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방법 논문

로봇 시스템을 사용 하 여 처리 하 고 저 승 Murine 샘플 조직학 분석 포함

5.9K 조회수

DOI:

10.3791/58654

2019년 1월 7일

* These authors contributed equally

이 논문에서

정오 공지

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

요약

Murine 조직 처리에 대 한 표준화의 부족 인간의 표본에 비해 murine histopathological 분석의 품질을 줄일 수 있습니다. 여기, 선물이 murine 염증 및 uninflamed 저 승 조직 처리 및 인간의 샘플을 포함에 대 한 정기적으로 사용 하는 로봇 시스템의 타당성을 보여의 histopathological 검사를 수행 하는 프로토콜.

초록

인간의 질병의 이해 동물 모델의 연구 덕분에 크게 확장 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 실험 모델의 histopathological 평가 인간의 샘플에 대 한 적용으로 엄격한 될 필요가 있다. 실제로, 안정적이 고 정확한 결론 비판적으로 조직 섹션 준비의 품질에 의해 좌우 된다. 여기, 우리 histopathological 분석 murine 조직 절차 동안, murine 샘플의 파라핀 포함에 초기 준비에서 몇 가지 자동화 된 단계를 구현 하는 프로토콜을 설명 합니다. 자동화 된 절차에서 엄격한 프로토콜 표준화를 통한 방법론 변수 감소 murine 병 적인 분석의 향상 된 전반적인 안정성에 기여 한다. 특히,이 프로토콜 자동된 처리의 활용에 설명 합니다 하 고 조직 처리 및 파라핀 인간의 샘플의 포함 murine 표본 장 염증의 처리를 정기적으로 사용 로봇 시스템을 포함. 우리는 murine 조직의 histopathological 검사의 신뢰성 표준화 하 고 자동화 된 기법의 도입에 따라 크게 증가 결론.

서론

마지막 십 년간에서 인간의 질병1,2를 선도 하는 병원 성 메커니즘을 해 부를 몇 가지 실험 모델 개발 되었습니다. 질병의 심각도 평가, 연구원은 처리의 효과 평가 하 고 cytological 및 조직학 건축 변화 또는 염증3양의 공부 해야 합니다. 그 실험 모델을 사용 하 여 수행 하려면 자세한 histopathological 분석 murine 인간과 샘플4,5종종 비교 필요 하다.

또한, 인간의 샘플 일반적으로 처리 되 고 histopathology 핵심 시설에 의해 득점 하 고 경험이 인간의 병리학을 통해 표준화 histopathological 기준 및 방법. 반대로, murine 조직은 보통 고정, 임베디드 및 histopathological 프로토콜의 제한 된 경험을 가진 연구원에 의해 분석. 품질 및 histopathological 검사의 신뢰성 높은 품질 조직 단면도의 준비로 시작 합니다. 여러 가지 요인을 비판적으로 증가 또는 감소 등 고정, 거시적인 최종 분석의 품질 구분, 처....

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프로토콜

동물 건강 (Auth. 127/15, 27/13)의 이탈리아 정부에 의해 승인 과정과 종양학 IACUC (기관 동물 관리 및 사용 위원회)의 유럽 연구소의 동물 보호 지침을 따라

1. 만성 대 장 염 유도 반복 DSS 관리

  1. 별도 연령과 성별 쥐 2 그룹 (치료 DSS 제어 H2O 대, 실험적인 그룹 당 적어도 5 쥐 littermates)에 일치합니다.
  2. 2.5% 관리 DSS (40 kDa) 치료 그룹에 7 일 및 물 컨트롤 그룹에 대 한 식용 수에서.
    참고: 이 모델은 과거 만성 장 염증9을 유도합니다.
  3. 7 일 후, DSS 치료를 중지 하 고 14 일에 대 한 두 그룹에 게 물. 3 번이이 프로세스를 반복 합니다.
    참고: DSS의 반복적인 관리 밀접 하 게 닮은 인간 IBD, 즉, 섬유 증9장 점 막의 변경을 유도 합니다.
  4. CO2 흡입에 의해, 즉 제도적 IACUC에 의해 승인 절차에 따라 쥐를 희생.
  5. 메스와 마우스 복 부와 복을 엽니다.
    참고:

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결과

식 수에 DSS의 반복 된 관리에 의해 유도 된 실험 만성 대 장 염은 밀접 하 게 닮은 인간 IBD8,9장 염증의 murine 모델. 그림 1 은 콜론 단축 (그림 1A), DSS 유도 된 염증의 존재와 저 승 식 프로-염증 성 유전자 CXCL10 등의 점수를 널리 사용 매개 변수를 포함 한 DSS 치료의 효과를 설명 합니다. , tnfmcp-1 (그림 1B). 염증 세포의 침투 cytofluorimetry (그림 1C)에 의해 분석 장 lamina propria에 면역 반응의 모집을 보여주는 DSS .......

