루트 성장 및 지역화 된 양분에 응답을 시각화 하는 최적화 된 Rhizobox 프로토콜

종종 간과 되지만 그들의 지상에 비해 뿌리 역할을 중요 한 식물 영양소 인수에서. 루트 건설 및 유지 보수의 실질적인 탄소 비용을 감안할 때, 식물 뿌리만 구하고 투자 가치를 개발 하는 메커니즘을 진화 했다. 루트 시스템 수 있습니다 따라서 효율적이 고 동적으로 내 리소스 패치 핫스팟, 통풍 관, 그리고 더 전송¹에 대 한 체 관 부에 급속 하 게 translocating 영양분의 upregulating 속도에 확산 하 여. 소성 응답 식물 종 또는 genotypes^2,3 중 및⁵영양소 관련된^4,화학 형태에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 루트 소성에 변화는 또한, 이기종 토양 자원에 대 한 복잡 한 루트 응답 사육 및 농업에 영양소 이용 효율 증가를 관리 전략을 알릴 수 있는 이해 탐험 한다.

필요성 및 이해 플랜트 시스템에 대 한 관련성에도 불구 하 고 시각화 및 측정 관련 비늘에서 루트 소성 기술 도전 포즈. 일반적인 방법 이다 ("shovelomics"⁶) 토양에서 루트 크라운을 발굴 하지만 잘 뿌리 토양 집계, 사이 작은 구멍을 악용 그리고 발굴 필연적으로 어느 정도 이러한 연약한 뿌리의 손실의. 또한, 파괴적인 수확 하기가 불가능 한 루트 시스템에 변경 시간이 지남에 따라. 계산 하는 x 선 단층 촬영 등 현장에서 이미징 방법 높은 공간 해상도⁷, 뿌리와 토양 자원의 직접적인 시각화를 허용 하지만 비싸다 및 특수 장비가 필요. 수경 실험 토양에서 뿌리 추출와 관련 된 제약을 방지 하지만 루트 형태학 및 건축 기계 제약와 토양^8,9의 생물 복잡성 수성 매체에서 다. 마지막으로, rhizosphere 프로세스 및 기능 발달가 소성이 인공 미디어에서와 통합 될 수 없습니다.

선물이 건설과 시간이 지남에 토양에 뿌리 성장을 하는 낮은-비용, 사용자 정의 방법으로 rhizoboxes (좁은, 일반 단면 사각형 컨테이너)의 사용에 대 한 프로토콜. 특별히 설계 된 프레임 gravitropism, 루트 길이 측정의 정확도 증가 때문에 후면 패널에 대 한 우선적으로 성장 하는 뿌리를 권장 합니다. Rhizoboxes는 일반적으로 루트 성장 및 rhizosphere 상호 작용^10,,1112, 공부 하는 데 사용 됩니다 하지만 여기에 제시 된 방법 제공 단순 단일 구획 설계와 저렴 한 장점이 재료, 지역화 된 영양소에 대 한 루트 응답을 공부 하도록 설계 되었습니다. 그러나, 방법 또한 다양 한 내부/interspecies 경쟁 등 다른 루트와 rhizosphere 프로세스, 화합물, 미생물 또는 효소 활동의 공간 배급을 공부에 적응 수 있습니다. 여기, 우리는 패치 ¹⁵N 표시 된 콩과 식물 잔류물 및 하이라이트 대표 결과의 rhizobox 메서드를 사용 하면 유효성 검사에 대 한 응답 genotypic 옥수수 하이브리드 차이 조사 합니다.

1. 전면 및 후면 패널 및 스페이서의 준비

1. 전면 및 후면 패널을 준비 합니다.
   1. 잘라 두 조각의 40.5 cm 폭 61cm 분명 0.635 cm 두꺼운 아크릴 상자 당 긴 또는 미리 잘라 조각 ( 재료의 표참조)을 구입.
   2. 아크릴을 위한 드릴 비트를 사용 하 여, 드릴 구멍 0.635 cm 직경 1.3 c m에서 2.5, 19, 38, 및 53.3 cm 상단에서 측면 가장자리. 2.5, 20.3, 그리고 왼쪽 (그림 1)에서 38 cm 아래쪽 가장자리에서 1.3 c m의 구멍을 드릴 합니다.
      참고: 한 번에 6 ~ 10 시트의 스택에 대 한 드릴 프레스를 사용 하 여 가장 효율적 이지만 핸드 드릴을 사용할 수 있습니다.
   3. 아크릴에서 모든 보호 재를 제거 하 고 부드럽게 두 패널 상자 조립 전에 청소.

