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방법 논문

신경 줄기 세포 분화는 원스텝 차가운 대기 플라즈마 치료에서 체 외에 의해

6.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58663

⸱

2019년 1월 11일

 ,  , 
1State Key Laboratory of Advanced Electromagnetic Engineering and Technology, Huazhong University of Science and Technology, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Pathophysiology, Beijing Neurosurgical Institute/Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜 신경 줄기 세포 및 분화 향상을 위한 면역 형광 검출에 차가운 대기 플라즈마 처리의 자세한 실험 단계를 제공 하는 것을 목표로.

초록

으로 실제 플라즈마 기술, 차가운 대기 플라즈마 (모자) 개발 오염, 암 치료, 상처 치유, 루트 운하 치료, 등에서 널리 조사 되어, 플라즈마 의학 이라는 새로운 연구 분야를 형성. 전기, 화학, 및 생물학적 반응 종의 혼합물 이기 때문에, 모자 나타났습니다 신경 줄기 세포 분화를 향상 시키기 위해 그들의 능력 둘 다 생체 외에서 vivo와 는 신경 질환 치료를 위한 유망한 방법 고 미래. 훨씬 더 흥미로운 뉴스 이며 그 모자를 사용 하 여 한 단계, 깨닫지 안전 감독, 신경 줄기 세포 (NSCs)의 조직 교통. 여기 C17.2 NSCs 및 기본 쥐 신경 줄기 세포, NSC 차별화를 강화 하는 성가 모자 제트 장치를 사용 하 여 뿐 아니라 셀 운명으로 거꾸로 관찰 하 고 형광 현미경 검사 법의 자세한 실험 프로토콜을 설명 합니다. 면역 형광 검사 기술 얼룩의 도움으로 우리 모두는 NSCs 치료 그룹 보다 가속된 차동 속도 보였다 발견 하 고는 NSCs의 ~ 75%는 주로 성숙 하 고 해, 모터 신경에 선택적으로 분화 신경입니다.

서론

조직 교통에 대 한 특정 계보에 NSCs의 감독된 분화 신경 및 neurotraumatic 질병1에 대 한 가장 유망한 요법 중 하나 간주 됩니다. 예를 들어 catecholaminergic dopaminergic 신경 세포는 특히 파 킨 슨 병 (PD) 치료에 원하는 됩니다. 그러나, 교통에 대 한 원하는 세포를 준비 하는 전통적인 방법 화학 독성, 흉터 형성, 또는 다른 사람, 재생 의학2NSCs의 애플 리 케이 션을 크게 저해 하는 등 많은 단점이 있다. 따라서, 그것은 매우 NSC 차별화에 대 한 소설과 안전한 방법의 찾을 필요가 있다.

플라즈마 문제, 다음 고체, 액체, 가스의 제 4 상태 이며, 그것은 구성 하는 전체 우주에서 문제의 95% 이상. 플라즈마 전기 중립 중립 입자와 언바운드 긍정적/부정적 이며 일반적으로 실험실에서 고압 방전에 의해 생성 됩니다. 지난 2 년간에 의학에서 플라즈마의 응용 프로그램 차가운 대기압 플라즈마 기술 개발으로 세계적으로 큰 관심을 모으고 있다. 이 기술 덕분에 안정적인 저온 플라즈마 아크 형성 없이 분위기에 주위 공기에 생성 될 수 있습니다 및 종의 다양 한 반응, 반응 질소 종 (RNS), 반응성 산소 종 (선생님), 자외선 (UV)로 구성 되어 방사선, 전자, 이온, 및 전기 분야3. 모자는 마이크로-유기 체 비활성화, 암 치료, 상처 치유, 피부 질환, 세포 증식, 세포 감 별 법4,5,,67의 치료에 대 한 독특한 장점이 있다. 이전 작품에서는, 우리가 보여주는 차가운 대기 플라즈마 제트 murine 신경 줄기 세포 C17.2 (C17.2-NSCs)에 기본 쥐 신경 줄기 세포, NSCs의 분화를 향상 시킬 수 있습니다는 감독에 대 한 강력한 도구가 될 큰 잠재력을 전시 NSCs8분화 NSC 차별화의 모자 향상의 기계 장치는 완전히 이해 되지 않습니다 아직, 비록 모자에 의해 생성 된 NO는 과정에서 핵심 요소가 될 것 입증 되었다. 이 작품에서는, 우리는 NSCs 생체 외에서셀 준비 및 전처리, 거꾸로 한 현미경으로 형태학 관찰의 치료는 대기압 헬륨/산소 플라즈마 제트를 사용 하 여 자세한 실험 프로토콜을 제공을 목표로 하 고 면역 형광 염색 법의 형광 현미경 관찰입니다.

