크립토코커스-아메바 상호 작용 을 연구할 때 현미경 기술과 형광 읽기의 상호 보완적 사용

Summary

이 논문에서는 스틸, 형광 이미지 및 고해상도 투과 전자 현미경 이미지를 사용하여 연구되는 크립토코카인 세포 및 아메바의 공동 배양을 준비하기 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 여기에 예시된 것은 정량적 데이터가 이러한 정성적 정보를 보완하는 방법입니다.

Abstract

Cryptococcus 감염을 시뮬레이션하기 위해 환경에서 크립토 코카인 세포의 자연 포식자인 아메바를 대식세포의 모델로 사용할 수 있습니다. 대식세포와 유사한 이 육식 유기체는 식세포증을 사용하여 내면화된 세포를 죽입니다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경의 도움으로 크립토 코카인 세포와 아메바 사이의 대화형 순간을 묘사하는 이미지가 캡처됩니다. 전자 현미경의 분해력은 또한 아메바 식품 액포내부에 갇혀있을 때 크립토 코카인 세포의 초구조적 세부 사항을 밝히는 데 도움이됩니다. 식세포증은 지속적인 과정이기 때문에 정량적 데이터가 분석에 통합되어 이미지가 캡처될 때 시점에서 어떤 일이 발생하는지 설명합니다. 구체적으로, 상대 형광 단위는 크립토 코카인 세포를 내화에 아메바의 효율을 정량화하기 위해 판독된다. 이를 위해 크립토코카인 세포는 염료로 염색되어 식품 액포의 산성 환경 내에 한 번 형광이 가해집니다. 함께 사용 하는 경우, 이러한 기술을 통해 수집 된 정보는 아메바에 의해 내면화 될 때 세포의 행동과 운명에 결론을 도출 하는 데 도움이 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다., 아마도, 다른 식세포 세포에 의해.

Introduction

미생물은 토양과 물의 열린 물리적 경계와 같은 다른 생태 틈새 에서 점유하고 번창하기 위해 시간이 지남에 따라 진화, 다른 사람의 사이에서¹. 이러한 틈새 시장에서, 미생물은 종종 제한된 자원에 대한 직접 경쟁에 종사; 중요한 것은, 그들은 증가 인구를 수용 할 필요가 자신의 성장이나 공간을 지원하기위해 사용하는 영양소에 대한 2,³. 어떤 경우에, 아메바와 같은 일부 홀로주체 유기체는 심지어 그들의 바이오 매스에서 영양분을 추출하는방법으로 크립토 코카인 세포에 선행 할 수있다 4,^5. 차례로, 이것은 그 먹이의 인구 수를 제어하여 영토 지배를 확립 할 수 있습니다. 이러한 약탈적 압력 때문에, 일부 먹이는 압력의 부정적인 영향을 조정하기 위해크립토코칼 캡슐 6과 같은 미생물 인자를 생성하도록 선택될 수 있다. 그러나, 이 압력의 의도하지 않은 결과로, 몇몇 세균은 종 장벽을 교차하고 영양분이 풍부하고이상적인 인체의 밀폐된 공간 같이 7를 식민지화하는 새로운....

Protocol

크립토코커스 네오포르만 및 일부 아칸타모에바 카스텔라니 균주는 생체 안전성 수준-2(BSL-2) 병원체로 간주된다; 따라서, 연구원은 이 유기체로 일할 때 적당한 예방 조치를 취해야 합니다. 예를 들어, 실험실 직원은 실험실 코트, 장갑 및 눈 보호와 같은 특정 교육 및 개인 보호 장비 (PPE)가 있어야합니다. 생물학적 안전 캐비닛(레벨 2)은 감염을 일으킬 수 있는 절차에 사용되어야^{합니다(레벨 2).14.}

1. 곰팡이 세포의 재배 및 표준화 (Madu 등에서 수정 ¹⁵⁾

1. 효모-펩톤-덱스트로스(YPD) 한천 플레이트에서 스톡 배양물(9개월 이상 없음)에서 시험 곰팡이 균주(즉, C. neoformans UOFS Y-1378 및 C. neoformans LMPE 046)를 줄무늬. YPD 한천의 성분에 대한 정보는 표1에서 찾을 수 있습니다.
   참고: C. neoformans UOFS Y-1378은 3-하이드록시 지방산을 생산하는 것으로 나타났으며, C. neoformans LMPE 046은 3-하이드록시 지방산....

