불연속 밀도 그라디언트를 사용 하 여 캡슐 양만큼 박테리아를 분리

많은 세균성 종의 면역 체계에 의해 인식 및 살인 및 다양 한 물리적 스트레스에서 세균성 세포를 보호 하는 다 당 류 캡슐을 생산. Klebsiella 균, 캡슐 생산에서는 감염^1,2대 한 절대적인 요구 사항입니다. K. 균 캡슐 항균 성 펩 티 드에 대 한 저항, 보완-중재 살인, 먹어서, 예방 및 타고 난 면역 반응³의 탄압에 저항을 중재 한다. 초과 캡슐 생산 증가 독성 및 감염 (nosocomial) 보다 지역 사회 인수⁴와 연결 됩니다.

다양 한 양적 및 질적 테스트 캡슐 생산 조사 사용할 수 있습니다. Klebsiella 종,이는 문자열 테스트⁵, 식민지에 게 감동이 쑤 시 게 위쪽으로 당겨 및 생성 하는 문자열의 길이 측정, 그리고 mucoviscosity 분석 결과⁶의 느린 원심 분리를 포함 포함 뒤에 상쾌한의 광학 밀도 측정 하는 문화. 이 메서드는 간단 하 고 신속 하 게, 하지만 부족 감도 클래식 Klebsiella 에 사용 될 때 캡슐 overproducing 긴장 보다 변종. 캡슐 정량화의 다른 방법은 uronic 산 분석 결과, 기술적으로 도전 이며 집중된 한 황산¹사용 해야 합니다. 마지막으로, 캡슐 현미경 검사 법 (그림 1A)에 의해 직접 표시 됩니다. 이러한 방법 중만 현미경 사용자에 게 단일 인구 내의 다른 capsulation 상태를 관찰 하 고 아무도 이러한 메서드의 capsulated 및 비 capsulated 박테리아의 물리적 분리를 가능 하 게.

그라데이션 원심 분리에 의해 밀도 기반 분판 정기적으로 다른 진 핵 세포 유형⁷, 정화 세포 생물학에서 사용 하지만 거의 미생물 연구에 사용 됩니다. Klebsiella 의 mucoviscosity 분석 결과 매우 capsulated 박테리아, 원심 분리 하 여 펠 렛을 더 많은 시간이 걸릴 그리고 우리 capsulated 세포의 감소 된 전반적인 밀도 인해 있을 수 있습니다이 권유 관찰을 기반으로 합니다. 여기 나와 있는 메서드 캡슐 크기, 조밀도 기온 변화도 원심 분리 (그림 1)를 사용 하 여 물리적으로 K. 균 인구를 분리 하기 위하여 개발 되었다. 이 메서드는 구 균, 다른 세균 종에 적용 되는 나타내는에 성공적으로 적용 되었습니다. 포화 transposon 돌연변이 라이브러리의 밀도 기울기 분리 결합 transposon 삽입 시퀀싱 (밀도-TraDISort) 캡슐 생산 및 규제⁸에 관련 된 유전자를 식별 하는 데 사용 되었습니다. 마찬가지로,이 방법은 비 capsulated K. 균 을 무작위 프라임 연쇄 반응 (PCR) 개별 식민지의와 함께에서 사용 되었다 돌연변이. 이 메서드는 또한 다른 인구와 조건, 또는 복잡 한 샘플 (그림 1B)에서 capsulated 박테리아 정화 캡슐 생산의 빠른 비교를 위해 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 셀 크기 또는 집계 등 밀도 영향을 주는 다른 고기를 시험 하는 옵션이입니다.

이 원고 새로운 세균성 종 또는 스트레인에 대 한 절차를 최적화 하는 방법을 보여을 건설 및 불연속 밀도 그라디언트 하이퍼-capsulated, capsulated 및 capsulated 비 박테리아 분리의 실행을 보여 줍니다.