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프로토콜

1. 세포 문화 및 Predifferentiation

  1. 신경 줄기 세포 배양 및 predifferentiation
    1. Coverslips 폴 리 D lysine 코팅을 준비 합니다. 12-잘 접시에 메 마른 coverslip (지름 20 mm)을 넣어. 다음 단계에 따라 더 나은 세포 접착에 있는 coverslips에 대 한 물 (재료의 테이블)에 폴 리-D-라이 신, 0.1 %w / v, 커버 유리를 코트.
      참고: 최적의 조건 각 셀 라인 및 응용 프로그램에 대 한 결정 해야 합니다.
      1. Aseptically 폴 리-D-라이 신, 0.1 %w / v, 물에 coverslip의 표면 코트. 부드럽게 coverslip 표면에 코팅 되도록 바위.
      2. 하룻밤 (~ 12 h) 37 ° C에서 배양 후 폴 리-D-리 솔루션을 제거 하 고 씻어 표면 3 살 균 물의 1 mL x.
      3. 그들을 뿌리기 전에 셀 적어도 30 분을 건조.
  2. C17.2 (C17.2-NSC) 문화 murine 신경 줄기 세포 및 predifferentiation
    1. C17.2-NSCs Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 5% 말 혈 청 (HS), 및 1% 페니실린/스 ~ 2-3 d 37 ° C, 5% CO2 보충에 25 c m2 플라스 크에서 품 어.
    2. 셀 85% 합류에 도달, 매체를 제거 하 고 1 mL의 PBS로 세포 세척 한 신선한 trypsin (0.25%)의 1 mL 플라스 크에 추가. 1 분;에 대 한 둬 그런 다음, 플라스 크 및 단일 세포 현 탁 액을 위해 여러 번 왔다 갔다 피 펫 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다.
    3. 정지는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 밀도 계산. 2 × 104 셀/mL의 최종 셀 농도 주고 세포 현 탁 액의 필요한 볼륨을 계산 합니다.
    4. 씨 C17.2 NSCs 코팅된 coverslips에 ~ 잘 당 104 셀 x 2의 밀도와 12-잘 접시에. 현미경으로 세포 밀도 확인 합니다.
      참고: 더 나은 결과 위한 최적의 셀 밀도 면역 형광 실험 하기 전에 결정 되어야 합니다.
    5. 첨부 파일에 대 한 있도록 12 h에 대 한 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포를 품 어.
    6. 첨부 후 씻어 셀 2 x 1 mL의 PBS로 1 %N2 플라즈마 치료 전에 48 h에 대 한 보완과 DMEM/F12 이루어진 차별화 매체와 셀을 육성.
  3. 기본 쥐 신경 줄기 세포 배양 및 predifferentiation
    1. 5 x 105 세포의 밀도에 uncoated T25 플라스 크에 쥐 NSC 성장 매체에서 주 쥐 NSC 정지 문화.
      참고: 기본 쥐 NSCs Xie 그 외 의 프로토콜을 따르고 고립 됐다 9.
    2. 거꾸로 현미경 neurospheres의 형성을 확인 하십시오. neurospheres의 형태 전시 구형 하 고 투명 한 다세포 단지 다는 것을 확인 하십시오.
    3. neurospheres 직경 3 m m 이상에 도달, 전송 neurosphere 정지는 15 mL 메 마른 분리기 관 고는 neurospheres 중력에 의해 정착.
    4. 신중 하 게 매체의 최소한의 볼륨에는 neurospheres를 떠나 상쾌한을 제거 합니다.
    5. Neurospheres 1 린스는 neurospheres 중력에 의해 침전 PBS의 5 mL x. PBS의 최소한의 볼륨을 떠나 상쾌한을 제거 합니다.
    6. 차별 매체 12 ~ 15 밀리 리터 당 neurospheres에 셀 밀도 조정의 적합 한 볼륨을 추가 합니다. 기본 쥐 NSCs 차별화 매체 구성 DMEM/F12, 2 %B27, 및 1 %FBS.
    7. 씨 12-잘 접시에 각 코팅된 coverslip에 neurosphere 서 스 펜 션의 1 mL.
      참고: 격판덮개는 neurospheres은 고르게 분포 되도록 부드럽게 흔들어. 이 단계는 더 나은 면역 형광 검사 결과 대 한 중요 한.
    8. 인큐베이터에 접시를 놓고 플라즈마 치료 전에 24 h에 대 한 predifferentiate에 그것을 허용 합니다.

