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방법 논문

폐 예측에 관한 프로 파일링 걸쳐 the Estrous 사이클 오존에 노출 된 쥐에

5.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58664

⸱

2019년 1월 7일

 , 
1Pulmonary, Immunology and Physiology Laboratory, Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University College of Medicine

이 논문에서

요약

여기 우리가 폐 식 평가 하는 방법을 설명 예측 하는 miRNAs의 염증 유전자를 조절 하기 위해 마우스를 사용 하 여 오존에 노출 또는 estrous 주기의 여러 단계에서 공기를 필터링.

초록

(미르) 예측에 관한 프로 파일링 생물학과 의학의 다양 한 연구 분야에서 일 하는 연구원에 게 관심사의 되고있다. 현재 학문은 보여준다는 약속 miRNAs 및 폐 질환 진단에 사용의 미래. 여기, 우리 미르 규제는 오존 유발 기도 염증 마우스 모델의에서 폐 조직에 염증 유전자를 예측 하는 miRNAs의 그룹의 관계 되는 풍부를 측정 하는 프로 파일링에 대 한 프로토콜을 정의 합니다. 보였다는 순환 호르몬 수준의 영향을 미칠 수 여성에서 폐 타고 난 면제의 규칙, 때문에이 방법의 목적은 프로 파일링 프로토콜 estrous 주기를 고려 하는 여성 쥐에는 염증 미르 설명 하 오존 노출 시간에 각 동물의 단계. 우리는 또한 limma, R/Bioconductor 소프트웨어를 사용 하 여 미르 검색 및 대상 식별 방법에 적용 가능한 생물 정보학 접근 주소 및 생물 학적 컨텍스트 및 경로 이해 하기 기능 분석 소프트웨어와 관련 된 차동 미르 식입니다.

서론

microRNAs (miRNAs)는 짧은 (19-25의 뉴클레오티드), 자연스럽 게 발생, 비 코딩 RNA 분자. MiRNAs의 순서는 진화 생리 기능1조절에 miRNAs의 중요성을 제안 하는 종에 걸쳐 보존 이다. 예측에 관한 식 프로 파일링 miRNAs 다양 한 면역 반응, 세포 분화, 발달 과정 및 apoptosis2를 포함 하 여 프로세스의 규칙에 중요 한 식별 하는 데 도움이 될 입증 되었습니다. 더 최근에, miRNAs 질병 진단 및 치료에 그들의 잠재적인 사용에 대 한 인정을 받고 있다. 유전자 규칙의 기계 장치를 공부 하는 연구원에 대 한 측정 미르 식 수 계몽 규제 프로세스의 시스템-레벨 모델 미르 정보가 mRNA 프로 파일링과 다른 게놈 규모 데이터3병합 하는 경우에 특히. 다른 한편으로, miRNAs mRNAs 견본 종류의 범위에서 보다 더 안정적인 것으로 표시 되었습니다 또한 되며 또한 단백질4보다 큰 감도와 측정. 이 폐 병을 포함 한 다양 한 분자 진단 응용을 위한 생체로 miRNAs의 개발에 상당한 관심을 주도하 고 있다.

폐, miRNAs 개발 프로세스 및 항상성 유지에 중요 한 역할을 재생합니다. 또한, 그들의 비정상적인 식 개발 및 다양 한 폐 질환5진행 관련 된 되었습니다. 공기 오염에 의해 유도 된 염증 성 폐 질환 큰 심각도 및 여성, 호르몬과 estrous 주기 환경 문제에 대 한 응답에서 폐 선 천 적 면역과 미르 식 규제 수 나타내는에서 가난한 예 후를 시연 하고있다 6.이 프로토콜을 사용 하 여 오존 노출, 대기오염의 주요 구성 요소인 적응 면역의 부재에서 발생 하는 여성 쥐에서 폐 염증의 형태를 유도. 오존을 사용 하 여 우리 기도 상피 세포 손상 및 호 중구 증가 염증 성 중재자 인접 항공7에 관련 된 기도 hyperresponsiveness의 개발을 유도 하. 현재, 거기에 잘 설명된 프로토콜 특성화 및 오존 노출 쥐에서 estrous 주기 miRNAs 분석 되지 않습니다.