그림 1: 드릴된 구멍의 레이아웃. 구멍 뚫고 1.3 c m에서 2.5, 19, 38, 측면 가장자리 그리고 정상에서 53.3 cm 2.5, 20.3, 그리고 왼쪽된 여백에서 38 cm 아래쪽 가장자리에서 1.3 c m 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 측면과 하단 스페이서를 준비 합니다.
   1. 잘라 3 고밀도 폴 리 에틸렌 (HDPE)에서 상자 당 스페이서 또는 구매 두 미리 잘라 측면 스페이서 (0.635 cm 두께 2.5 c m, 길이 57 c m), 한 미리 잘라 아래쪽 공백 (0.635 cm 두께, 폭 2.5 c m, 길이 40.5 c m). 자료의 테이블을 참조 하십시오.
   2. 측면과 상자 아래쪽 전면 및 후면 패널 사이의 스페이서를 맞춥니다. 핸드 드릴 또는 드릴 프레스를 사용 하, 전면에 기존 구멍을 통해 드릴 고 구멍 모든 3 개의 층에 깔끔하게 통과 되도록 다시.
   3. 클램프를 사용 하 여 레이어 배치 또는 설치 하 여 볼트, 너트, 그리고 각 와셔의 조합을 새로 구멍을 뚫고 (단계 3.1 참조).

2. 상자 아래쪽에 폴 리 에스테 타격의 스트립의 설치

참고: 이용이 스페이서 사이 관절을 통해 새 기에서 토양 및 물 되지 것입니다.

1. 폴 리 에스테 여 넓은 2.5 cm로 타율을 잘라 40.5 cm 긴 스트립 ( 테이블의 자료를 참조).
2. 후면 패널 평면 및 그것의 위에 스페이서 거짓말, 하단 공백 바로 위에 타격을 최고 패널 (그림 2) 제자리에.

그림 2: 조립 타격과 rhizobox. rhizobox의 하단에 타격의 좁은 스트립 밖으로 유출에서 토양 및 모래를 방지 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

3입니다. 어셈블리는 Rhizoboxes의

1. Rhizoboxes 20 스레드 나사 (0.635 cm 직경에 의해 3.2 cm 길이), 세탁기 (0.635 cm 내부 직경), 육각 너트 (나사에 맞게 테이블의 자료를 참조 하십시오 크기를 사용 하 여 조립.
2. 세탁기, 전면 패널, 스페이서, 후면 패널, 세탁기, 그리고 육각 너트를 통해 각 나사를 조입니다. 나사는 매우 빡 빡; ㄴ 다는 것을 확인합니다 상자는 느슨하게 조립은, 토양 패널 및 측면 스페이서 사이 격차를 통해 밖으로 유출 된다.
   참고: 아크릴 쉽게 긁 히, 고 흠집 루트 측정을 방해할 수 있습니다, 그래서 주의 조립된 박스 처리. 보호 자료 들 사이 위치 하지 않는 한 스택 상자를 하지 마십시오.
3. 상자 당 2 명의 패치 스페이서 (간격 장치 치료 및 제어 패치를 생성 하는 데 사용)를 준비 합니다. 잘라 스페이서에서 고밀도 폴 리 에틸렌 (HDPE) 시트 또는 그들 자르는 (0.635 cm 두께, 너비 3.8 c m, 길이 28 m; 참조 테이블의 재료)를 구입. 하나는 드릴 구멍 0.635 cm 각 공백, (그림 3) 중간 라인을 따라 위에서 2 cm 직경에.

그림 3: 스페이서 패치. 나사 센터의 고밀도 폴 리 에틸렌 스트립을 통해 삽입 상자에 떨어지기에서 그들을 유지. rhizobox 같은 건 주변의 흙으로 가득, 토양 침수, 이며 같은 건 빈 치료 및 제어 패치를 남겨두기 위하여 제거 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

4. 너트와 함께 각 구멍을 통해 나사를 보호 하는 스페이서 부분적으로에 삽입 될 수 있는 rhizobox 나사가 그것을 방지할 수 때까지 추가 (그림 3).
   참고: 같은 건 주위 토양 접촉은 고는 스페이서 제거, 두 개의 빈 공간 유지 됩니다 때 하 수 가득 치료 패치 질소를 포함 하 고 제어 패치에 대 한 적절 한 기판.

4. 건물 PVC 프레임 각도에서 Rhizoboxes를 지원 하기 위해

참고: 상자 각도에 배치 됩니다, gravitropism 모든 뿌리 추적에 대 한 표시 되도록 후면 패널에 대 한 성장 뿌리 장려 것 이다. 그림 4 에서 rhizobox를 유지 하는 프레임에에서는 폴 리 염화 비닐 (PVC) 치수는 벤치에 약 55 ° 각도.

