위해 물 표면에 그것을 신중 하 게 누워 물 욕조에 넣어. 단일 유리 슬라이드에 온도 조절 장치로 통제 물 탕에서 조직 단면도 수집 합니다.
   1. 필요한 경우 추가 섹션을 잘라.
8. 샘플 id를 작성 하 여 유리 슬라이드를 레이블을 지정 합니다.
9. 적어도 10 분 동안 37 ° C 오븐에 슬라이드를 넣어.
10. 유리 슬라이드 랙 즉각적인 분석 또는 스토리지 박스에 넣어.

7. hematoxylin 및 오신 (H & E) 얼룩

1. 전원 버튼을 누르면 자동된 염색기에 전환 합니다. 악기 모니터에 로딩 바의 변화를 관찰 하 여 로봇 팔의 초기화를 허용 합니다.
2. 염색기 랙, 세로 최대 30 슬라이드 삽입으로 유리 슬라이드를 삽입 합니다.
3. 적절 한 무선 주파수 식별 (RFID) 플라스틱 태그와 랙 라벨. RFID 태그 제조 인 컴퓨터에 로드 된 올바른 얼룩 프로토콜을 식별 하는 시스템입니다.
4. 랙을 염색기에 넣습니다. 자동으로 로드 하 고 RFID 태그의 인식에 따라 얼룩 프로토콜을 시작 하려면 컴퓨터를 허용 합니다.
   참고: H & E 염색에 대 한 프로토콜에서 설명 하는 표 3.

8. Immunohistochemical 얼룩

1. Immunohistochemical Mallory trichrome 앞에서 설명한⁷얼룩을 수행 합니다.

Results

식 수에 DSS의 반복 된 관리에 의해 유도 된 실험 만성 대 장 염은 밀접 하 게 닮은 인간 IBD^8,9장 염증의 murine 모델. 그림 1 은 콜론 단축 (그림 1A), DSS 유도 된 염증의 존재와 저 승 식 프로-염증 성 유전자 CXCL10 등의 점수를 널리 사용 매개 변수를 포함 한 DSS 치료의 효과를 설명 합니다. , tnf 와 mcp-1 (그림 1B). 염증 세포의 침투 cytofluorimetry (그림 1C)에 의해 분석 장 lamina propria에 면역 반응의 모집을 보여주는 DSS ...

Discussion

우리 조직 분석 murine 조직의 준비 하는 동안 다른 자동화 된 단계를 사용합니다. 이 프로토콜 기술 힌트 재현성 및 따라서 최종 histopathological 평가의 전반적인 품질을 향상 하는 전체 과정의 표준화를 제공 하는 것을 목표로. 우리는 자동된 계기와 준비 및 조직, 정기적으로 인간의 표본 연구에 대 한 병 리 핵심 시설에 사용의 포함에 대 한 메서드 구현.

이 방법의 잠재적인 적용 가능성을 보여 장 염증, 만성 직장 염 DSS 유도 모델의 만성 murine 실험 설정을 선택 했습니다. 이 설정은 정교한 조직학 평가 만성 장 염증 시 발생 하는 조직 아키텍처의 심오한 변경 조사를 요구 하는 IBD 환자에서 관찰 하는 복잡 한 질병 과정을 유사 합니다. 이러한 프로세스의 조직학 평가 증가 샘플 준비 품질에서 크게 유익할 수 있습니다. 참고로,이 프로토콜 적용할 수 있습니다 다른 murine 조직 (즉, spleens, 림프절, 간, 뇌), 유일한 차이 지향된 카세트...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
절대 에탄올 무수	Carlo Erba	414605	시약
Absolute ETOH	Honeywell	02860-1L	시약
알루미늄 황산칼	SIGMA	A6435	시약
아닐린 블루	SIGMA	415049	시약
carbol Fuchsin	SIGMA	C4165	시약
CD11b (클론 M1/70)	TONBO biosciences	35-0112-U100	항체
CD20 IHC (클론 SA275A11)	Biolegend	150403	항체
CD3 (17A2)	TONBO biosciences	35-0032-U100	항체
CD4 (GK1.5)	BD Biosciences	552051	항체
CD45.2 (클론 104)	BioLegend	109837	항체
CD8 (53-6.7)	BD Biosciences	553031	항체
구연산염 완충액 pH 6 10x	SIGMA	C9999	시약
Dab	Vector Laboratories	SK-4100	시약
DPBS 1x	Microgem	L0615-500	시약
DSS	TdB Consultancy	DB001	시약
EDTA	SIGMA	E9884	시약
EnVision Flex 과산화효소 차단 시약	DAKO		compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate	DAKO		compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP	DAKO		compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker	DAKO		compreso in GV80011-2
Eosin	VWR	1.09844	시약
F4/80 (클론 BM8)	BioLegend	123108	항체
Formalin	PanReac	2,529,311,215	시약
빙초산	SIGMA	71251	시약
Goat-anti-Rat-HRP	, Agilent DAKO	P0448	항체
Haematoxylin	DIAPATH	C0303	시약
LEICA 로터리 마이크로톰(RM2255)	Leica	RM2255	장비
: Ly6g (클론 : 1A8)	BD Biosciences	551459	항체
: Mercury II, Oxide	SIGMA 203793		시약
Omnis Clearify Clearing Agent	DAKO	CACLEGAL	시약
, Omnis EnVision Flex TRS	DAKO	GV80011-2	시약
오렌지 G	SIGMA	O3756	시약
파라핀	Sakura	7052	시약
Peloris	LEICA		장비
Percoll	SIGMA	P4937	시약
RPMI 1640 L-글루타민	Microgem	L0501-500	시약
STS020	Leica		장비
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette	SAKURA	7022	장비
Tissue-Tek 자동 파라핀 임베더	사쿠라		장비
Xylene	J.T.Baker	8080.1000	시약