참고: 그 어떤 위험 평가 세균성 긴장에 적용 준수 하 경작 하 고 샘플을 처리 하는 경우 확인 하십시오. 한 번에 너무 많은 그라디언트를 설정 하는 관련 된 느린 pipetting에서 관절에 압력 때문에 근 골격 계 질환으로 이어질 수 있습니다 다는 것을 유의 하십시오. 작업을 계획 하 고 부상을 피하기 위해 주의.

1. 세균성 긴장 또는 돌연변이 라이브러리의 준비

1. 적절 한 한 천 배지에서 테스트할 긴장 밖으로 행진. 이들은 실험에 대 한 재고 번호판입니다.
   1. 단일 식민지를 달성 하기 위해 원하는 온도에서 하룻밤 접시를 품 어. 이 실험이, Luria 국물 (파운드) 한 천 미 균 (23F 야생 유형 및 23F Δcps) 37 ° C에서 37 ° c.에 습도 초 항아리에 혈액 한 천에에 K. 균 (NTUH-K2044 및 ATCC43816 변종) 문화
2. 메 마른 루프 또는 칵테일 막대기를 사용 하 여 적절 한 국물의 10 mL를 접종 하는 주식 접시 (단계 1.1)에서 단일 식민지를 선택 합니다. 무작위 돌연변이 라이브러리의 심사에 대 한 무작위 돌연변이 라이브러리 (TraDIS 라이브러리)의 10 µ L로 국물을 접종.
   1. 떨고, 37 ° C에 낮은 소금 파운드 미디어에서 K. 균 긴장과 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 미디어, 37 ° c.에 정적으로 미 균 긴장을 품 어
   2. 15 mL 튜브와 양동이 15 mL 튜브 삽입 및에 어로 졸 꽉 뚜껑 밖으로 스윙에서 3200 x g에서 10 분 동안 벤치 가기 원심 분리기에 원심 분리기를 숙박 문화를 전송 합니다.
   3. 삭제는 상쾌한 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 2 mL에 펠 릿을 resuspend.
      참고: 표면에 뜨는 통해 의 폐기는 실험실에서 적절 한 액체 생물 학적 폐기물 경로. 원심 분리 및 물의 resuspension 단계 (1.2.2, 1.2.3)의 목적은 그라데이션에 쉽게 시각화를 위한 박테리아를 집중 하는 것입니다. 세균성 문화 선호 하는 경우 그라디언트에 직접 로드할 수 있습니다. 무 겁 게 capsulated 긴장 단단한 펠 릿을 형성 하지 않을 수 있습니다. 이 경우 제거 만큼 상쾌한 가능한 모든 세균성 세포를 제거 하지 않고 1 x PBS 5 mL의 최종 볼륨을 더하고 펠 릿 resuspend. 계속 단계 1.2.5 프로토콜.
   4. 비 mucoid 변종에 대 한 단계 2로 이동 합니다.
   5. 1.2.2 단계에서 설명한 대로 튜브 원심.
   6. 삭제는 상쾌한 고 1 x PBS의 2 mL에 펠 릿을 resuspend. 셀 이제 사용할 준비가 됩니다.
      참고: 세균성 세포 현 탁 액의 밀도 중요 하지 않습니다 하지만에서 시각화에 대 한 충분 합니다. 최소 세₆₀₀ (600에서 광학 밀도 nm) 4의 제안 이다.