1. 1.3 cm 직경 PVC 상자 당 13 조각을 잘라: 2 × 44 ㎝ 길이, 3 × 42 c m 길이, 2 × 36.3 c m 길이, 2 × 25.4 cm 길이, 및 4 × 3.8 cm 길이 ( 재료의 표참조).
   참고: 절단 톱 효율성과 심지어 상처에 대 한 매우 좋습니다.
2. 4 × 2 방향 팔꿈치, 2 × 3 방향 팔꿈치, 그리고 4 T-조인트 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 그림 4와 같이 상자를 조립 하.
   참고: 프레임 추가 접착제 없이 안정 되어야 하지만 필요한 경우 PVC 접착제를 사용할 수 있습니다.

그림 4: rhizoboxes를 지원 하기 위해 프레임. 경량 프레임 PVC 지정 된 길이를 잘라내어 표시 공동 종류를 사용 하 여 연결에서 생성 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

5. 바느질 빛과 열을 반영 하기 위해 보호 케이스

참고: 뿌리 하지 마십시오 빛을, 그래서 이러한 경우 있는지 확인 하기 위해 빛을 제외 관찰 루트 소성 응답 빛 회피와 영양 소스 패치에 의해 구동 됩니다. 빛 부족 직물 또한 열 스트레스를 피할 수 있도록 rhizoboxes, 내부 온도 감소.

1. 빛 부족 직물 (전문된 자료를 1 개의 측에 백색과 검정에) 조각 약 95 c m 폭 및 길이 69 c m으로 잘라 ( 재료의 표참조). 상자 당 한 조각이 필요 합니다.
2. 47.5 c m × 69 c m 소매를 긴 가장자리를 따라 반으로 각 부분을 접어. 데님, 중장비 퀼 팅 실, 좁은 솔 기를 위한 재봉틀 바늘을 사용 하 여, 하단 및 각 소매의 측면까지 방법의 ¾ 따라 바느질. 안전 핀 함께 위쪽 모서리를 고정 합니다.

6. 1:1 (V/V) 토양의 준비: 모래는 Rhizoboxes을 채우기 위해 기판

1. 약 1000 cm³ 상자 당 (관심 사이트)에서 필드 토양을 수집 합니다. 60 ° c.에 얕은 쟁반에 일정 한 무게에 토양을 건조
   참고:이 실험에 대 한 토양 0\u201210 cm 깊이에서 유기적으 관리 되는 옥수수 밭에서 수확 직후 수집 되었다.
2. 박격포와 유 봉 2 mm 체를 통과 하는 토양을 갈아. 알려진된 볼륨 토양의 무게에 의해 토양의 대량 밀도 측정 합니다.
3. 모래 (놀이 모래, 철물점에서 저렴 하 게 구입하실 수 있습니다; 테이블의 자료참조) 등을 대량 밀도 측정 합니다.
4. 동일한 볼륨 모래와 흙을 양동이로 측정 하 고 철저 하 게 혼합. 퍼 널을 사용 하 여 채우기 위해 상자 천천히 그리고 고르게 2.5 cm, 상단에서 떨고 기판 정착 되도록 상자 없이. 이 볼륨 기판;의 측정 약 1,272 cm³이어야 한다.
5. 각 상자에 필요한 모래의 질량을 얻기 위해이 절반 볼륨에 의해 모래의 대량 밀도 곱하면 됩니다. 각 상자에 필요한 토양의 질량을 얻기 위해 토양의 대량 밀도와 같은 마십시오.
   참고: 필드 토양 및 모래가이 실험에 사용, 이것은 모래와 흙, 774 g 976 g 하지만이 금액 사용 토양의 대량 밀도 따라 달라 집니다.
6. Rhizobox 당 하나의 큰 지퍼 탑 비닐 봉투 라벨, 무게는 가방에 모래와 흙의 적절 한 대 중 하 고 철저 하 게 균질.
7. 이 1:1 토양 분석-고 영양 콘텐츠 및 ¹⁵N의 자연적인 풍부 (δ¹⁵N)에 대 한 기판.