2입니다. 플라즈마 제트의 준비

  1. 2 m m 내부 직경 및 외부 직경 4 m m.의 반 오픈 석 영 튜브 튜브 2 m m의 직경을 가진 높은 전압 와이어 삽입 선택 하십시오.
  2. 5 mL 주사기로 높은 전압 와이어와 석 영 튜브를 삽입 하 고 주사기의 센터 마운트 홀더를 사용 하 여. 1 cm에서 석 영 튜브의 봉인된 끝과 주사기 끝 사이의 거리를 설정 합니다.
  3. 주사기의 열린 끝을 (와 12 m m 내부 직경) 1 m 실리콘 고무 파이프를 연결 하 고, 다음, 순서 대로 유량 계 및 가스 밸브에 연결.

3입니다. 제트기의 수집

  1. 그림 1과 같이 회로 연결 합니다. 플라즈마 제트 장치에 전원 공급 장치의 출력 와이어를 연결 하 고, 다음, 높은 전압 프로브 끝 전압을 출력 와이어 연결. 출력 전압의 정보를 기록 하는 오실로스코프에 고전압 프로브의 다른 쪽 끝을 연결 합니다. 전체 회로 확인 하 고 전원 공급 장치, 오실로스코프, 그리고 높은 전압 프로브 모두 접지 되어 있는지 확인 하십시오.
  2. 가스 라인을 확인 합니다. 가스 튜브; 플라즈마 제트 장치에 연결 되어 있는지 확인 다음, 헬륨 (볼륨 분수, 99.999%)와 산소 (볼륨 분수, 99.999%)의 가스 밸브를 열고 L:0.01 1 L/min (그: O2)를 가스 흐름을 설정 합니다.
    참고: 처음으로 전원 공급 장치를 켜기 전에 몇 분 동안 가스 흐름을 보자.
  3. 펄스 진폭, 주파수, 및 펄스 폭을 8로 설정 kV, 8, 및 1600 ns, 각각. 회로 다시 확인 하 고, 출력 버튼을 플라즈마 제트를 생성, 설정.
    주의: 언제 든 지 높은 전압 와이어를 만지지 마십시오.