2. 그라데이션 희석 및 미니 그라데이션 테스트 준비

1. 그라데이션 희석을 준비 합니다.
   참고: 좋은 분리를 달성 하기 위해 밀도 기울기에 필요한 밀도 그라데이션 매체 (예, Percoll)의 정확한 농도 사용 세균성 긴장 및 성장 조건에 따라 달라 집니다. 미니 그라데이션 테스트 최고의 분리를 줄 것 이다 농도 식별 하기 위해 먼저 수행 됩니다. 이들은 500 µ L 2 mL 튜브에 단일 희석의 구성. 경우 박테리아는 그라데이션에서 추출 하 고 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 subcultured 것입니다, 다음이 단계는 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.
   1. 결합 밀도 그라데이션 중간 밀도 그라데이션 희석 수 있도록 1 x PBS. 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 및 80%의 희석을 확인 (예:, 2 mL 밀도의 그라데이션 매체 플러스 8 mL 1 x PBS의 20% 밀도 그라데이션 매체의 10 mL =).
   2. 테스트할 각 변형에 대 한 2 mL 튜브에 그라데이션 20% 희석의 aliquot 500 µ L (예:, 4 긴장 20% 그라데이션 희석의 500 µ L을 포함 하는 4 관 =).
   3. 그라데이션 희석의 나머지 부분에 대 한 단계 2.1.2를 반복 합니다.
2. 박테리아는 그라디언트를 적용 합니다.
   1. 1.2.3 단계와 단계에서 1.2.6 다음 단계 각 그라데이션 희석의 상단에 준비 하는 세균성 세포의 100 µ L를 적용 합니다.
      1. 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 셀의 100 µ L를가지고 고 바로 미니 그라데이션의 초승달 아래 튜브 측에 피 펫 팁을 배치.
      2. 그들은 모든 인터페이스의 혼합 없이, 그라디언트 상단 레이어 구성 그라데이션에 세균성 세포를 매우 천천히 발음.
      3. 테스트할 모든 변종에 대 한 단계 2.2.1.1–2.2.1.2를 반복 합니다.
   2. 에 어로 졸 꽉 뚜껑 고정된 각도 터를 사용 하 여, 원심 8000 x g에서 10 분 동안 microcentrifuge에 있는 준비 관.
   3. 원심, 후 바로 원심 분리 다음 그라디언트 레이어 위에 세포를 유지 하는 데 필요한 최소 그라데이션 희석을 시각화 하는 랙 튜브를 전송 합니다.
   4. 결과 명확 하지 않습니다, 경우 단위로 5% 밀도 그라데이션 중간 희석 위의 미니 그라데이션 테스트를 반복 그리고 농도에 정의 된 아래 2.1.1 단계 (예:, 25%와 35% 희석 테스트 해야 30% 결과가 모호한 경우).
      참고: 그림 2A 단일 밀도 그라데이션 중간 희석에 전형적인 결과 대 한 참조 하십시오.
   5. 2.2.3–2.2.4 단계에서에서 결과 사용 하 여 대규모 불연속 그라디언트에 세포를 분리 하는 데 사용할 이상적인 그라데이션 희석을 결정.

3. 주요 실험에 대 한 셀의 준비

1. 1.2 단계에 설명 된 대로 적절 한 국물의 10 mL를 접종 하 여 신선한 숙박 문화를 준비 합니다.
   1. 1.2.1 단계에 설명 된 대로 적절 한 조건에서 숙박 문화를 품 어.
   2. 1.2.2 단계에서 설명한 대로 숙박 문화를 펠 렛.
2. 1.2.3 단계에서 설명한 대로 셀을 씻어.
3. 삭제는 상쾌한 고 1 x PBS의 1 mL에 펠 릿을 resuspend. 긴장과 mucoid은 쉽게 작은 하지 않습니다, 경우 최대 2 ml PBS 또는 잔여 미디어의 펠 릿을 resuspend. 셀 이제 사용할 준비가 됩니다.

4입니다. 불연속 밀도 기울기의 준비

참고: (이상 집중)를 피 펫을 사용 하 여 맨 아래 (가장 집중)에서 그라데이션 준비의 다른 방법은 7 단계에서 설명 되어 있습니다.