아래, 우리 estrous 주기 단계 및 오존에 노출 여성 쥐의 폐 조직에서 miRNA 식을 식별 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 우리는 또한 효과적인 생물 정보학 전산 생물학에 대 한 강조와 함께 미르 검색 및 대상 식별, 접근 주소. Limma, 진 식 실험8에서 데이터 분석을 위한 통합된 솔루션을 제공 하는 R/Bioconductor 소프트웨어를 사용 하 여 microarray 데이터 분석. Limma 에서 PCR 배열 데이터의 분석 비교 식 배열/샘플 작은 수를 사용 하는 경우 t-검정에 근거한 절차를 통해 권력의 측면에서 장점이 있다. MiRNA 식 결과의 생물 학적 맥락 이해, 우리는 다음 기능 분석 소프트웨어를 사용. Transcriptional 변화를 조절 하는 메커니즘을 이해 하 고 예측 가능성이 결과, 소프트웨어 미르 식 데이터 집합 및 문학9에서 지식을 결합 합니다. 이것은 통계 농축 miRNAs의 세트에 중복에 보면 소프트웨어와 비교 하면 이점이 다입니다.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 펜실베니아 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.

1입니다. Estrous 주기 단계의 평가

  1. 제대로 C57BL/6 마우스 (8-9 주 이전)을 사용 하 여 한 손으로 마우스 억제 기술 Machholz 외.10에서 설명 하는 여성을 제 지 하십시오.
  2. 매우 순수한 물 10 μ로 살 균 플라스틱 피 펫을 채우십시오.
  3. 질에 플라스틱 피 펫 팁을 소개 합니다.
  4. 부드럽게 플러시 액체 4-5 회 샘플을 수집.
  5. 질 액체 유리 슬라이드에 포함 된 최종 플러시를 놓습니다.
  6. 20 x 목적으로 가벼운 현미경 흠 없는 질 플러시를 관찰 합니다.
    참고: 일반 사이클 pseudopregnancy 또는 다른 원인으로 인해 표시 되지 않는 동물 실험에서 제외 될 필요가 있다. Cyclicity 확인을 3 개 이상 연속 사이클에 대 일 분 비 물 매일 수행 하는 것이 좋습니다.

2입니다. 오존에 노출

  1. Ad libitum 와이어 메쉬 뚜껑, 그리고 물 두 1.2 L 유리 용기에 최대 4 마우스를 놓습니다.
  2. 오존 챔버와 필터링 된 공기 노출 챔버에 다른 한 유리 용기를 넣어.
  3. 정기적으로 2 ppm 및 모니터 오존 수준 오존 농도 조정 합니다.
    참고: 레 귤 레이트 된 공기 흐름을 제공 하는 오존 장치 (> 30 공기 변화/h)와 제어 온도 (25 ° C) 및 상대 습도 (50%). 시스템 모니터링 하 고 앞에서 설명한11자외선 오존 분석기 및 질량 유량 컨트롤러에 의해 제어 되는 전기 방전 오존 발생기에 의해 오존을 생성 합니다.
  4. 오존/필터링 공기 노출의 3 h 후 유리 컨테이너를 제거 합니다. 침구, 음식, 그리고 물 ad libitum 케이지를 동물을 반환 합니다.

