격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

요약

이 프로토콜에서는 작은 RNA 도서관 건설 및 다음 세대 시퀀싱에 대 한 세포 배양에서 세포 외 microRNAs 정화 하는 방법을 보여 줍니다. 다양 한 품질 관리 검사점 작업 exRNAs 같은 낮은 입력된 샘플을 할 때 기대 하는 것을 이해 하는 독자 수 있도록 기술 된다.

초록

세포 외 및 순환 RNAs (exRNA)는 신체의 많은 세포 유형에 의해 생산과 타 액, 혈장, 혈 청, 우유와 소변 등 수많은 체액에 존재. 이러한 RNAs의 한 하위 집합은 posttranscriptional 레 귤 레이 터-microRNAs (miRNAs). 특정 세포 유형에 의해 생산 하는 miRNAs의 윤곽을 그리 다 생체 외에서 문화 시스템 수확 사용할 수와 프로필 exRNAs 셀의 한 하위 집합에서 파생 된. 중간 엽 줄기 세포의 secreted 요소 경감 수많은 질병에 연루 되 고 여기에 체 외 모델 시스템으로 사용 된다. 이 문서 수집의 과정, 작은 RNA의 정화 및 시퀀스 extracellular miRNAs에 라이브러리 생성에 설명합니다. 문화 미디어에서 ExRNAs 낮은 RNA 입력된 샘플, 최적화 된 프로시저를 호출 하 여 세포질 RNA에서 다. 이 프로토콜에 포괄적인 가이드를 작은 exRNA 시퀀싱 문화 미디어에서 exRNA 정화 및 시퀀싱 하는 동안 각 단계에서 품질 관리 검사점을 보여주는 제공 합니다.

서론

세포 외 및 순환 RNAs (exRNAs) 다양 한 체액에 존재 하 고 저항 RNases^1,2쪽으로 있습니다. 그들의 높은 풍부, 안정성과 접근의 용이성 진단 및 예 후 마커³임상 평가 대 한 매력이 있습니다. ExRNAs에 대 한 전송 모드 포함 extracellular 소포 (EVs), 단백질 (예: 고밀도 지 단백;와 협회 HDL) 및 ribonucleoprotein 단지 (와 같은 Argonaute2 단지와 함께)⁴.

ExRNAs의 하위 집합은 작은 비 코딩 RNAs의 약 22 microRNAs (miRNAs), nt posttranscriptional 유전자 발현을 조절 하는. 전 miRNAs 셀 통신 및 세포 항상성⁵의 규칙에 연루 되었습니다. HDL 전-미르-223 내 피 세포 세포 접착 분자 1 (ICAM-1)를 억 누르기 위해 제공 하는 예를 들어와 염증을⁶. 흥미롭게도, 미르-223는 또한 더 많은 침략 형⁷에....

프로토콜

참고: 중간 엽 줄기 세포 성장 매체 (MSC 미디어)은 재료의 테이블에에서 표시 된 대로 미리 준비가 되어 있습니다.

1. 세포 배양

참고: 인간 중간 엽 줄기 세포는 골 수, 지방 조직 또는 다른 소스¹¹에서 얻어질 수 있다. 양자 택일로, hMSCs는 공급 업체를 통해 구입하실 수 있습니다. 이 프로토콜에서 사용 하는 BMSCs는 환자의 골 수에서 파생 되었고 회사에서 구입.

1. 1 x 10⁶ BMSCs MSC 미디어의 20 mL를 포함 하는 T175 플라스 크에 녹여 5% CO₂ 와 37 ° C에서 세포를 품 어 고 대체 미디어 80 %confluency 매 2-3 일.
2. 1 x PBS의 5 mL로 세포 세척 하 고 PBS를 삭제.
3. 0.05%의 5 mL을 추가 하 여 셀을 분리 트립 신-EDTA와 37 ° c.에 5 분에 대 한 세포 배양 분리를 촉진 하기 위하여 플라스 크의 측면을 누릅니다.
4. MSC 미디어 비활성화는 트립 신, 표면, 그리고 단일 셀 정지를 아래로 피 펫에서 셀 분리의 15 mL를 추가 합니다....

결과

이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 다음 세대 시퀀싱 MSC 문화에서 exRNA 수집 최적화 됩니다. 워크플로의 전체 체계는 그림 1 에 왼쪽에 있으며 각각 품질 관리 검사점 오른쪽에.

컬렉션에 대 한의 날에 세포의 형태학 undifferentiated (그림 3A)와 (그림 3B) 분화 세포 표시 됩니다. 또한, 7 일 대 한 유도 하는 세포의 ALP 활동의 대표적인 정규화 된 레벨 (그림 3C)에 표시 됩니다. 여기, ALP 활동은 약 2.5 배 uninduced 셀의.

토론

여기, 우리는 낮은 입력된 샘플에서 차동 식 분석을 가능 하 게 exRNAs의 다음 세대 시퀀싱에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 심지어 작은 변경 (즉, ultracentrifugation 단계 또는 회전자 유형 변경)는 transcriptome 영향을 미칠 수 있기 때문에 miRNA 레벨^13,14EV 및 exRNA 격리에 대 한 특정 프로토콜을 준수 하는 것이 중요 합니다. 따라서, 어떻게는 exRNA는 절연, 결과 비교할 수 실험에서 모든 샘플에 동일한 실험 및 bioinformatic 절차를 적용 하는 것이 중요 하다.

RNA 무결성은 일반적으로 bioanalyzer에 평가 됩니다. ExRNAs의 없는 상태 이므로 전체 길이 rRNA, 그들의 린 값은 매우 낮은, 그러나,이 낮은 품질 RNA 샘플을 반드시 반영 하지 않습니다. 또한, RNA 농도 exRNAs의 크게 다.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
골수 유래 중간엽 줄기 세포	ATCC	PCS-500-012	이 프로토콜에 사용된 세포는
중간엽 줄기 세포 성장 매체(MSC 매체)로 명명된	MSCGM BulletKit	Lonza	PT-3001
엑소좀 고갈 FBS	Gibco	A2720801
ExRNA 수집 매체: MSCGM, FBS는 엑소좀 고갈 FBS
Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
T175 플라스크	Sarstedt	833,912
페니실린-스트렙토마이신	Gibco	15140122
인산염 완충 식염수	시그마	806552
초원심분리기	Beckman Coulter
폴리카보네이트 병(캡 어셈블리 포함	Beckman 여기에 사용된 Coulter	355618
Beckman Coulter Type 60 Ti			Rotor
NucleoCounter	Chemometec	NC-3000	Cell Counter
β-glycerophosphate	Calbiochem	35675	골형성 분화 매체의 성분
Dexamethasone	Sigma	D4902-25MG	골형성 분화 매체의 성분
2-Phospho-L-아스코르빅  산성 삼나트륨 염	시그마	49752-10G	골 형성 분화 매체의 구성 요소
1α,25-Dihydroxyvitamin  D3	Sigma	D1530-1MG	골형성 분화 매체의 구성 요소
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	miRNA 및 총 RNA 정제 키트 4.8단계를 위한
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent Technologies	5067-1514	RNA 및 DNA 분석을 위한 칩 기반 모세관 전기영동 기계 및 칩
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	RNA 및 DNA 분석을 위한 칩 기반 모세관 전기영동 기계 및 칩
Agilent 고감도 DNA 키트	Agilent Technologies	5067-4626	RNA 및 DNA 분석을 위한 칩 기반 모세관 전기영동 기계 및 칩
KAPA 라이브러리 정량 키트 Roche		KK4824	여기에 사용된 라이브러리 정량 키트
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