4. 플라즈마 처리 신경 줄기 세포의

  1. 주사기의 노즐 및 15 mm 셀 잘 구멍 사이의 거리를 설정 합니다.
    참고: 거리 12-잘 접시 배치 됩니다 플랫폼의 하단에서 측정 됩니다.
  2. 인큐베이터에서 12-잘 접시를가지고 고 신선한 차별화 매체의 800 µ L predifferentiated 셀의 변경.
  3. 3 개의 그룹으로 셀 분할: 치료 되지 않는 통제 그룹, 60 s 그 O2 (1%) 가스 흐름 처리 그룹, 그리고 60 s 플라즈마 처리 그룹.
    참고:가 아무 명백한 액체 치료 조건 하 에서입니다.
  4. 플라즈마 제트 아래 12-잘 접시, 주사기 노즐 각 구멍의 중심에 고정 되어 있는지 확인 하십시오 놓고 4.3 단계에서 언급 한 다른 그룹에 관련 된 치료를 제공 합니다.
    참고: 치료 컨트롤 실험 절차를 균일 한 치료 조건 동안 실 온에서 차별화 매체에 유지 했다. 그 O2 (1%) 가스 흐름 치료 그룹은만 그 치료와 O2 (1%) 가스 흐름, 플라즈마 생성 없이. 모든 치료는 3 중에서 수행 되어야 합니다.

5. 신경 줄기 세포 분화

  1. 치료 후, 원래의 문화를 제거 하 고 각 우물에 새로운 차별화 매체의 1 mL를 추가 합니다.
  2. 6 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어 d. 변경 매체 매일.
  3. 거꾸로 단계 대조 조명 현미경 아래 매일 다른 그룹의 분화 상태를 확인 하십시오. 임의로 적어도 12 필드를 선택 하 고 형태학 상 변화를 기록 하는 사진을 찍는.