Results

미생물은 육안으로 인식할 수 없는 현미경 유기체입니다. 그러나, 그들의 충격은 피부 감염과 같은 관찰 가능한 임상으로 명백한 질병 귀착될 수 있습니다. 미생물의 특정 측면을 공부 할 때, 자신의 형태에 이르기까지, 부산물, 상호 작용, 회화 및 비디오 증거를 제공 할 수있는 것은 가장 중요하다.

우리는 먼저 크립토 코카인 세포와 아메바 사이의 상호 작용을 시각화하기 위해 노력했습니다. 이를 위해, 2시간 공동 배양 세포를 나타낸 밝은 필드 이미지를 먼저 연구하였다. 한 이미지는 아메바에 가까운 곳에 있던 크립토 코카인 세포를 공개했습니다. 아메바 세포 중 하나는 크립토코카인 세포를 포획하기 위해 확장된 의사포디아로 보였다(도1A). 다음으로, 참조를 위해 형광에 상응하는 이미지를 .......

Discussion

논문에서, 아메바가 크립토 코카인 세포와 상호 작용할 때 발생할 수있는 가능한 결과를 밝히기 위해 다른 기술이 성공적으로 사용되었습니다. 또한, 우리는 Cryptococcus-amoeba 상호 작용의 결과에 3-하이드록시 지방산의 효과를 보여주기 위해 관심이 있었습니다.

사용된 첫번째 기술은 정지 심상을 렌더링하는 공초점 현미경 검사법이었습니다. 이 기술의 주요 단점은 특정 시간대에 만 제한된 정보를 제공했다는 것입니다. 결과에 기초하여 그려질 수 있는 모든 결론은 유도적 추론에 빌려주며, 여기서 관찰 세트(32)에 기초하여 결론에 도달할 수_있다. 그러나 패턴이 존재하는 몇 가지 상황을 관찰한다고 해서 해당 패턴이 모든 상황에서 사실임을 의미하지는 않습니다. 따라서, 연구에서, 그것은 표시 하 고 아마도 어떻게 이러한 제한 된 정보 근거 없는 결론으로 이어질 수 있습니다 주의. 요점, 모순 또는 지원의.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-옥탄	Sigma-Aldrich	D27802-1.5-mL
플라스틱 튜브	Thermo Fisher Scientific	69715-15-mL
원심분리기 튜브	Thermo Fisher Scientific
7252018-50-mL 원심분리기 튜브	Thermo Fisher Scientific		1132017-8
-웰 챔버 슬라이드	Thermo Fisher Scientific		1109650-
아세톤	머크	SAAR1022040LC	-
아메바 균주	ATCCÒ	30234TM	-
ATCC 매체 712	ATCCÒ	712TM	Amoeba medium
Black 96웰 마이크로타이터 플레이트	Thermo Fisher Scientific
152089-Centrifuge	Hermle	-
-클로로포름	Sigma-Aldrich	C2432	-
컨포칼 현미경	Nikon	Nikon TE 2000	-
에폭시 수지:
[1] NSA	[1] ALS	[1] R1054	-
[2] DER 736	[2] ALS	[2] R1073	-
[3] ERL Y221 수지	[3] ALS	[3] R1047R	-
[4] S1 (2-디메틸아미노에탄올)	[4] ALS	[4] R1067	-
플루오레세인 이소티오시아네이	, 시그마-알드리치,	F4274	-
포름산	시그마-알드리치	, 489441	-
플루오로스칸 어센트, FL	써모피셔 사이언티픽	374-91038C	마이크로플레이트 리더
, 글루코스	시그마-알드리치,	G8270	-
글루타르알데히드	, ALS	R1009	-
혈구계	Boeco	-	-
Lead citrate	ALS	R1209-Liquid
Chromatography Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Scientific-Methanol
	Sigma-Aldrich	R 34,860-Orbital
shaker	Lasec	-	-
오스뮴 테트록사이드	ALS	R1015-pHrodo
Green Zymosan A BioParticles	Life Technologies	P35365	이것은 pH-sensitive 염료
생리학적 완충 용액	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB-Rotary
shaker	Labcon-		-
Sodium phosphate buffer입니다:
[1] 디소듐 수소 오르토포스페이트 디하이드레이트	[1] Merck	[1] 106580	-
[2] 나트륨 이수소 오르토인산염 이수화물	[2] Merck	[2] 106345
투과 전자 현미경	Philips	Philips EM 100	-
트리판 블루	Sigma-Aldrich	T8154	-
초소형 Leica		EM UC7-Uranyl
acetate	ALS	R1260A	-
진공 건조기	Lasec	-	-
바이알	Sigma-Aldrich	29651-U-YNB
	Lasec	239210-YPD
한천	시그마 - 알드리치	Y - 1500	-