3. 폐 컬렉션

  1. 노출 후 4 h anesthetize는 케 타 민/xylazine 칵테일 (마 취 제 90 mg/kg, 10mg/kg xylazine)의 복 주사와 동물.
    참고: 마 취의 적절 한 수준을 확인 하려면 체크는 페달에 대 한 마우스 (회사 발가락 핀치) 반사 고 필요에 따라 마 취를 조정.
  2. 70% 에탄올과 마우스 피부를 적십니다.
  3. 2 cm 중간 절 개를 베 나 정 맥을 노출 하는 운영가 위 및 수술 핀셋을 사용 하 여 확인 합니다.
  4. 의해 transection 베 나 정 맥과 대동맥의 쥐를 희생. 필요한 경우, exsanguination 전에 혈액을 수집 하는 신장 정 맥 위에 베 나 정 맥에 21 G 게이지 바늘을 삽입 합니다. 또는 심장 찔린 다음 표준 프로토콜을 통해 혈액을 수집 합니다.
  5. 복 부 구멍을 자르면 갈비뼈 쪽으로 위쪽으로 이동 하는 피부/위 근육을 제거 하는 수술가 위를 사용 합니다.
  6. 수술가 위를 사용 하 여 횡 경 막 펑크.
    참고: 폐는 횡 경 막에서 붕괴 됩니다.
  7. 컷 멀리 심 혼 및 폐를 노출 하는 수술가 위를 사용 하 여 흉 곽.
  8. 집게를 사용 하 여, 1.5 mL microcentrifuge 튜브 RNase 무료 고 튜브를 채우기 위해 액체 질소에 잠수함.
    참고: 보호 장갑 및 고글을 사용 하 여 액체 질소를 처리 하.
  9. 폐를 제거 하 고 스냅-동결 조직에 액체 질소로 채워진 RNase 무료 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 넣어 액체 증발 될 때까지 몇 초 동안 기다립니다.
  10. 관 뚜껑 닫고 사용까지 조직-80 ° C에서 저장 합니다.

4. RNA 준비

  1. 스테인리스 스틸 조직 분쇄기를 사용 하 여 전체 폐 격파
    참고: 조직 분쇄기를 사용 하기 전에 액체 질소에 배치 될 필요가 있다. RNAse 솔루션과 각 사용 후에 분쇄기를 청소.
  2. 분할 분쇄 폐 고 두 1.5 mL 튜브 (각 반 폐) 합니다.
  3. 샘플 튜브 당 guanidinium 안산의 500 µ L을 추가 하 고 섞으십시오.  각각 18 G, G 21 및 23 G 바늘를 사용 하 여 각 샘플 균질
    참고: 샘플 108 사본의 작은 RNA 스파이크에 컨트롤 (종)에서 추출 진행 하기 전에 x 5.6 아군 될 수 있습니다.
  4. 각 샘플을 15 소용돌이 에탄올의 500 µ L를 추가 s.
  5. 로드 컬렉션 튜브를 1 분에 12000 x g 에서 원심 분리기에서 회전 열에 혼합물을 통해 흐름 폐기.
  6. DNase 대 나 치료 (서 열);
    1. 12000 x g 1 분 동안에 RNA 워시 버퍼 및 원심 분리기의 400 µ L를 추가 합니다.
    2. RNase 무료 튜브에 추가 5 DNase의 µ L 나 DNA 소화 x 1의 75 µ L 버퍼와 혼합. 직접 열 매트릭스를 믹스를 추가 합니다.
    3. 15 분 동안 실 온에서 품 어.
  7. 12000 x g 에서 원심 분리기 1 분 통해 흐름 삭제에 대 한 열을 RNA prewash 솔루션의 400 µ L을 추가 하 고이 단계를 반복 합니다.
  8. 열에 RNA 워시 버퍼의 700 µ L을 추가 하 고 1 분에 12000 x g 에서 원심 분리기를 통해 흐름 삭제.
  9. 12000 x g 2 분 나머지 버퍼 제거에서 원심. RNase 무료 튜브로 열을 전송 합니다.
  10. RNA을 elute 열 매트릭스 1.5 분 12000 x g 에서 원심 분리기에 직접 DNase/RNase 무료 물 35 µ L를 추가 합니다.
  11. 총 RNA 농도 측정 (260 nm)와 순도 분 광 광도 계를 사용 하 여. Aliquot 1.5 µ L 샘플에서 RNA 정량화를 수행 하는 지침을 따릅니다. 차입에 대 한 사용 하는 DNase/RNase 없는 물으로 악기를 빈.
    참고: ~2.0의 260/280 비율 이다 RNA에 대 한 "순수"로 일반적으로 수용 된다. 전형적인 RNA 농도 일반적으로 750와 2500 ng / µ L 사이 범위.
  12. -80 ° c.에 게

