Method Article

로봇 시스템을 사용 하 여 처리 하 고 저 승 Murine 샘플 조직학 분석 포함

DOI:

10.3791/58654

⸱

January 7th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pathology Unit, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 2Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology, 3Gastroenterology and Endoscopy Unit, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 4Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano

In This Article

Erratum Notice

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 2/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:

Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

to:

Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

Summary

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Murine 조직 처리에 대 한 표준화의 부족 인간의 표본에 비해 murine histopathological 분석의 품질을 줄일 수 있습니다. 여기, 선물이 murine 염증 및 uninflamed 저 승 조직 처리 및 인간의 샘플을 포함에 대 한 정기적으로 사용 하는 로봇 시스템의 타당성을 보여의 histopathological 검사를 수행 하는 프로토콜.

Abstract

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인간의 질병의 이해 동물 모델의 연구 덕분에 크게 확장 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 실험 모델의 histopathological 평가 인간의 샘플에 대 한 적용으로 엄격한 될 필요가 있다. 실제로, 안정적이 고 정확한 결론 비판적으로 조직 섹션 준비의 품질에 의해 좌우 된다. 여기, 우리 histopathological 분석 murine 조직 절차 동안, murine 샘플의 파라핀 포함에 초기 준비에서 몇 가지 자동화 된 단계를 구현 하는 프로토콜을 설명 합니다. 자동화 된 절차에서 엄격한 프로토콜 표준화를 통한 방법론 변수 감소 murine 병 적인 분석의 향상 된 전반적인 안정성에 기여 한다. 특히,이 프로토콜 자동된 처리의 활용에 설명 합니다 하 고 조직 처리 및 파라핀 인간의 샘플의 포함 murine 표본 장 염증의 처리를 정기적으로 사용 로봇 시스템을 포함. 우리는 murine 조직의 histopathological 검사의 신뢰성 표준화 하 고 자동화 된 기법의 도입에 따라 크게 증가 결론.

Introduction

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마지막 십 년간에서 인간의 질병1,2를 선도 하는 병원 성 메커니즘을 해 부를 몇 가지 실험 모델 개발 되었습니다. 질병의 심각도 평가, 연구원은 처리의 효과 평가 하 고 cytological 및 조직학 건축 변화 또는 염증3양의 공부 해야 합니다. 그 실험 모델을 사용 하 여 수행 하려면 자세한 histopathological 분석 murine 인간과 샘플4,5종종 비교 필요 하다.

또한, 인간의 샘플 일반적으로 처리 되 고 histopathology 핵심 시설에 의해 득점 하 고 경험이 인간의 병리학을 통해 표준화 histopathological 기준 및 방법. 반대로, murine 조직은 보통 고정, 임베디드 및 histopathological 프로토콜의 제한 된 경험을 가진 연구원에 의해 분석. 품질 및 histopathological 검사의 신뢰성 높은 품질 조직 단면도의 준비로 시작 합니다. 여러 가지 요인을 비판적으로 증가 또는 감소 등 고정, 거시적인 최종 분석의 품질 구분, 처....

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Protocol

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동물 건강 (Auth. 127/15, 27/13)의 이탈리아 정부에 의해 승인 과정과 종양학 IACUC (기관 동물 관리 및 사용 위원회)의 유럽 연구소의 동물 보호 지침을 따라

1. 만성 대 장 염 유도 반복 DSS 관리

  1. 별도 연령과 성별 쥐 2 그룹 (치료 DSS 제어 H2O 대, 실험적인 그룹 당 적어도 5 쥐 littermates)에 일치합니다.
  2. 2.5% 관리 DSS (40 kDa) 치료 그룹에 7 일 및 물 컨트롤 그룹에 대 한 식용 수에서.
    참고: 이 모델은 과거 만성 장 염증9을 유도합니다.
  3. 7 일 후, DSS 치료를 중지 하 고 14 일에 대 한 두 그룹에 게 물. 3 번이이 프로세스를 반복 합니다.
    참고: DSS의 반복적인 관리 밀접 하 게 닮은 인간 IBD, 즉, 섬유 증9장 점 막의 변경을 유도 합니다.
  4. CO2 흡입에 의해, 즉 제도적 IACUC에 의해 승인 절차에 따라 쥐를 희생.
  5. 메스와 마우스 복 부와 복을 엽니다.
    참고:

