단일 단계 정화 RNA Biotin 및 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여 고분자 복합물의

요약

Botin streptavidin 전략을 사용 하 여 정화 RNA 또는 단백질 복합물은 eluted 더 정화와 기능 분석에 대 한 부적 절 한 형태로 변성 조건에서 솔루션. 여기, 우리가 네이티브 및 완전 한 기능 RNA 또는 단백질 복합물 저조한 RNA와 부드러운 UV 차입 단계 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여이 전략의 설명.

초록

많은 년간, biotin와 streptavidin 사이의 매우 강력 하 고 급속 하 게 형성 된 상호 작용은 생물학으로 중요 한 RNA 또는 단백질 복합물의 부분 정화에 대 한 성공적으로 이용 되어. 그러나,이 전략의 광범위 한 사용을 제한 하는 하나의 주요 단점에서 고통: biotin/streptavidin 상호 작용 또한 따라서 제외 eluted 단지의 무결성을 중단 시킬 조건을 변성 시키기의 밑 에서만 깨진 수 있습니다 그들의 이후 기능 분석 및/또는 다른 방법으로 추가 정화. 또한, eluted 샘플 자주 nonspecifically streptavidin 구슬, 순화 된 단지의 분석은 얼룩 및 질량 분석에 의해 복잡 하 게 연관 배경 단백질 오염. 이러한 한계를 극복 하기 위해 우리는 biotin 사진 쪼갤 링커를 통해 RNA 기판에 연결 된와 streptavidin 구슬에 움직일 단지는 선택적으로 eluted 솔루션에 biotin/streptavidin 전략의 변종 개발을 장파 UV, 구슬에 배경 단백질을 떠날에 의해 기본 형태. 짧은 RNA 바인딩 기판 수 수 합성 화학적으로 biotin과 covalently는 RNA의 5' 끝에 첨부 된 사진 쪼갤 링커 반면 긴 RNA 기판 보완 oligonucleotide에 의해 두 그룹으로 제공 될 수 있다. UV-차입 방법의이 2 개의 이체 3' 끝 히스톤 사전-mRNAs를 쪼개 U7 snRNP 종속 처리 단지의 정화에 대 한 테스트 되었습니다 그리고 그들은 둘 다 이전 다른 호의 베 풀 비교 하 정화 방법을 개발 입증. UV eluted 샘플 포함 쉽게 감지 양의 U7 snRNP 주요 단백질 오염 물질의 무료 하 고 질량 분석 및 기능 분석 실험에 의해 직접 분석에 적합 했다. 설명된 메서드를 쉽게 다른 RNA 바인딩 복합물의 정화에 대 한 적응 하 고 DNA 특정 단백질 및 고분자 복합물 정화 단일 및 이중 가닥 DNA 바인딩 사이트와 함께 사용 될 수 있습니다.

서론

진핵생물, RNA 중 합 효소 II 생성 mRNA 선구자 (pre-mRNAs) 세포질에서 단백질 합성에 대 한 완전 한 기능 mRNA 템플릿이 되기 전에 핵에서 여러 성숙 이벤트를 받 다. 이러한 이벤트 중 하나는 3' 끝 처리입니다. 사전 mRNAs의 대부분, 3' 끝 처리 polyadenylation 결합 절단을 포함 한다. 상대적으로 풍부한 복잡 하 여이 2 단계 반응 촉매는 15 개 이상의 단백질¹의 구성 된. 동물 복제 종속 히스톤 사전 mRNAs 3' 끝에 핵심 역할 U7 snRNP, ~ 60 뉴클레오티드 및 여러 단백질^2,3 의 U7 snRNA 구성 된 복잡 한 낮은 풍부에 의해 재생 됩니다. 다른 메커니즘에 의해 처리 됩니다. . 히스톤 사전-mRNA와 U7 snRNP의 소 단위 중에 특정 순서로 U7 snRNA 기본적인 쌍 catalyzes 분열 반응, 성숙한 히스톤 생성 mRNA는 많은 없이 꼬리. 히스톤 사전-mRNA의 3' 끝 처리도 필요 줄기 루프 바인딩 단백질 (SLBP), 보존된 줄기 루프 위치를 바인딩하는 분열 사이트의 업스트림 기판^2,

