세포 부착 촉진에 있는 보체 단백질 C1q와 히알루론산 사이 상호 작용의 평가

요약

보체 성분 C1q는 세포외 기질과 상호 작용할 수 있는 조직 미세환경에서 고도로 발현되는 염증성 분자이다. 여기서, 우리는 C1q가 히알루론산에 결합하여 세포 부착에 미치는 영향을 시험하는 방법을 설명한다.

초록

종양 미세 환경이 신생물 성장 및 전이에 적극적인 역할을 한다는 것이 점점 입증되고 있다. 다른 통로를 통해, 종양 세포는 자극 인자, 케모카인 및 사이토카인을 분비하여 기질, 면역 및 내피 세포를 효율적으로 모집 할 수 있습니다. 차례로, 이 세포는 높은 증식 및 전이성 능력을 유지하기 위하여 성장 촉진 신호, 대사 산물 및 세포외 매트릭스 분대를 풀어 놓음으로써 미세 환경의 신호 특성을 바꿀 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 우리는 인간 악성 종양의 범위에 의해 국소적으로 고도로 발현되는 보체 성분 C1q가 세포외 기질 히알루론산과 상호 작용할 때 인간 종양으로부터 분리된 1차 세포의 거동에 강하게 영향을 미친다는 것을 확인합니다. 표본. 여기서, 우리는 C1q가 히알루론산(HA)에 결합하여 종양 세포 부착에 어떻게 영향을 미치는지 테스트하는 방법을 설명하며, 이는 세포외 기질의 주요 성분의 생물학적 특성(이 경우 HA)이 종양을 향한 생리활성 신호에 의해 형성될 수 있다는 사실을 뒷받침하는 것입니다. 진행.

서론

종양 미세 환경 (TME)은 세포 생존, 성장 및 침략에 대한 허용 틈새 시장을 제공 할 수 있기 때문에 암 발달 및 진행에 영향을 미칩니다. TME에 있는 새로운 중요한 선수의 확인은 표적 치료를 위한 새로운 분자 공구의 발견을 위해 유용할 지도 모릅니다. TME는 내피 세포, 섬유아세포 및 면역 계통의 세포와 같은 비악성 세포의 복잡하고 동적인 네트워크를 포함하며, 콜라겐, 라미닌, 섬유넥틴을 포함하는 주변 세포외 매트릭스(ECM) 성분에 내장되어 있으며, 프로테오글리칸과 히알루로난을 종양 및 비종양 세포는 사이토카인, 케모카인, 성장 인자 및 TME의 물리적, 화학적 및 신호 특성을 전체적으로 변경하는 염증 및 매트릭스 리모델링 효소와 함께 ECM 구성 요소를 합성하고 분비합니다. 이러한 성분 중, 히알루 론산 (HA) 종양 생물학에 중요 한 역할을 발휘 하기 위해 등장 했다. 그것의 간단한 화학 성분에도 불구하고, HA는, 그것의 HA 결합 분자 (hyaladherins)와 더불어, 크기 및 농도 의존적인 방식으로 혈관신생, 면역 계통 반응성 및 ECM 리모델링을 조절할 수 있다 1.

보체 (C) 시스템은 또한 최근 증가하고있는 로컬 TME의 일부입니다. C 시스템은 비 자기 세포, 원치 않는 숙주 요소 및 병원체에 대한 방어의 첫 번째 라인에 관여하는 수용성 및 막 결합 단백질의 세트를 포함합니다. 기능적으로, C는 선천적이고 적응적인 시스템의 2-이펙터 암을 연결하여 염증 반응의 직접적인 세포 살상 또는 장착을 촉진한다^2. C 활성화는 암세포를 파괴하거나 그들의 성장을 억제해서 종양 성장을 억제할 수 있습니다, 그러나 만성 염증을 유지해서 종양 승진시키는 활동을 소유할 수 있다는 것을 점점 더 명확해지고 있습니다, 의 설치를 승진시키는 면역억제군, 혈관신생 유도, 암 관련 신호경로 활성화^3. 이러한 맥락에서, C1q, C 시스템의 고전적인 경로의 제1 인식 분자는 C 활성화 4와 독립적으로종양 미세 환경에서 중요한 기능을 발휘하는 것으로 나타났다. C1q는 혈관신생 및 전이 외에 암세포 부착, 이동 및 증식을 선호할 수 있는 다양한 인간 악성 종양에 의해 국소적으로 발현되는 것으로 나타났다^5. 흥미롭게도 C1q는 HA와 같은 ECM의 주요 구성 요소와 상호 작용합니다.