6. 면역 형광 염색

  1. 세 정
    1. 셀 인큐베이터에서 샘플을 받아 고 포부에 의해 매체를 제거 합니다. 1 셀 린스 1 mL의 PBS와 x.
      참고: 차별화, 후 셀은 쉽게 분리. 그것은 세포에서 세척 하지 않으려면 문화 우물의 측면에서 PBS를 추가 해야 합니다.
  2. 고정
    1. 실 온에서 20 분 동안 4 %paraformaldehyde 500 µ L로 셀을 수정 합니다. 고정, 후 부드럽게 씻어 셀 3 x 1 mL의 PBS 5 분 각, 잔여 4 %paraformaldehyde 제거.
      참고: 셀 고정을 위한 최적의 시간 포인트 셀 유형에 따라 결정 되어야 합니다. 고정, 후 문화 우물의 측면에서 PBS의 1 mL을 추가 하 고 5 분에 대 한 테이블에는 샘플을 두고. 셀의 최소 손실 되도록 실험실 셰이 커를 사용 하지 마십시오.
  3. Permeabilization
    1. 0.2% 샘플 permeabilize 실 온에서 10 분에 대 한 PBS에 TritonX-100. Permeabilization, 후 3 시간, 5 분 각 1 mL PBS와 부드럽게 셀 린스.
      참고: 셀 permeabilization에 대 한 최적의 시간 포인트 셀 형식에 따라 결정 되어야 합니다. Permeabilization, 후 5 분에 대 한 테이블에는 샘플 두고 문화 우물의 측면에서 1 mL PBS를 추가. 셀의 최소 손실 되도록 실험실 셰이 커를 사용 하지 마십시오.
  4. 차단
    1. 각 샘플에 PBS에 10% 염소 혈 청 1 mL을 추가 하 고 어떤 일반적인 상호 작용을 차단 하는 1 시간에 대 한 테이블에는 샘플을 두고.
      참고: 셀 슬라이드에서 분리 되지 않도록 실험실 셰이 커를 사용 하지 마십시오. 린스는이 단계에서 필요 하지 않습니다.
  5. 1 차적인 항 체를 가진 외피
    1. 1 차적인 항 체 희석 버퍼를 사용 하 여 1 차적인 항 체 희석.
      참고: 최적의 결과 대 한 1 차적인 항 체의 최종 희석 비율은 예비 시험에 의해 결정 되어야 합니다. (대 한 미 분화 줄기 세포), 안티 Nestin의 희석 비율 (신경)에 대 한 안티-β-Tubulin III, 안티-O4 (oligodendrocyte)에 대 한, 안티-NF200 (대 한 성숙한 뉴런), (대 한 해 신경), 반대로 채팅 안티-LHX3 (모터 신경)에 대 한 안티-GABA ( GABAergic 신경), (대 한 serotonergic 신경), 항 세로토닌 및 안티-일 (대 한 dopaminergic 신경)는 1:80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200, 그리고 1: 100, 각각.
    2. 300 µ L 희석된 주 항 체의 다른 샘플에 적용 됩니다.
    3. 4 ° c.에 하룻밤 셀 샘플을 품 어
      참고: 배경 및 일반적인 얼룩을 줄이기 위해 4 ° C에서 1 차 항 체를 품 어에 추천 된다.
    4. 1 차 항 체를 제거 하 고 부드럽게 씻어 셀 3 x 1 mL의 PBS.
  6. 이차 항 체를 가진 외피
    1. Cy3 활용 또는 알 렉 사 Fluor 488 활용 된 이차 항 체 3% 염소 혈 청을 사용 하 여 PBS에 희석.
      참고: 최적의 결과 대 한 이차 항 체의 최종 희석 비율은 예비 시험에 의해 결정 되어야 합니다.
    2. 각 1 차적인 항 체를 검출 하기 위하여 관련 2 차 항 체의 300 µ L를 적용 합니다.
      참고: 모든 후속 단계 형광 냉각을 방지 하기 위해 어둠 속에서 수행 해야 합니다.
    3. 실 온에서 2 h에 대 한 어둠 속에서 셀 샘플을 품 어.
    4. 2 차 항 체를 제거 하 고 실 온에서 10 분에 대 한 PBS의 1 mL와 함께 부드럽게 셀 린스.
  7. 핵 얼룩
    1. Hoechst 33258 작업 솔루션을 셀 샘플을 담가의 500 µ L를 적용 합니다.
    2. 핵을 실 온에서 8 분 동안 어둠 속에서 셀 샘플을 품 어.
    3. 부드럽게 씻어 셀 3 x 1 mL의 PBS, 10 분 각, 빛 으로부터 보호.
      참고: 셀의 최소한의 손실, 최적의 세척 조건 결정 되어야 합니다 경험.
  8. 장착
    1. microslide의 중심에 장착 매체의 한 방울을 배치 합니다.
    2. 핀셋을 사용 하 여 (샘플)와 coverslips에서 하 고 신중 하 게 장착 매체 위에 샘플 위치. 공기 방울을 피하십시오.
    3. 흡수 성 종이 초과 설치 매체를 제거 합니다.
  9. 형광 현미경 관찰
    1. Hoechst 33258, 알 렉 사 Fluor 488, 및 Cy3 필터 장착 형광 현미경 아래 샘플을 관찰 합니다. 각 샘플에 대 한 무작위로 선택 적어도 8-12 필드와 레코드 이미지 카메라와 함께 합니다.

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결과

셀 형태 모자 치료 후 매일 거꾸로 현미경 관찰 되었다. 그림 2 는 두 셀 라인에서 세포 분화의 일반 거꾸로 단계 대조 조명 현미경 이미지를 보여준다. 플라즈마 처리 그룹 가속된 분화 속도 및 제어 및 가스 흐름 그룹에 비해 높은 차별화 비율을 전시 한다.

Immunofluorescent 결과 C17.2 NSCs 및 기본 쥐 NSCs 후 치료 각각그림 4 , 그림 3 에 표시 됩니다 6 d에 대 한 양식입니다. Nestin (+, 녹색) 감소, β-Tubulin III (+, 레드)이 크게 증가 하 고 O4 (+...