프로토콜

1. 기판 준비

참고: ~ 65 뉴클레오티드 보다 짧은 RNA 기판 biotin (B)와 사진 쪼갤 (pc) 링커 (통칭 사진 쪼갤 biotin 또는 pcB) covalently RNA 5' 끝 (cis 구성)에 연결 된 화학적으로 합성 될 수 있다. 상당히 긴 바인딩 사이트를 포함 하는 RNA 기판 생성 된 생체 외에서 T7 (SP6) 전사에 의해 있어야 하 고 이후 5' 끝 (트랜스 에 pcB moiety를 포함 하는 짧은 보완 어댑터 oligonucleotide를 단련 구성) (그림 1).

1. 미만 ~ 65 뉴클레오티드로 구성 된 바인딩 사이트 사용 상업 제조 업체 (자료 테이블) 화학적 관심의 RNA 합성 pcB와 covalently RNA 5' 끝 (그림 1A 및 그림 2A)에 첨부. 원하는 농도 달성 하 여-80 ° c.에 작은 aliquots에 저장 살 균 물에 용 해
2. 바인딩 사이트 크게 이상 ~ 65 뉴클레오티드, 형태는 생체 외에서 의 부분적인....

결과

UV-차입 메서드 covalently pcB moiety (cis 구성)에 5' 끝에 연결 된 두 개의 화학적 합성된 RNA 기판 테스트 했다: pcB-SL (그림 1) 및 pcB-dH3/5 m RNAs (그림 2). 31-뉴클레오티드 pcB-SL RNA 포함 5 뉴클레오티드 단 하나 좌초 된 꼬리 뒤 줄기 루프 구조와 그 시퀀스는 성숙한 히스톤의 3' 끝 mRNA (즉., 히스톤 사전-U7 snRNP에 의해 mRNA의 분열 후). 이 독특한 시퀀스 두 단백질 현재 포유류 세포질 분수에 대 한 알려진된 바인딩 사이트입니다: SLBP 3' hExo^16,,1718. pcB.......

토론

여기 설명 하는 방법을 간단 하 고 통합 사진 쪼갤 링커 외 이며 UV 차입 단계 biotin와 streptavidin 사이 매우 강한 상호 작용을 활용 하는 일반적으로 사용 되는 방법에서 다 하지 않습니다. UV 차입 단계 일반적으로 고정된 하는 RNA의 75% 이상 방출 매우 효율적 이며 streptavidin 구슬, 구슬에 비 특히 묶는 단백질의 높은 배경 뒤에 떠나는에서 단백질 관련. 제거 함으로써이 배경, UV 차입 단계 실버 얼룩, 질량 분석 및 기능 분석 실험에 의해 너무나 순수한 샘플 직접 분석에 적합을 생성 합니다.

상대적으로 몇 가지 간단한 단계를 포함, 결과로 UV 차입 방법은 매우 재현성, 마우스의 작은 100 µ L에서 실버 얼룩 U7 snRNP의 충분 한 양을 제공 하 고 초파리 핵 추출¹⁵. 방법은 다른 실험 전략 이전 RNA/단백질 복합물, RNA 기판 MS2 바인딩 사이트 태그 등 immob.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Streptavidin-Agarose	Sigma	S1638-5ML
고강도, 장파 UV 램프	Cole-Parmer	UX-97600-00
교체 전구	Cole-Parmer	UX-97600-19	100와트 Mercury H44GS-100M 전구 366nm 자외선(Sylvania)
RNA 및 올리고뉴클레오티드(cis	Dharmacon(콜로라도주 라파예트) 또는 Integrated DNA Technologies, Inc.(아이오와주 코럴빌)		Dharmacon
Beckman GH 3.8 스윙 버킷 로터	Beckman
RiboMAX 대규모 RNA 생산 시스템(T7 중합효소)	Promega	P1300
RiboMAX 대규모 RNA 생산 시스템(SP6 중합효소)	Promega	P1280
피어스 실버 스테인 키트	써모피셔 사이언티픽	24612

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