5. 미르 프로 파일링

  1. 레트로-작은 RNAs, 사용 200 ng 총 RNA의 녹음.
    1. (반응 당 총 볼륨은 20 µ L) 얼음에 반전 녹음 방송 반응 혼합을 준비 합니다. 각 반응에 대 한 버퍼, 뉴클레오티드 혼합 10 x 2 µ L, 역전사의 2 µ L RNase 무료 물 2 µ L x 5의 4 µ L를 추가 합니다. 모든 구성 요소와 600 µ L RNAse 무료 플라스틱 튜브 (혼합 반응 당 10 µ L)에서 약 수를 혼합.
      참고: 리버스-전사 마스터 믹스 템플릿 RNA 제외 하 고 첫번째 물가 cDNA 합성에 필요한 모든 구성 요소를 포함 합니다.
      참고: 믹스 마스터를 준비할 때 초과 볼륨 (10%)를 계산 합니다.
    2. 추가 서식 파일 RNA (200 10 µ L에서 ng) 리버스 전사 마스터 믹스를 포함 하는 각 관에. 믹스, 15에 대 한 원심 분리기 1000 x g, s thermocycler 또는 건조 블록 배치까지 얼음에 그들을 저장 하 고.
    3. 37 ° c.에 60 분 동안 품 어
    4. 95 ° C에서 5 분 동안 incubate 고 얼음에 튜브를 놓습니다.
    5. 각 20 µ L 반전 녹음 방송 반응에 RNase 무료 물 200 µ L을 추가 하 여는 cDNA를 희석.
  2. 실시간 PCR PCR 배열 마우스 염증 반응 및 면역 미르를 사용 하 여 수행 합니다.
    1. 반응 혼합 (총 볼륨 1100 µ L) 준비: 각 반응에 대 한 추가 2 x PCR 마스터 믹스의 550 µ L, 보편적인 뇌관 믹스 x 10의 110 µ L, RNase 무료 물, 340 µ L 및 템플릿 cDNA (희석된 반응 단계의 5.1.5)의 340 µ L.
    2. 사전 로드 된 miRNA PCR 배열 사용 하 여 멀티 채널 pipettor의 각 음에 반응 혼합의 10 µ L를 추가 합니다.
    3. MiRNA 광학 접착제 필름으로 PCR 배열 접시를 봉인.
    4. 거품 제거를 실 온에서 1000 x g 에서 1 분 동안 접시 원심
    5. 실시간 cycler, PCR 초기 활성화 단계 95 ° C에서 15 분, 15에 대 한 3 단계 자전거 포함 변성 프로그램 s 30에 대 한 어 닐 링 94 ° C에서 55 ° C와 30에 대 한 확장에서 s s 40에 대 한 70 ° C에서 사이클 수.
      참고: 따라 제조 업체의 사이클링 실시간 cycler 설정 지침 조건. 실시간 cycler 소프트웨어에 내장 된 분리 곡선 단계를 수행 합니다.
    6. 데이터 분석을 수행 합니다.

6. 데이터 분석

  1. 분석 소프트웨어는 각 샘플에 대 한 실시간 PCR 소프트웨어에서 Ct 값을 추출 합니다.
    참고: A Ct 값 34의 구분으로 간주 됩니다. 샘플 포함 스파이크 컨트롤 (예:, cel-미르-39), 각 샘플에 대 한 제어에 스파이크를 Ct 값을 표준화 됩니다. 임계값 값을 수동으로 설정 해야 합니다. 초기 계획 값을 자동으로 설정 됩니다.
  2. 6 미르 가사 컨트롤의 평균 Ct Ct 값 정상화: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, 다음 수식을 사용 하 여:
    ΔCt (Ct_Target − Ct_housekeeping) =
  3. 겹 변경 계산, 상대 식 수식12를 사용 하 여 컨트롤로 특정 샘플을 사용 하 여 ΔΔCt 값을 계산:
    miRNA 상대 식:
    2-∆∆Ct, 어디에-∆∆Ct =-[∆Ct 테스트-∆Ct 제어]
    참고: 200의 배 변화 구분으로 간주 됩니다.
  4. 수출 배 Bioconductor8 limma 패키지를 사용 하 여 R에 통계 분석을 수행 하기 위해 식 값을 변경 합니다.
  5. 13Benjamini Hochberg 메서드 사용 하 여 여러 비교에 대 한 수정.
    참고:  R 스크립트의 사본은에서 유효 하다: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. 데이터 집합 및 데이터 분석된 번호 GSE111667에서 유전자 식 옴니 버스에서 사용할 수 있습니다 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.