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Results

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식 수에 DSS의 반복 된 관리에 의해 유도 된 실험 만성 대 장 염은 밀접 하 게 닮은 인간 IBD8,9장 염증의 murine 모델. 그림 1 은 콜론 단축 (그림 1A), DSS 유도 된 염증의 존재와 저 승 식 프로-염증 성 유전자 CXCL10 등의 점수를 널리 사용 매개 변수를 포함 한 DSS 치료의 효과를 설명 합니다. , tnf 와 mcp-1 (그림 1B). 염증 세포의 침투 cytofluorimetry (그림 1C)에 의해 분석 장 lamina propria에 면역 반응의 모집을 보여주는 DSS .......

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Discussion

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우리 조직 분석 murine 조직의 준비 하는 동안 다른 자동화 된 단계를 사용합니다. 이 프로토콜 기술 힌트 재현성 및 따라서 최종 histopathological 평가의 전반적인 품질을 향상 하는 전체 과정의 표준화를 제공 하는 것을 목표로. 우리는 자동된 계기와 준비 및 조직, 정기적으로 인간의 표본 연구에 대 한 병 리 핵심 시설에 사용의 포함에 대 한 메서드 구현.

이 방법의 잠재적인 적용 가능성을 보여 장 염증, 만성 직장 염 DSS 유도 모델의 만성 murine 실험 설정을 선택 했습니다. 이 설정은 정교한 조직학 평가 만성 장 염증 시 발생 하는 조직 아키텍처의 심오한 변경 조사를 요구 하는 IBD 환자에서 관찰 하는 복잡 한 질병 과정을 유사 합니다. 이러한 프로세스의 조직학 평가 증가 샘플 준비 품질에서 크게 유익할 수 있습니다. 참고로,이 프로토콜 적용할 수 있습니다 다른 murine 조직 (즉, spleens, 림프절, 간, 뇌), 유일한 차이 지향된 카세트.......

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Disclosures

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저자는 공개 없다.

Acknowledgements

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IRCCS 폴 병원, 기술 지원에 대 한 밀라노와 IEO 동물 시설 지원에 대 한의 병 리의 부를 축산에는 감사합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
절대 에탄올 무수Carlo Erba414605시약
Absolute ETOHHoneywell02860-1L시약
알루미늄 황산칼SIGMAA6435시약
아닐린 블루SIGMA415049시약
carbol FuchsinSIGMAC4165시약
CD11b (클론 M1/70)TONBO biosciences35-0112-U100항체
CD20 IHC (클론 SA275A11)Biolegend150403항체
CD3 (17A2)TONBO biosciences35-0032-U100항체
CD4 (GK1.5)BD Biosciences552051항체
CD45.2 (클론 104)BioLegend109837항체
CD8 (53-6.7)BD Biosciences553031항체
구연산염 완충액 pH 6 10xSIGMAC9999시약
DabVector LaboratoriesSK-4100시약
DPBS 1xMicrogemL0615-500시약
DSSTdB ConsultancyDB001시약
EDTASIGMAE9884시약
EnVision Flex 과산화효소 차단 시약DAKOcompreso in GV80011-2
EnVision Flex SubstrateDAKOcompreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRPDAKOcompreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat LinkerDAKOcompreso in GV80011-2
EosinVWR1.09844시약
F4/80 (클론 BM8)BioLegend123108항체
FormalinPanReac2,529,311,215시약
빙초산SIGMA71251시약
Goat-anti-Rat-HRP, Agilent DAKOP0448항체
HaematoxylinDIAPATHC0303시약
LEICA 로터리 마이크로톰(RM2255)LeicaRM2255장비
: Ly6g (클론 : 1A8)BD Biosciences551459항체
: Mercury II, OxideSIGMA 203793시약
Omnis Clearify Clearing AgentDAKOCACLEGAL시약
, Omnis EnVision Flex TRSDAKOGV80011-2시약
오렌지 GSIGMAO3756시약
파라핀Sakura7052시약
PelorisLEICA장비
PercollSIGMAP4937시약
RPMI 1640 L-글루타민MicrogemL0501-500시약
STS020Leica장비
Tissue-Teck Paraform Sectionable CassetteSAKURA7022장비
Tissue-Tek 자동 파라핀 임베더사쿠라장비
XyleneJ.T.Baker8080.1000시약
륨 , , , , , , , , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Gen....

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