1. 피펫으로 5ml 폴 리 프로필 렌으로 가장 희석 밀도 그라데이션 희석의 1 mL 라운드 하단 튜브 그라데이션의 맨, 가장 희석 층을 형성 하.
   참고: 더 집중된 그라데이션 희석의 후속 레이어 레이어 방해를 하지는 바늘을 사용 하 여이 레이어 아래 추가 됩니다. 2의 최소 및 최대 3 개의 그라디언트 레이어 1 mL의 강력한 분리 및 박테리아의 쉬운 시각화 권장 됩니다.
   1. 1.5 인치 1 mL 일회용 주사기를 사용 하 여 바늘 연결 된, 다음 가장 집중된 밀도 그라데이션 중간 희석의 주사기에 1 mL. 하지 마십시오 어떤 공기 차지 거품 그라데이션 레이어를 혼란 시킬 수 있다.
   2. 첫 번째 레이어를 포함 하는 튜브의 아래쪽에 바늘 끝을 놓습니다. 인터페이스를 혼합 하지 않으려면 매우 천천히 주사기 내용을 발음.
      참고: 두 희석의 인터페이스는 더 집중된 그라데이션 희석 추가 상승할 것 이다. 빛 또는 외부 창 들고 하 여 인터페이스를 관찰 합니다. 없는 독특한 인터페이스를 관찰 하는 경우 그라디언트를 삭제 하 고 다시 시작 합니다.
      1. 그라데이션에서 바늘을 제거 아주 부드럽게 다른 그라데이션 희석 사이의 인터페이스를 방해를 하지 않도록 합니다. 똑바로 유지에 적합 한 랙 튜브를 놓습니다.
   3. 3 다른 희석을 사용 하는 조밀 희석 하단에 단계 4.1.1–4.1.2.1를 반복 합니다. 그라데이션 성공적으로 생성 된 인터페이스에 아무 혼합과 세 가지 레이어 있을 것입니다.

5. 그라디언트를 원심 분리 하 여 분리 준비 셀 추가

1. 추가 준비 셀의 600 µ L 단계 3.3에서에서 그라데이션 튜브에서의 상단에 매우 천천히 그리고 인터페이스를 혼합 하지 않고 단계 2.2에서에서 설명한 대로.
2. 튜브 어댑터에서 튜브를 배치 하 고 그들은 균형을 보장 하기 위해 결합 된 어댑터와 튜브 무게.
   1. 벤치 가기 원심 분리기 내의 고정된 각도 터 튜브 어댑터를 놓습니다. 3000 x g에서 30 분 동안 원심 분리기.
   2. 원심, 후 조심 스럽게 제거 튜브, 적당 한 선반에 넣어 하 고 기록으로 결과 사진.
3. 다음 단계 6 uronic 산 정량화 또는 DNA 추출에 대 한 세균 분수를 복구 합니다.
   1. 경우 다운스트림 응용 프로그램 필요 하지 않습니다, 폐기 를 통해 샘플/그라디언트는 실험실에서 적절 한 액체 생물 학적 폐기물 경로.
      참고: 그것은 박테리아의 새로운 종/변종에 대 한 분리의 유효성을 검사 해야 합니다. 그라데이션에서 개별 분수 uronic 산 성 시험 (8 단계), 또는 다른 적합 한 양적 분석 각 분수의 캡슐 형을 확인 하 여 현미경 검사 법에 의해 시험 되어야 한다. 목표 하는 경우 집계 또는 셀 크기에 따라 분리, 독립 적절 한 분석 실험을 사용 해야 합니다.