7. 기판 준비 치료 및 컨트롤 패치

1. 두 개의 작은 지퍼 탑 비닐 봉지 당 rhizobox, 치료 패치 한 컨트롤 패치 한 라벨. 30 g는 토양의 무게: 각 큰 가방 (단계 6.6)에서 기판 두 해당 작은 가방에 모래.
2. 치료 패치에 대 한 ¹⁵질소 N 표시 된 소스와 기판 믹스. 이 위해 ¹⁵N 표시 된 식물 잔류물 또는 다른 N-소스 1 g으로 무게 (금액 조정 될 수 있다으로 원하는) 각 치료 가방 (작은 지퍼 상단 가방)에 철저 하 게 혼합 하 고.
   참고:이 실험을 위해 ¹⁵N 표시 된 클로버와 야생 완 두 잔류물의 혼합물은 사용 됩니다. 클로버, 야생 완 두 씨앗 질 석과 모래를 1:1 믹스에 심어 져 있었고 온실 조건 하에서 성장. 식물 했다 이온된 수로 매일 물 이나 긴 애쉬 튼 솔루션^{13 15}N 표시 된 질소 소스 포함의 1/100 강도 두번 주간. 모든 지상 바이오 매스 건조, 고 2 mm 체를 통과 하 땅, 후에 4 주에 수확 했다. 다른 영양소를 선택 하면 해당 요소는 토양에서 모바일 하는 경우에 특히 leaching에 대 한 테스트 파일럿 실험은 좋습니다. 느리게 출시 형태의 영양소를 사용할 수 또는 다른 rhizobox 디자인 leaching (예를 들어, 별도 구획¹⁰) 필요한 경우 제한 선택 될 수 있습니다.

8. 로드와 기판, Rhizobox와 치료 및 컨트롤 패치

1. 각 빈 rhizobox 무게 하 고 나중에 사용에 대 한 가중치를 기록 합니다.
2. 까지 나사 더에서 그들을 방지 한 rhizobox에 (단계 3.2 참조) 두 명의 패치 스페이서를 삽입 합니다. Rhizobox (그림 3) 측면에 빛 마크 아래쪽 가장자리의 깊이 표시 하 고는 스페이서를 제거 합니다.
3. 줄기 오프닝 퍼 널을 사용 하 여 rhizobox 오프닝으로 좁은, 표시 된 깊이에 기판의 해당 큰 가방에서 rhizobox를 작성. 앞뒤로 천천히 그리고 고르게 퍼 널을 이동 기판 균일 하 게 칠 하 고 우선 흐름 채널을 생성 하지 않습니다.
4. 기판 수준에 표시 된 깊이 도달 하면, 상자의 양쪽에서 5 cm에 다시는 스페이서를 넣어. 기판 (기판 가방에 남아 있어야 함) 상자 위에서 대략 5 cm는 될 때까지 상자를 채우는 것을 계속 한다.
5. 각 공백 주위 철저 하 게 젖은.
   참고:이 실험에서이 물방울이 미터 각 스페이서의 외부 가장자리와 rhizobox의 측면과 두 스페이서 사이 균등 하 게 물을 붓는 50 mL 사이 삽입을 통해 물 50 mL를 제공 함으로써 달성 되었다. 느린 관개는 균일 한 일로 필요 합니다.
6. 흙이 젖은, 패치에 대 한 빈 구멍을 떠나는 동안에 스페이서를 제거 합니다.
7. 각 rhizobox의 외부에 투명 필름 테이프 ( 재료의 표참조). 치료로 1 개의 측 및 제어로 표시 하 고 퍼 널을 사용 하 여 적절 한 가방에서 패치를 입력 합니다. 영구 마커를 사용 하 여 투명도에 각 패치의 경계를 추적 합니다.
8. 나머지 기판으로는 rhizobox를 균등 하 게 채우십시오. 투명도에 기판의 상단을 추적 합니다.
9. 나머지 rhizoboxes를 반복 합니다. 수확에 대 한 모든 가방을 저장 합니다.

9.도 60%에 급수 물 보유 용량

참고: 토양 수 분이이 양의 무산 소 조건 또는 조류 성장 개발을 방지 하는 동안 가뭄 스트레스를 겪고에서 식물을 방지 하기 위해 발견 되었습니다.

1. 기판¹⁴의 물 보유 용량 (WHC)를 측정 합니다.
2. 각 상자;의 이상적인 무게를 계산 여기 물 보유 용량을 60%에서 기판의 무게와 함께 빈 rhizobox의 무게의 합으로 정의.
3. 곱하기는 WHC (물의 그램 / 그램 건조 기판의) 물 질량을 얻기 위해 0.6으로 60%에서 기판에 개최 WHC. 건조 기판의 질량을 질량 ¹⁵N 소스의이 질량을 추가 합니다.
4. 위에서 얻은 숫자를 각 상자의 빈 무게를 추가 한다.
5. 그들은 입력 된 상자를 무게. 9.2 단계에서 계산 그것의 이상적인 중량 (g)에서이 시점에서 각 상자 (g)의 무게를 뺍니다. 천천히 그리고 고르게 물이이 양의 (mL)에 드 물 (디)를 이온화.
   참고:이 단계를 수행할 수 있습니다 또는 물방울 관개를 사용 하 여 손으로 급수. 손으로 급수 하는 경우 이기종 토양 수 분 조건 및 우대 흐름 채널에 더 많은 것을 추가 하기 전에 완전히 여과를 물을 수 있습니다.