7. 데이터 분석: 기능 분석 소프트웨어

  1. 데이터 집합을 정렬 합니다. MiRNAs와 그들의 각각 식 로그 비율 및 p-값이 포함 됩니다. 특정 데이터 집합 형식에 대 한 표 1 을 참조 하십시오.
  2. 오픈 기능 분석 소프트웨어 (버전 01-10).
  3. 다음 형식을 사용 하 여 데이터 집합을 업로드: 파일 형식: "유연한 형식", 포함 하는 열 머리글: "예", 식별자 종류 선택: "miRBase (성숙)", 실험을 위해 사용 하는 배열 플랫폼: 배열 플랫폼 선택.
    참고: 파일 형식을.txt은 허용 (탭 구분 텍스트 파일).xls (엑셀 파일), 및.diff (파일 cuffdiff 파일).
  4. "유추 관측"를 선택 하 고 실험적인 그룹 라벨 올바른지 확인 합니다.
  5. "데이터 집합 요약" 매핑된 및 매핑되지 않은 miRNAs의 총 금액을 수정 하려면로 이동 합니다.
  6. 상단에 "새" 버튼을 클릭 프로그램의 왼쪽. "새로운 예측에 관한 대상 필터"를 선택 하 고 예측에 관한 데이터 집합을 업로드.
    1. 소스 설정: TarBase, 창의력 전문가 연구 결과, miRecords.
    2. 신뢰 설정: 실험적으로 관찰 또는 높은 (예측).
    3. 다양 한 종, 질병, 조직, 경로 등 대상에 대 한 생물학적 정보를 포함 하도록 "열 추가"를 선택 합니다.
    4. 실험에서 식 변경 된 대상에 초점을 선택 "추가 / 대체 mRNA 데이터 집합". 동일 하거나 다른 식 레벨 microRNAs 찾으려고 "식 페어링"을 사용 합니다.
      참고: 필터 분석 예측에 관한 이름과 기호, mRNA 대상, 대상 관계, 그리고 예측된 관계 (그림 2)의 신뢰 수준을 설명 하는 소스를 제공 합니다.
  7. "추가를 내 통로" 통로 캔버스에 필터링 된 데이터 집합을 전송 하 고 더 많은 생물 학적 관계를 찾아보기를 클릭 합니다.
  8. 경로 디자이너를 사용 하 여 예측에 관한 효과의 게시-품질 모델을 만듭니다.
  9. 대체 옵션 코어 분석을 만드는 것입니다.
    1. 핵심 분석 유형에 대 한 "식 분석"을 선택 합니다.
    2. 측정 유형에 대 한 "Expr 로그 비율"을 선택 합니다.
    3. 분석 필터 요약: 고려 분자 또는 관계 어디: (종 = 마우스)와 (자신감 = 실험적으로 관찰)와 (데이터 원본 = "창의력 전문가 연구 결과", "창의력 ExpertAssist 발견", "miRecords", "TarBase", 또는 " TargetScan 인간 ")입니다.
    4. P-값의 구분 선택 = 0.05.
    5. 분석을 실행 합니다.
      참고: 보고서 포함 됩니다: 정식 경로, 업스트림 레 귤 레이 터 분석, 질병 및 기능, 레 귤 레이 터 효과, 네트워크, 분자 및 더 많은.

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결과

얼룩에 관찰 하는 다른 세포 유형 마우스 estrous 주기 단계 (그림 1)를 식별 하는 데 사용 됩니다. 이러한 세포 형태학에 의해 식별 됩니다. Proestrus, 동안 세포는 거의 독점적으로 라운드 모양, 올바른 nucleated 상피 세포 (그림 1A)의 클러스터. 마우스 발 정기 단계에 있을 때 셀 cornified 편평 상피 세포, 밀도가 포장된 클러스터 (그림 1B)에 있습니다. Metestrus, 동안 cornified 상피 세포와 백혈구 polymorphonuclear 볼 수 있습니다 (그림 1C). Diestrus, 백혈구 (작은 세포)는 일반적으로 더 널리 (그림 1D).

