여기, 우리는 계량의 rhodopsin 돌연변이 망막 화와 관련 된 전송 하는 콘텐츠 이미징 방법을 설명 합니다. 다중 파장 득점 분석 rhodopsin 단백질 세포 표면에 또는 전체 셀에서 계량에 사용 되었다.
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이 논문에서
요약
초록
Rhodopsin misfolding 돌연변이 상 염색체 지배적인 망막 화 (RP), 효과적인 치료 부족 질병 눈부신 진보로 각 성 하는 로드 포토 리셉터 죽음으로 이어질. 우리가 가설을 misfolded rhodopsin 돌연변이의 세포 독성 약리학 돌연변이 rhodopsin 단백질 안정화에 의해 완화 될 수 있다. P23H 돌연변이 다른 클래스 II rhodopsin 변이 중 인코딩합니다 구조적으로 불안정 rhodopsin 돌연변이 단백질을 바인딩과 그물 (ER)에 누적 된 반면 야생 타입 rhodopsin 포유류에 플라즈마 막에 수송 된다 셀입니다. 우리는 이전 발광 기반 높은 처리량 화면 (HTS)을 수행 하 고 응급실에서 원형질 막의 P23H rhodopsin의 전송 구조 약리 보호자의 그룹을 식별. 돌연변이 rhodopsin 단백질 금액과 전체 세포에서 원형질 막에는 여기, 정량이 콘텐츠 이미징 분석 다음 immunostaining 메서드를 사용 하 여, 우리. 이 메서드는 유익 하 고 가양성 HTS. 다음에서 진정한 안타를 식별 하는 효과적인 또한,이 콘텐츠 이미지 분석 계량 각 화합물의 약리 속성을 평가 하는 하나의 실험에서 여러 매개 변수를 사용할 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리 6 RP 관련 rhodopsin 돌연변이, 이러한 rhodopsin 돌연변이의 구조적 안정성에 대 한 양적 및 질적 이해에 대 한 2 차원 약리 프로필을 얻는 쪽으로 11 다른 화합물의 효과 분석 그리고 이러한 돌연변이 향해 다른 화합물의 효능입니다.
서론
단백질 misfolding은 근이 영양 증, 신경 유년으로 망막 화 (RP)1를 포함 하 여 눈부신 질병에 관여. RP 상속 및 진보적인 망막 변성 기능과 항상성 막대 대뇌 또는 망막 안료 epitheliums (RPEs)2,3에 영향을 미치는 60 개 이상의 유전자에 돌연변이와 관련 된입니다. 효과적인 치료는 현재 RP에 대 한 합니다. Rhodopsin 돌연변이 RP의 경우 상 염색체 지배 (광고)의 약 25-30%를 위한 계정. 150 이상 rhodopsin 돌연변이4 (인간의 유전자 돌연변이 데이터베이스, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), 중 클래스 II 돌연변이 로드 포토 리셉터 죽음에 기여 rhodopsin 단백질의 구조적 불안정의 원인이 고 시력 손실5,6,,78. P23H 이다 북아메리카에 있는 가장 빈번한 ....
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프로토콜
참고: rhodopsin 전송 시험.
1. 준비 및 세포의 문화
- 부활 cryo 보존 U2OS 안정 세포는 야생 타입 (WT) 또는 돌연변이 마우스 rhodopsin 금성 융해 단백질을 표현. 만 작은 얼음 결정은 유리병에 남아 때까지 37 ° C에서 세포를 녹여.
참고: U2OS 셀 사용 됩니다이 프로토콜에 있기 때문에 포토 리셉터 셀 라인 생체 외에서 연구에 사용할 수 있는 미리 속눈썹 생 합성 rhodopsin의 포유류 세포에 있는 유사한 분자 메커니즘에 의해 규제 됩니다. 또한, U2OS 셀 접시의 바닥에 단단히 부착 있고 큰 세포 기관, 그래서 그들은 rhodopsin 전송 분석 결과 대 한 이상적입니다. 7 U2OS 안정 세포 표현 WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N 및 P267L rhodopsin 돌연변이 사용 품질 및 신뢰성 분석 결과의 표시 예를 들어 여기. 분석 결과의 목표에 따라 볼 수 있듯이 다른 rhodopsin 돌연변이 또는 다른 막 단백질을 표현 하는 안정 된 세포를 사용할 수 있습니다. 안정적인 세포 인간의 rhodopsin 표현 가능한 경우이 분석 결과에 사용할 수 있습니다. 때문에 95% 상 동을 공유 하는 마우스 및 ....