우리는 종양 질량에서 1 차적인 암세포를 격리하는 기술을 개발했습니다. 또한, 우리는 종양 미세 환경, 특히 C1q와 높은 분자량 히알루 론산 사이의 상호 작용을 자극 할 수있는 매트릭스를 만들었습니다. HA에 결합된 C1q는 종양 세포의 부착을 유도할 수 있었다.

프로토콜

환자로부터의 조직 샘플은 이탈리아 트리에스테 대학 병원의 기관 위원회의 윤리적 고려 사항의 승인 후 통보 된 동의 후 수집되었다.

1. 종양 세포 격리 및 배양 (1 일째)

1. MPM 고체 표본으로부터 인간 중피종 세포를 분리합니다. 0.5 mM Ca²⁺/ Mg²+, 0.5 % 트립신 및 50 μg / mL로 보충 된 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)으로 구성된 소화 용액 5 mL에서 약 2-3mm^2의 조각을 얻기 위해 커터로 조직을 미세하게 다진다. DNase I, 4 °C에서 하룻밤.
2. 종양 세포 분리 및 배양 (2일째)
   1. 하룻밤 배양 후, 소화된 조직을 37°C 인큐베이터에 부드럽게 흔들어 놓고 30분 동안 놓는다.
   2. 원심분리 시 소화 용액 (250 x g)을 중간 크기 199의 5 mL에 용해 된 3 mg / mL 콜라게 나아제 유형 1로 HBSS로 교체하고 37 °C에서 30 분 동안 더 배양하십시오.
   3. 10% 열 불활성화 태아 소 혈청 (FBS)를 추가 하 여 효소 반응을 차단 합니다. 세포의 대부분이 조직에서 방출되도록 하기 위해 5 mL 파이펫으로 세포를 매우 신중하게 다시 중단하십시오. 이어서, 100 μm 기공 필터를 통해 세포 현탁액을 걸러내다.
   4. 세포를 12.5 cm² 플라스크에서 종자하고 인간 내피 세포혈청이 없는 배지(HESF)를 사용하여 37°C에서 배양하고, 10% FBS로, EGF(10 ng/mL), 기본 FGF(20 ng/mL), 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충하였다.
      참고: 2-3일마다 신선한 매체로 교체하세요.

2. HA 코팅 (1 일차)

1. 1 mg / mL^6의농도에서 이중 증류수에서 고분자 HA (1.5 kDa)를 다시 일시 중단하십시오.
2. 부드러운 파이펫팅으로 탄산염/중탄산염 완충액(0.1M, pH 9.6)에서 HA 스톡 용액을 50 μg/mL로 희석합니다.
3. 96-웰 플레이트를 4°C에서 하룻밤 동안 100 μL의 희석 HA 스톡 용액으로 코팅합니다.
   참고 : 히알루 론산은 트리에스테^{대학 생명}과학학과 이반 도나티 교수의 친절한 선물이었다 7 .

3. C1q 코팅 (2일차)

1. 하룻밤 배양 후, 진공 처리 된 우물을 흡인하고 잘 당 덜베코의 PBS (dPBS)의 100 μL로 96 웰 플레이트를 세척합니다.
2. C1q (25 μg / mL 또는 투여 반응 실험을위한 다른 농도) 또는 BSA (음성 대조군)가 dPBS + 0.5 % BSA 및 0.7 mM Ca + 0.7m Ca + 0.7 mM + 0.7 mMCa⁺0.7 μS의 농도에서 25 μg / mL의 농도로 이러한 단백질을 배양하여 플라스틱 고정 HA에 결합하도록 허용하십시오. . 그런 다음 4 °C에서 밤새 배양합니다.
3. 우물을 진공 흡인하고 dPBS의 100 μL / 웰로 96 웰 플레이트를 세척하십시오.

4. FAST DiI로 셀 라벨링

1. 형광염 FAST DiI의 10 μg/mL를 함유하는 dPBS 의 500 μL에서 1 x 10⁵ 종양 세포를 재중단한다. 라벨링을 위해 5% v/v CO2 인큐베이터에서 37°C에서 15분 동안 인큐베이팅하고, 5분 간격 후에 수동으로 혼합한다.
   1. 여분의 FAST DiI를 제거하려면, dPBS 10 mL을 추가하고, 부드럽게 위아래로 피펫을 추가하고, 7 분 동안 250 x g에서 원심 분리기를. 0.1 % BSA (HESF + 0.1 % BSA)를 포함하는 인간 내피 혈청 무료 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.