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토론

C17.2-NSCs 일종 이다 신생아 마우스 소 뇌 세분화 된 계층 셀에서 불멸 하 게 신경 줄기 세포 선의10,11스나이더 및 다른 사람에 의해 개발. C17.2-NSCs 신경, 이다, 그리고 oligodendrocytes로 분화 할 수 있다 하 고 신경 과학12에서 널리 이용 된다. 우리의 이전 연구에서 모자 뉴런으로 C17.2 NSCs의 차별화를 향상 시킬 수 있습니다. 증거의 원리 연구 또한 실행 되었다 주 쥐 NSCs를 사용 하 여 고 주 쥐 NSCs에 플라즈마 노출의 효과 C17.2 NSCs, 뉴런의 강력한 차별화의 질적으로 유사 했다. 모자, 새로운 물리 화학적 기술, Alzheimer의 질병, PD, 척수 손상 등 신경 질환 치료를 위한 유망한 도구를 나타낼 수 있습니다.

모자 치료 C17.2 NSC와 기본 쥐 NSC ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 소 학자 프로그램, Huazhong 대학의 과학 및 기술 (No. 2018KFYYXJJ071), 그리고 국가 자연 과학 재단의 중국 (No. 31501099와 51707012)의 독립적인 혁신 기금에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CoverslipNEST801008
Poly-D-lysineBeyotimeP0128
DMEM 배지HyCloneSH30022.01B4°C에 보관됩니다. C
DMEM/F12 매체HyCloneSH30023.01B는 4°C에 보관됨; C
N2 보충제Gibco17502048-20°C에 보관됩니다. C와 가벼운
B27 보충Gibco17504044-20 °에 저장되는 것을 보호하십시오; C 및 빛으로부터 보호
태아 소 혈청HyCloneSH30084.03-20 °에 저장; C, -
Donor Horse serumHyCloneSH30074.03. C,
페니실린/스트렙토마이신HyCloneSV30010. C
TrypsinHyClone253000544°C에 저장됩니다. C
PBS 솔루션HyCloneSH30256.01B4°C에 저장되었습니다. C
4% 파라포름알데히드BeyotimeP0098-20°C에 저장되었습니다. C
TritonX-100SigmaT8787
일반 염소 혈청 차단 솔루션Vector LaboratoriesS-1000-204°C에 저장; C
anti-NestinBeyotimeAF2215-20 °에 저장되었습니다. C,
안티 -°에 저장된 Tubulin IIISigma AldrichT2200. C, 동결 및 해동을 반복하지 마십시오
Anti-O4R & D SystemsMAB1326-20 °에 저장됩니다. C,
된 반 NF200시그마. C,
반 ChAT시그마. C,
반 LHX3시그마. C,
반 GABA시그마. C,
안티 세로토닌 Abcam, Cambridge, MA. C,
반 TH Abcam, Cambridge, MA. C, 4°C에
Immunol 염색 1차 항체 희석 완충액BeyotimeP0103. C
Cy3 표지 염소 안티 토끼 IgGBeyotimeA0516-20 °°에 저장; C 및 빛으로부터 보호
Alexa Fluor 488- -BeyotimeA0428. C 및 빛으로부터 보호
안티-마우스 IgG 
12-웰 플레이트corning3512
25 cm2 플라스크corning430639
Hoechst 33258BeyotimeC1018-20 °에 저장; C 및 빛으로부터 보호
장착 매체BeyotimeP0128은 -20°C에 저장됩니다. C와 빛으로부터 보호
광 현미경Nanjing Jiangnan Novel Optics CompanyXD-202
형광 현미경 Nikon80i
High – 전압 전력 증폭기지시 에너지PVX-4110
DC 전원 공급 장치SpellmanSL1200
함수 발생기Aligent 33521A
오실로스코프TektronixDPO3034
프로브TektronixP6015A
는 교재 20 °에서 tored 동결 및 해동을 반복하지 마십시오4°C에 저장된 반복적으로 동결 및 해동하지 마십시오는 은 는 의 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오-200 °°C에 보관의 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오-20 °에 저장된를 반복적으로 동결 및 해동하지 마십시오-20 °에 저장된의 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오-20 °에 저장된의 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오-20 °에 저장된의 동결 및 해동을 반복하지 마십시오-20 °에 저장된의 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오저장된의 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오20 °에 저장된 염소 로 표시되어 있습니다전압

참고문헌

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  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).

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