10. 씨앗 발 아 및 이식

1. Unplanted 컨트롤을 사용 하 여, 그 rhizoboxes를 따로 설정.
2. 표면-소독 옥수수 씨앗 5 %NaOCl, 1 분 후 디 물에 철저 하 게 린스 교 반에 의해.
   참고:이 실험에서 6 다른 옥수수 genotypes의 씨앗 루트 소성 genotypic 차이 조사 하기 위하여 사용 되었다.
3. 접시 안에 (예를 들어, Kimwipe) 젖은 연구소 조직에 그들을 배치 하 고 다른 촉촉한 조직으로 취재 하 여 멸 균된 씨를 출 아 할. 거기에 서 있는 물 서는 안됩니다. 48\u201272 h는 radicle 그냥 등장 하기 시작 때까지 어두운 장소에서 장소 페 트리 요리.
4. 좁은 주걱을 사용 하 여 각 rhizobox의 센터에서 2.5 c m 깊이 구멍을 파 다. 보장 하는 radicle 지향 직접 구멍에 세균된 씨 이식 아래쪽.
   참고:는 radicle은 어느 패치 향해 직각, 편 파 수는 루트 성장 속도의 비교.
5. 투명도에 씨앗의 위치를 추적 합니다.
6. 씨와 디 물 50 mL를 함께 물 커버.

11. 식물 성장

1. 25 일 (원하는 만큼) 식물 성장, 60%를 유지 하 WHC 성장 기간 내내. 뿌리를 추적 하 여 모니터 루트 성장입니다.
2. 그것은 그것의 이상적인 무게 5g 이내까지 모든 3\u20124 일 및 물 각 상자 무게. 급수는 rhizoboxes 4 일 패널의 분리를 촉진 하기 위하여 수확을 하기 전에 중지 합니다. 잡 초를 손으로 자주를 제거 관심의 식물 뿌리만 있는지.
3. 영구 마커를 사용 하 여 각 추적 하루를 명확 하 게 구별할 수 색 3\u20124 일 마다 보이는 뿌리를 추적.
   참고: 다른 직경 마커 원하는 경우 기본 및 측면 루트에 사용할 수 있습니다. 그것은 주관의 학위 관련 여러 연구 추적 뿌리 될 경우에 특히 이후 또는 다른 주문 또는 직경의 뿌리는 다른 표식으로 구분할 경우 처음에 루트 추적에 대 한 조건을 정의 하려면 유용할 수 있습니다. 이 실험에서 양쪽에 보이는 뿌리를 추적 하 여 박스의 한 면에만 보이는 뿌리를 추적의 정확성 테스트 하 고 세척 하 고 뿌리를 스캔 하 여 측정 하는 전체 루트 길이 스캔된 투명에 측정 총 루트 길이 비교 합니다. 추적 및 스캔 루트 길이 사이의 상관 관계 여부 다시 투명도 또는 두 투명 사용 되었다에 중요 했다. 따라서 그냥 후면 패널에 보이는 뿌리를 추적할 수 있다.

12. 촬영, 수확 및 분석에 대 한 루트와 토양 샘플을 얻기

1. 첫 번째 rhizobox 누워 평평 하 고 모든 나사를 제거.
2. 촬영 샘플을 수확. 기지에서 촬영 클립, 디 물, 어떤 흙을 씻어 내 고 60 ° c.에 건조 갈기는 박격포와 유 봉 2 mm 체를 통과 하 여 동위 원소 분석 (섹션 14 참조)에 대 한 주석 캡슐에 샘플이 무게으로 쏜다.
3. 치료 및 제어 패치 주위 면도칼으로 잘라 가이드로, 투명도 사용 하 여. 숟가락이 나 주걱을 사용 하 여 각각 치료 또는 컨트롤 가방에는 뿌리와 접착 rhizosphere 토양을 특 종.
   참고: 별도 rhizosphere 토양에 존재 하는 많은 방법, 식물의 영향을 받아 토양 뿌리¹⁵, 그리고 그라데이션 보다는 엄격히 delineated 영역¹⁶는 rhizosphere 여겨질 수 있다, 하는 동안이 방법은 널리 사용 되 ¹⁷떨고 후 식물의 뿌리에 고착 하는 토양의 정의입니다.
4. 세 번째 가방으로 나머지 뿌리와 토양을 특 종.
5. 처리, 제어, 고 기판, 모든 보이는 뿌리 또는 파편 제거에서 뿌리를 분리 하는 2 mm 체를 통해 샘플을 대량 > 고급 핀셋으로 길이 1 cm. 이러한 샘플 3 루트의 총 다른 별도 및 3 기판 샘플 계속.