6. 샘플 분수와 선택적 파생물 단계 복구

1. 제거 하 고 해당 계층 내에서 세균 분수 없는 경우 최고 희석에서 액체를 삭제 하 여 그라데이션에서 분수를 복구할.
   1. 최고 분수를 제거 하려면 P200 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 분수, 그라데이션을 통해 피 펫 팁을 전달 하 고 분수를 차지. 1.5 mL 튜브에 분수를 배치 하 고 적절 하 게 라벨.
   2. 여전히 P200 피 펫을 사용 하 여 추가 분수를 복구 하는 팁 부드럽게 분수에 그라디언트를 통해 삽입 하 고 신선한 1.5 mL 튜브에 분수를 복구 합니다. 분수는 그라디언트 아래로 낮은 액세스 초과 그라디언트를 제거 합니다.
   3. 매우 낮은 셀 번호를 포함 하는 분수에서 DNA 추출 단계의 더 많은 세포를 얻기 위해 선택적 파생물에 대 한 6.2는 프로토콜에 따라 필요 (예를 들어, 밀도-TraDISort), subculture 분수 경우.
      참고: 분수를 위에서 아래로 제거 됩니다으로 낮은 조각으로 그라데이션 맨 셀에서 carryover의 낮은 수준 있을 것입니다. 신중 하 게 협력 하 여 이것을 최소화 고 carryover 결과 영향을 미칠 수 있는 매우 낮은 풍부 샘플-정화를 수행 하 여 낮은 분수를 제거 하는 바늘을 사용 하 여 그라디언트, 혼합 수 없습니다.
2. 적절 한 액체 미디어의 5 mL으로 단계 6.1.1–6.1.2에서 복구 된 낮은 풍부 분수에서 전송 셀. 인큐베이터에 배치 하 고 37 ° c.에서 2 h 동안 성장
   1. 2 h의 성장 또는 샘플 1의 OD₆₀₀ 에 도달 했습니다 때, 후 15 mL 튜브에 문화를 전송 합니다. 양동이에 어로 졸 꽉 뚜껑 밖으로 스윙을 원심 분리기에 3200 x g 에서 10 분 동안 튜브 원심 삭제는 상쾌한
   2. 1 x PBS의 1 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.
3. 5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 신선한 단일 농도 밀도 그라디언트를 준비 합니다. 바로 위에 원래에서 분수의 위치에서 그라데이션 농도 사용 하 여 (예: 그림 2D에 15% 밀도 그라데이션 매체 사용 될 것 이라고 표시 된 ΔslyA 돌연변이의 정화).
   참고: 이-정화 단계는 선택적입니다.
   1. 셀 그라데이션 2.2 및 5.1 단계에 설명 된 대로 원심 분리기의 상단에 적용 됩니다.
   2. 원심 분리기에서 튜브를 제거 하 고 적절 한 선반에 장소. 그라데이션 사진 하 고 DNA 추출 6.1-6.1.2에 설명 된 대로 분수를 복구.
      참고: 이 예제는 지금 DNA 추출 또는 기타 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 준비.

7. 대체 방법 (이상 집중)를 피 펫을 사용 하 여 맨 아래 (가장 집중)에서 그라데이션 준비

1. 2.2.3 단계에서 결정 된 그라데이션 희석 사용 합니다. 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여, 5 mL 튜브에 조밀 그라데이션 희석의 1 mL를 추가 합니다.
   1. 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 추가 다음 짙은 그라데이션 희석의 200 µ L 매우 느리게 인터페이스를 혼합에 하지 튜브에서 레이어의 상단에. 또 다른 200 µ L 고 다음은 최종 600 µ L. 여러 작은 볼륨 제공 더 pipetting 속도 제어 및 인터페이스의 혼합 방지 추가 추가 합니다. 인터페이스 믹스, 삭제 하 고 다시 시작 합니다.
   2. 3 희석 사용 되는 경우 셋째, 최소한 빽빽한 그라데이션 농도로 7.1.1 단계를 반복 합니다. 튜브는 이제 2 mL 또는 단계 2.2.3에서에서 결과 따라 3 mL의 그라디언트 있어야 합니다.
   3. 셀을 추가 하 고 실험을 계속 하는 프로토콜의 단계 5로 이동 합니다.