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토론

우리 조직 분석 murine 조직의 준비 하는 동안 다른 자동화 된 단계를 사용합니다. 이 프로토콜 기술 힌트 재현성 및 따라서 최종 histopathological 평가의 전반적인 품질을 향상 하는 전체 과정의 표준화를 제공 하는 것을 목표로. 우리는 자동된 계기와 준비 및 조직, 정기적으로 인간의 표본 연구에 대 한 병 리 핵심 시설에 사용의 포함에 대 한 메서드 구현.

이 방법의 잠재적인 적용 가능성을 보여 장 염증, 만성 직장 염 DSS 유도 모델의 만성 murine 실험 설정을 선택 했습니다. 이 설정은 정교한 조직학 평가 만성 장 염증 시 발생 하는 조직 아키텍처의 심오한 변경 조사를 요구 하는 IBD 환자에서 관찰 하는 복잡 한 질병 과정을 유사 합니다. 이러한 프로세스의 조직학 평가 증가 샘플 준비 품질에서 크게 유익할 수 있습니다. 참고로,이 프로토콜 적용할 수 있습니다 다른 murine 조직 (즉, spleens, 림프절, 간, 뇌), 유일한 차이 지향된 카세트.......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

IRCCS 폴 병원, 기술 지원에 대 한 밀라노와 IEO 동물 시설 지원에 대 한의 병 리의 부를 축산에는 감사합니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
절대 에탄올 무수Carlo Erba414605시약
Absolute ETOHHoneywell02860-1L시약
알루미늄 황산칼SIGMAA6435시약
아닐린 블루SIGMA415049시약
carbol FuchsinSIGMAC4165시약
CD11b (클론 M1/70)TONBO biosciences35-0112-U100항체
CD20 IHC (클론 SA275A11)Biolegend150403항체
CD3 (17A2)TONBO biosciences35-0032-U100항체
CD4 (GK1.5)BD Biosciences552051항체
CD45.2 (클론 104)BioLegend109837항체
CD8 (53-6.7)BD Biosciences553031항체
구연산염 완충액 pH 6 10xSIGMAC9999시약
DabVector LaboratoriesSK-4100시약
DPBS 1xMicrogemL0615-500시약
DSSTdB ConsultancyDB001시약
EDTASIGMAE9884시약
EnVision Flex 과산화효소 차단 시약DAKOcompreso in GV80011-2
EnVision Flex SubstrateDAKOcompreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRPDAKOcompreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat LinkerDAKOcompreso in GV80011-2
EosinVWR1.09844시약
F4/80 (클론 BM8)BioLegend123108항체
FormalinPanReac2,529,311,215시약
빙초산SIGMA71251시약
Goat-anti-Rat-HRP, Agilent DAKOP0448항체
HaematoxylinDIAPATHC0303시약
LEICA 로터리 마이크로톰(RM2255)LeicaRM2255장비
: Ly6g (클론 : 1A8)BD Biosciences551459항체
: Mercury II, OxideSIGMA 203793시약
Omnis Clearify Clearing AgentDAKOCACLEGAL시약
, Omnis EnVision Flex TRSDAKOGV80011-2시약
오렌지 GSIGMAO3756시약
파라핀Sakura7052시약
PelorisLEICA장비
PercollSIGMAP4937시약
RPMI 1640 L-글루타민MicrogemL0501-500시약
STS020Leica장비
Tissue-Teck Paraform Sectionable CassetteSAKURA7022장비
Tissue-Tek 자동 파라핀 임베더사쿠라장비
XyleneJ.T.Baker8080.1000시약
륨 , , , , , , , , ,

참고문헌

  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Gen....

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재인쇄 및 허가

정오


Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 2/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:

Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

to:

Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

태그

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