13. 경시 및 상대 루트 성장 속도의 추정의 유효성 검사

1. 처리, 제어, 검색 하 고 샘플을 대량 루트 길이 계산.
   1. 한 번에 하나의 예제와 함께 working, 뿌리 신중 하 게 모든 나머지 기판 제거 하 디 물으로 린스. 뿌리는 중복 하지 있도록 명확한 쟁반에 샘플을 정렬 합니다.
   2. 루트 분석 소프트웨어 (예: WinRhizo)와 호환 되는 스캐너를 사용 하 여 샘플을 검색 합니다. 이미지 배경에서 안정적으로 뿌리를 구별 하는 소프트웨어 보정 됩니다 확인 하십시오.
   3. 전체 루트 길이 관심 (예를 들어, < 0.2 m m, 0.2\u20120.4 m m, 0.4\u20120.8 m m, 0.8\u20121.6 m m, > 1.6 m m)의 직경 클래스에서 루트 길이 측정 하는 소프트웨어를 사용 합니다.
2. 루트 길이 밀도 (RLD) 치료 및 제어 패치 및 각 rhizobox에 대 한 전체적으로 계산 합니다.
   1. 각 투명도에 추적 영역을 곱하여 계산 처리 및 제어 패치의 볼륨 (단계 8.1 참조) 0.635 cm, 상자의 깊이 의해. 해당 볼륨을 사용 하 여 각 패치에서 총 루트 길이 사용 하 여 치료 및 제어 패치에서 루트 길이 밀도 계산 (단계 13.1.3 참조).
      
   2. 투명도에 추적 영역을 곱하여 계산 각 rhizobox에 기판의 볼륨 (단계 8.1 참조)에 의해 0.635 cm. 계산 RLD 치료 및 제어 패치에 관해서는.
      
3. 스캔 한 루트 시스템을 비교 하 여 메서드를 추적 하 고 추적 이미지 루트를 확인 합니다.
   1. 각 투명도 검사 하 고 전체 루트 길이 소프트웨어를 사용 하 여 계산. 성장에 대 한 스캔된 이미지 저장 속도 계산 합니다.
   2. 전체 루트 길이 측정, 제어, 처리의 합계 및 각 상자에 대 한 샘플을 대량 (단계 13.1.3 참조).
   3. 통계적으로 유의 한 상관 관계 인지를 확인 전체 루트 길이의 스캔 및 추적 측정 테스트.
      참고: 그렇다면, 추적 방법의 유효성을 검사 하 고 각 시간 지점에서 상대 성장 속도 계산할 수 있다. 그렇지 않은 경우에 스캔된 루트 시스템 데이터 루트 성장의 정확한 표시를 제공 합니다. 이 경우 추적 방법론 일치 하지 않은 경우 또는 뿌리 예를 들어 모든 genotypes에 대 한 동일 하 게 표시 되지 않은 경우 수 있습니다.
4. 추적 메서드는 유효성을 검사 하는 경우 각 rhizobox에 대 한 상대적인 루트 성장 속도 계산 합니다.
   1. 교정 치료, 컨트롤, 전체 루트 길이 측정 하 여 각 시간 지점에서 샘플을 대량 선택한 추적 색상 구분 하 루트 분석 소프트웨어를 사용 합니다. 각 시간 지점에서 누적 총 루트 길이 계산 합니다.
   2. 치료 및 각 시간 간격 t₁-t₂ 에 대 한 컨트롤 패치 뿐만 아니라 각 rhizobox에 대 한 상대적인 루트 성장 속도 (RGR_루트)를 다음과 같이 계산 합니다.
      