8. 캡슐 크기 Uronic 산 분석 결과의 측정

1. PBS 가진 희석에 의해 각 복구 된 분수 4.0의 OD₆₀₀ 를 조정 합니다. 이전에 게시¹uronic 산의 정량화와 함께 진행 합니다.

대표 결과 그림 2에 표시 됩니다. 기대 하는 정확한 결과 세균 종의 밀도 기울기의 설정에 따라 달라 집니다 및 단일 스트레인 또는 돌연변이의 풀 사용자는 검토 여부. 그림 2A 와 같이 대부분 종자는 그라데이션 내에서 단일 위치로 마이그레이션됩니다 및 2D. 세균성 돌연변이 라이브러리 메서드 적용 그라데이션, 그라데이션, 그리고 맨 아래 (그림 2B)에 작은 acapsular 분수의 최고 층을 통해 배포 적은 밀도 밴드 위에 주요 밴드 상승을 줄 것 이다. 이 분수 uronic 산 (그림 2B)에 대 한 분석 결과에서 보는 바와 같이 캡슐 금액에 차이가 있습니다. K. 균 ATCC43816의 캡슐 생 합성 로커 스에 대 한 같이 다른 그라데이션 분수 내 특정 돌연변이의 명확한 지역화에 개별 분수의 transposon 삽입 시퀀싱 결과 (그림 2C). K. 균 NTUH-K2044 및 미 균그리고 다른 캡슐 생 합성 또는 규제 돌연변이의 순수한 문화에 대 한 대표적인 결과 그림 2D에 표시 됩니다.

그림 1 : 박테리아 캡슐, 그리고 그것의 신청에 따라 별도로 밀도 원심 분리 방법의 도식. (A) capsulated Klebsiella 균 의 전자 현미경 이미지 셀입니다. 캡슐 셀의 외부에 조밀한 레이어로 표시 됩니다. (B) capsulated 박테리아의 학문에 밀도 원심 분리에의 응용 프로그램입니다. (Bi) 밀도 분리 transposon 돌연변이 도서관의 높은-, 낮은-, 및 아니오 캡슐 분수를 생성 하는 데 사용 하 고 transposon 삽입 시퀀싱 캡슐 생산에 영향을 주는 유전자를 정의 하 여 다음 수 있습니다. (Bii) 복잡 한 샘플에서 capsulated 박테리아의 정화입니다. (Biii) 샘플 사이의 캡슐 금액의 빠른 비교에 대 한 밀도 기반 분리의 사용. 이 방법은 또한 수 이기종 캡슐 생산의 시각화 세균성 인구에서 (Biii)와 같이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 대표적인 결과. (A) 미니 그라데이션 테스트에서 출력의 예입니다. 2 다른 K. 균 종자 15% 밀도 그라데이션 매체의 1 mL에 centrifuged 했다. ATCC43816 (이 게 적은 캡슐) 레이어의 아래쪽 마이그레이션합니다 동안 hypermucoviscous NTUH K2044 스트레인 밀도 그라데이션 중간 레이어 위에 유지 됩니다. (Bi) 3 조각으로 transposon 돌연변이 라이브러리를 분리 하는 밀도 그라데이션의 사용. 참고 바닥 분수 돌연변이의 낮은 비율을 포함 하 고이 사진에 표시 되지 않습니다. (Bii) 위쪽, 중간, 및 바닥 분수 uronic 산에 대 한 분석 결과 사용 하 여 다른 캡슐의 유효성 검사. 셀 위쪽, 중간, 및 능가 해 바닥 분수 고립 되었고 4,600 명이 PBS에 resuspended에서 다음 캡슐 다 당 류 추출 및 uronic 산 측정1. (C) 예 밀도 TraDISort 결과. 변이 위치 식별 염색체 다이어그램 위에 파란색 라인으로 표시 됩니다. 뮤턴트 캡슐 부족 그 입력된 라이브러리에 존재 하지만 캡슐 생 합성 로커 스8에 대 한 그림과 같이 바닥 분수에서 농축 되는 동안 최고 분수에 고갈로 식별할 수 있습니다. (D) 야생 유형 및 K. 균 NTUH-K2044 및 미 균 23F의 돌연변이 체 긴장 사이 캡슐 금액 비교 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

저자는 공개 없습니다 금융 관심 있다.