5. HA/C1q 행렬에 대한 세포 접착 (1일차)

1. 진공 은 상이한 매트릭스로 코팅된 웰을 흡인한다(웰은 3.2단계에서 코팅되었다).
2. 표지된 셀 현탁액의 100 μL을 코팅된 웰에 분배하고 5% v/v_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 35분 동안 플레이트를 배양한다.
3. 상급체를 흡입하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 0.5% BSA, 0.7 mM Ca²⁺ 및 0.7 mM Mg^2+를포함하는 dPBS로 한 번 씻으십시오.
4. 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 + 0.1 % v /v SDS의 200 μL / well을 추가하여 부착 세포를 용해시키고 형광 판독기 (544 nm, 방출 590 nm)로 96 웰 플레이트를 즉시 판독하여 라벨 수가 증가하는 것을 통해 생성된 교정 곡선을 사용하여 부착 된 라벨수를 통해 발생했습니다. 셀.

결과

HA는 음전하고분자다당류이며, 이는 반복(β,1-4)-D-글루쿠론산-(β,1-3)-N-아세틸-D-글루코사민 난당류 단위(도1B)로구성된다. 96웰 플레이트상에서 HA의 결합의 발생뿐만 아니라 그 고정화의 효율은 생체화 HA(bio-HA)를 이용하여 시험하였다. 10 μg/mL에서 1 mg/mL에 이르는 다양한 Bio-HA 농도를 100 mM 탄산염/중탄산염 버퍼 pH 9.6에서 다시 중단하고 4°C에서 밤새 배양하였다.

광범위한 세차 후, 96웰 플레이트에 결합된 바이오-HA는 알칼리성 인산염에 컨쥬게이션된 스트렙타비딘을 사용하여 검출되었고, 스트렙타비딘의 존재는 pNPP(1 mg/mL)를 기판으로 사용하여 정량화되었다. 판독은 ELISA 리더를 사용하여 405 nm의...

토론

우리는 히알루론산과 상호 작용하는 보체 성분 C1q가 어떻게 인간 종양 조직으로부터 분리된 1차 세포의 거동을 조절할 수 있는지 를 조사하는 쉬운 방법을 설명합니다. HA와 C1q는 모두 생리적 및 병리학적 조건 하에서 조직 미세 환경에 풍부하게 존재하며, 여러 세포 생물학적 과정에 참여한다. 예를 들어, C1q는 태반 8 동안 모계 데시두아의 엑스트라풀루스 트로포블라스트 침공을 선호하는 태반의미세환경 내에 존재하는 것으로 나타났다. C1q는 또한 조직 재생 및 수리 에 필요한 혈관 유전 적 과정을 육성 상처 치유 피부에 증착^10. 마지막으로, C1q는 몇몇 다른 종양조직에서 확인되었습니다 4. 고분자량 HA는 혈관신생 및 증식에 대한 자연적인 장벽이며, 최근의 증거에 따르면 C1q는 보체 활성화에 있어 고전적인 역할 외에 ECM 분자로서 작용할 수 있으며 세포 이동을 선호합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100  &마이크로; m 기공 필터	BD Falcon	352360
Amphotericin B 용액 (fungizone)	Sigma-Aldrich	1397-89-3
basic FGF	Immunological Sciences	GRF-15595
염화칼슘	시그마-알드리치	C-4901
콜라겐 분해 효소 유형 I	Worthington Biochemical Corporation, DBA	MX1D12644
D-Glucose	Sigma-Aldrich	50-99-7
DNase I	Roche	10 104 159 001
EDTA	시그마-알드리치	60-00-4
EGF	Immunological Sciences	GRF-10544
FAST DiI	분자 프로브, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	D7756
태아 소 혈청	Gibco,  Thermo Fisher Scientific	10270-106
Fibronectin	Roche	11051407001
플라스크	Corning	430639	멸균, 통풍
겐타마이신 용액	Sigma-Aldrich	G1397-10ML
행크 s 균형 잡힌 소금 용액 (HBBS)	시그마-알드리치	H6648	EDTA, 포도당, 페니실린-스트렙타미신, 겐타마이신 및 곰팡이존
고분자량 히알루론산	이반 도나티
인간 내피 혈청 무료 매체	기브코,  Thermo Fisher Scientific	11111-044	EGF (5  ng/mL), 염기성 FGF(10  ng/mL), 및  1% 페니실린– 스트렙토 마이신 (시그마 - 알드리치)
마그네슘 클로라이드	카를로 에르바	13446-18-9
미디엄 199 행크 포함 s 소금	시그마-알드리치	M7653
페니실린-스트렙토마이신	시그마-알드리치	P0781
타임랩스 현미경	니콘	이미징 시스템 BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA Reader	Flow Labs
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4674