      참고: 여기 L₁ 패치 (11.3에서 누적 합계) 총 루트 길이 t (DAT) 이식 후₁ 일 이며 L₂는 t₂ DAT. 패치 총 루트 길이

14. ¹⁵N 루트, 촬영, 및 치료 토양 샘플 중 분할의 분석

1. 60 ° C에서 건조 뿌리 그리고 바이오 매스, 무게 2 mm 체를 통과 하는 그 라인 드.
2. 60 ° c.에 치료 토양의 건조 샘플이
3. 촬영과 같이 뿌리와 주석 캡슐에 치료 패키지.
   참고: 이상적인 샘플 무게 캡슐 당 싹, 뿌리, 및 토양 분석에 대 한 총 N의 목표 금액을 달성 하기 위해 자료의 예상된 c/N 비율에 따라 별도로 계산 되어야 한다. 샘플에 대 한 자세한 제출 하는 안정 동위 원소 시설에 문의. 이 실험에 대 한 샘플 준비 지침 및 샘플 무게 계산기 UC 데이비스 안정 동위 원소 시설을 제공한 뒤¹⁸했다.
   주의: 캡슐에 포장 전에 균등 하 게 샘플을 혼합 하 여 여러 캡슐 샘플 당 준비 특별 한 주의. 샘플 균등 하 게 혼합 되지 ¹⁵N의 명백한 복구 원래 현재 금액을 초과할 수 있습니다.
4. 총 N, δ15, 및 각 촬영, 루트 및 치료 토양 샘플의 ¹⁵N 콘텐츠를 분석 합니다.
   참고:이 실험에서 식물 샘플 분석 되었다 연소를 통해 PDZ 유로 파 머-GSL 원소 분석기 PDZ 유로 파 20-20 동위 원소 비율 질량 분석기에서 UC 데이비스 안정 동위 원소 시설 (UCD SIF) 인터페이스와 함께. 토양 샘플은 PDZ 유로 파 20-20 동위 원소 비율 질량 분 서 계에 UCD SIF 인터페이스 Elementar Vario 엘 큐브 원소 분석기로 분석 되었다.
5. 양을 계산 ¹⁵공장에서 라벨에서 얻은 N의 촬영 및 샘플 루트.
   1. 첫째, ¹⁵N 대기 ¹⁵N 각 풀 ¹⁵P *초과 금액 계산:
      
      여기서 ¹⁵P 관심의 수영장의 원자에서 ¹⁵N 콘텐츠입니다.
   2. 둘째, ¹⁵N 대기 ¹⁵N 레이블에서 ¹⁵L *초과 금액 계산:
      
      여기서 ¹⁵L 레이블이 N 소스의 원자에서 ¹⁵N 콘텐츠입니다.
   3. 셋째, 각 풀, N_p에 총 N의 계산:
      
      여기서 m_p 는 풀 (예: 총 건조 촬영 또는 루트 바이오 매스)와 %_p 의 질량은 그 풀의 N의 %.
   4. 마지막으로, 레이블, N_l에서 얻은 N의 양을 계산 하 Ndff 방정식¹⁹ 에 14.5.1\u201214.5.3의 결과 사용:
      
      참고: Ndff 방정식은 식물에 의해 복구 되는 레이블이 지정 된 소스에서 N의 양을 결정 하는 데 사용 됩니다. 그것은 가정 동위 원소 차별 N 통풍 관 식물에 의해 발생 하는 일반적으로 N 소스 풍부한 ~1\u201210%¹⁹.

뿌리는 상자 뒷면에 대 한 우선적으로 성장 예상. 총은 400에서 상자의 앞에 93-758 cm에 비해 1956 cm에 배열 했다 상자 뒷면에 루트 길이 추적. 스캔된 루트 길이와 상자, 상자, 다시의 앞에 추적된 루트 길이 없음을 피어슨 상관 계수 계산 그리고 전면 및 후면의 합 여부 전체 루트 길이 반영 정확 하 게 추적 확인 하 사용 되었다 (n = 23, 한 상자에 공장 사망 실험 기간 동안). 스캔된 전체 루트 길이 크게 상자의 뒷면에 추적된 루트 길이와 상관 했다 (그림 5A, p = 0.0059), 상자 앞 (그림 5B, p = 0.022), 그리고 다시 앞의 합 (그림 5C, p = 0.0036). 따라서 주는 뿌리를 추적 하는 데 필요한 시간을 등분 하는 동안 루트 성장의 대표적인 측정으로 유효성이 검사 됩니다만 상자의 뒷면을 추적. 그러나 그것은,, 그 추적 캡처의 전체 루트 길이 21.6 54.6%만 주목 한다. 뿌리는 rhizobox의 표면에 대해 우선적으로 성장 할 하는 동안 좋은 측면 뿌리 특히 않을 수 있습니다 추적에 대 한 표시. 시간이 지남에, 특히 초기 개발에 추적 루트 길이의 상대적 비교에 적합 하지만 수확 및 루트 시스템을 스캔 하는 것이 좋습니다 목표 총 루트 길이 정확 하 게 계량 하는 경우.

그림 5: 상관 관계 사이 추적 하 고 루트 길이 데이터 스캔. A) 박스만 앞면은 추적 하는 경우 추적 루트 길이 크게 스캔 한 루트 길이와 상관 했다. B) 추적 상자; 앞에 스캔된 루트 길이 대 한 회귀의 R2 값을 향상 어디 뿌리의 대부분은 표시 했다, 상자의 뒤에 뿌리를 추적 상관 관계는 중요 한 다시. C)는 가장 정확한 방법은 추적 뿌리 상자의 양쪽에 세 가지 방법 중 가장 높은 R2 값으로 표시 된 것 처럼 하 고 중요 한 상호 스캔 루트 길이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

시간이 지남에 루트 성장 속도 같이 일관 된 슬로프에 의해 시간 (그림 6)에 대 한 총 루트 길이의 자연 로그를 플롯할 때 상자 사이 유사 했다. 약간의 변화는 예상 될 것 인 하는 동안 일관 된 성장 속도 실험 조건 모든 상자에 대 한 통일 된 나타냅니다. 극적으로 다른 슬로프 변수 온도 또는 습기 등에서 차이를 확인 하는 필요를 제안 하는 서로 다른 속도로 식물 성장 했다 나타내는 것입니다.