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토론

예측에 관한 프로 파일링 질병 진단 및 기계 론 적인 연구에 대 한 유리한 기술입니다. 이 원고에 다른 estrous 주기 단계에 있는 오존에 노출 여성 쥐의 폐에 염증 유전자를 조절 하는 것으로 예측 하는 miRNAs의 식을 평가 하는 프로토콜을 정의 했습니다. Estrous 주기 시각 탐지 방법 등의 결정에 대 한 방법이 설명된16되었습니다. 그러나, 이러한 1 회 측정에 의존 하 고 따라서 신뢰할 수 있는 하지 않습니다. 정기적으로 주기 여성에서 모든 estrous 주기 단계를 정확 하 게 식별 하려면 여기에 설명 하는 방법은 것이 좋습니다. 또한,이 간단한 프로토콜 매일 호르몬 변동에 쥐를 직접 추정 하도 사용할 수 있습니다. 매일 한 번만 수행 되어야 하는 요구를 샘플링 질 자극으로 인해 원치 않는 염증 성 반응의 활성화 방지를 위해. 사이클 길이에 영향 주택 가변성, 이므로 2 ~ 3 주기 단계를 고려 하는 실험에서 동물을 사용 하기 전에 완전 한 사이클에 대 한 프로토콜을 ...

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공개 사항

저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

감사의 글

이 연구는 NIH K01HL133520 (PS) 및 K12HD055882 (PS)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. 저자는 오존 노출 실험을 가진 원조에 대 한 박사 조 안 나 Floros를 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C57BL/6J 마우스The Jackson Laboratory0006648주 된
초순수Thermo Fisher Scientific10813012
멸균 플라스틱 피펫Fisher Scientific13-711-25용량: 1.7mL
빛 현미경 슬라이드Thermo Fisher Scientific2951TS
광학 현미경Microscope WorldMW3-H510x 및 20x 대물렌즈
Ketathesia- 케타민 HCl 주입 USPHenry Schein 동물 건강5585390 mg/kg. 규제 약물.
자일라진 멸균 용액Lloyd Laboratories139-23610 mg/kg. 규제 약물.
에탄올Fisher ScientificBP2818100물로 70% 에탄올로 희석합니다.
21 G 게이지 바늘BD Biosciences305165
주사기Fisher Scientific3296541 mL
작동 가위세계 정밀 기기501221, 50461314 cm, 날카롭고/뭉툭한, 곡선 및 9 cm, 직선, 세밀한 날카로운 팁
핀셋 키트세계 정밀 기기504616
스펙트럼  Bessman 조직 분쇄기Fisher Scientific08-418-1용량: 10 - 50 mg
RNase-free 마이크로fuge 튜브Thermo Fisher ScientificAM124001.5 mL
TRIzol 시약Thermo Fisher Scientific15596026
Direct-zol RNA MiniPrep PlusZymo ResearchR2071
NanoDropThermo Fisher ScientificND-ONE-W
miScript II RT 키트Qiagen218161
마우스 염증 반응 & 자가면역 miRNA PCR 어레이QiagenMIMM-105Z
얇은 벽, DNase-free, RNase-free PCR 튜브Thermo Fisher ScientificAM12225for 20 μ L 반응
miRNeasy 혈청/플라즈마 스파이크 인 제어Qiagen219610
Microsoft ExcelMicrosoft Corporationhttps://office.microsoft.com/excel/
독창성 경로 분석Qiagenhttps://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R 소프트웨어R 재단https://www.r-project.org/
열 순환기 또는 냉각/가열 블록일반 실험실 공급업체
마이크로 원심분리기일반 실험실 공급업체
실시간 PCR 사이클러일반 실험실 공급업체
채널 피펫터일반 실험실 공급업체
RNA 세척 버퍼Zymo ResearchR1003-3-4848 mL
DNA 분해 완충액Zymo ResearchE1010-1-44 mL
RNA 사전 세척 완충액Zymo ResearchR1020-2-2525 mL
자외선 오존 분석기Teledyne API모델 T400
http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 질량 유량 컨트롤러Sierra Instruments IncFlobox 951/954http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html
젖다중

참고문헌

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