그림 6: 시간이 지남에 성장 속도 루트. Rhizoboxes 중 시간 대 루트 길이 비슷한 슬로프 뿌리 같은 속도로 성장 나타냅니다. 비균일 슬로프 실험 조건 rhizoboxes 마다 다 나타낼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

모든 옥수수 genotypes의 뿌리 15N 표시 된 덮개 작물 잔류물을 포함 하는 패치에서 확산. 패치 종류와 유전자 형으로 양방향 ANOVA 고정 요인 (n = 23) 루트 길이 밀도 스캔된 루트 데이터를 사용 하 여 컨트롤 패치 보다 치료에 더 높은 밝혔다 (그림 7a, p = 0.013) 뿐만 아니라 추적된 루트 데이터 (그림 7b, p = 0.005). RLD는 genotypes 두 경우에서 가운데 크게 다른 아니었다.

그림 7: 유전자 형 및 루트 데이터 형식. 길이 밀도 루트는) 스캔된 루트 데이터 모든 genotypes (A-F) 확산 처리 (T) 패치 및 genotypic 차이 상당한 했다 보여주었다. b) 수확 및 콩과 식물 잔류물, 하지만 하지 유전자 형의 중요 한 효과 확인 하는 스캔된 루트 데이터 (A-F), 길이 밀도 패치에서 루트. 문자 A-F 6 다른 genotypes 나타내고 오차 막대 표준 오류를 나타냅니다. C: 제어; T: 치료입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

루트 직경 루트 함수 및 매출에 대 한 추론을 사용할 수 있습니다. 정밀한 뿌리 옆 뿌리를 빠르게 개발 하 고 큰 굵은 뿌리는 더 긴, 느린 응답 축 뿌리 될 가능성이 응답 리소스 핫스팟으로 확산 될 가능성이 더 높습니다. 각 직경 클래스에서 뿌리의 비율에 대 한 스캔된 루트 시스템 분석 했다: < 0.2 m m, 0.2-0.4 m m, 0.4-0.8 m m, 0.8-1.6 m m, 그리고 > 1.6 m m, 그리고 각 크기 클래스 genotypic 차이 대 한 테스트 되었습니다. 더 정밀한 뿌리 치료 패치 genotypes 더 효과적인 확산 응답을 나타낼 수 있습니다. 고정된 요인으로 유전자 형을 가진 일방통행 ANOVA (n = 23) genotypes 루트 시스템 전체 (그림 8a), 치료 패치 (그림 8b), 각 크기 클래스에서 루트 길이 다 또는 패치 (그림 8c)를 제어 하지 않았다 밝혀. 뿌리의 대부분은 잘 뿌리 (< 0.2 m m).

그림 8: 유전자 형 및 위치 다른 직경 클래스에 뿌리의 비율. 한) 각 rhizobox (를 제외 하 고 치료 및 제어 패치), 뿌리의 대부분은 괜 찮 아 요 (< 직경에서 0.2 m m). Genotypes 각 직경 클래스에서 뿌리의 비율에 다 하지 않았다. b) 치료 패치, 마찬가지로 크기 클래스 당 루트 길이 genotypes 걸쳐 직경을 증가 함께 감소. c) 제어 패치 같은 패턴 특징 이었다. 문자 A-F 6 다른 genotypes 나타내고 오차 막대 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

라벨 N 촬영에 보다 높았다 루트 샘플 샘플 유형 양방향 ANOVA에 따르면 genotypes 및 유전자 형 고정된 요인으로 (n = 23, 그림 9), 77-81% 치료 패치에서 채택 하는 N의 촬영 중에 뿌리에서 translocated 했다 보여주는 실험입니다. 일방통행 ANOVA (n = 23)는 δ15N 루트의 고 촬영 샘플 하지 유전자 형에 따라 다 않았다.

그림 9: 콩과 식물 뿌리와 새싹에 수확에 찌 꺼 기에서 얻은 질소. 모든 genotypes 15N 표시 된 콩과 식물 잔류물을 포함 하는 패치에서 N 차지에 동등 하 게 효과적 이었다. N 패치에서 촬영의 대부분은 촬영에 뿌리에서 translocated 했다. 문자 A-F 6 다른 genotypes 나타내고 오차 막대 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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