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결과
우리는 매개 변수가 세 rhodopsin 전송 특징: 전체 (Rhodopsin 금성 INT) 원형질 막 (세포 표면에 Rhodopsin INT)에 rhodopsin의 immunostaining 강도 및 셀의 비율의 rhodopsin 금성 강도 전체 셀 (MEM-총 비율)에 있는 rhodopsin 금성 강도를 세포 표면에 rhodopsin 얼룩. Rhodopsin 전송 분석 결과의 대표적인 결과 그림 3 과 그림 4에 표시 됩니다. DMSO와 9-를 사용 하 여cis-망막 치료 세포 각각 0과 100% 컨트롤 P23H rhodopsin 비너스를 표현 Z'-이 세 개의 매개 변수는 0 0.5, 그 분석 결과 적당 한 품질, 제안 사이의 범위에 대 한 요인 이 콘텐츠 이미징21에 대 한 충분 한. 도 최적화 된 .......
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토론
여기, 우리는 콘텐츠 이미징 분석 결과 조회 수는 HTS.에서 확인 대상이 사용 보였다 이러한 프로토콜에 관련 된 유일한 자동화 높은 콘텐츠 영상입니다. Immunostaining와 형광 이미징 rhodopsin의 rhodopsin5,14,,1516의 지역화 특성을 일반적으로 사용 되어 왔습니다. 그러나, 전통적인 이미징 방법으로 촬영 한 이미지의 정량화는 충분 한 셀 이미지 조건, 실험, 당 이미지의 낮은 용량 및 품질 제어 매개 변수의 부족의 부족에 의해 제한 됩니다. 우리 384-잘 형식 전통적인 immunostaining 프로토콜을 적응 하 고이 콘텐츠 이미징 전통적인 영상 교체. 이 높은 콘텐츠 이미징 프로토콜을 사용 하 여, 우리가 성공적으로 선택 하 고 구분 HTS
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
피츠버그 대학 신약 연구소이 콘텐츠 영상 및 초기 교육을 제공 하 고 우리 박사 마크 E. Schurdak를 감사 합니다. 아낌없이 박사 크 Palczewski (케이스 서쪽 예비 대학) 공유 하는 1D 4 및 B630 안티 rhodopsin 항 체. 마우스 rhodopsin 금성 건설의 cDNA를 포함 하는 플라스 미드는 박사 네 빈 램버트 (오 거 스타 대학)에 의해 공유 되었다. 이 작품은 피츠버그 대학 비전 연구 코어 보조금에서 YC를 P30EY008098 건강 그랜트 EY024992의 국립 연구소에 의해 지원 되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| U2OS(로돕신-금성) 세포 | NA | U2OS 세포에서 생성된 안정 세포 | |
| U2OS(T4R-로돕신-금성) 세포 | NA | NA | U2OS 세포에서 생성된 안정 세포 |
| U2OS(P23H-로돕신-금성) 세포 | NA | NA | U2OS 세포에서 생성된 안정 세포 |
| U2OS(P53R-로돕신-금성) 세포 | NA | U2OS 세포에서 생성된 안정된 세포 NA U2OS 세포에서 생성된 안정 세포 | |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) 세포 | NA | NA | U2OS 세포에서 생성된 안정 세포 |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) 세포 | NA | NA | U2OS 세포에서 생성된 안정 세포 |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) 세포 | NA | NA | U2OS 세포에서 생성된 안정된 세포 |
| DMEM 고포도당 | Genesee Scientific | 25-500 | L-글루타민, 나트륨 함유 피루브산 |
| 소 태아 혈청(FBS) | Gibco | 16140071 | Heat 불활성화 |
| 플라스모신 | InvivoGen | ant-mpt | 마이코플라즈마 제거 시약 |
| 페니실린-스트렙토마이신(100X) | 배양의 박테리아 오염을 방지하기 위한 Gibco 15140122 100X 농축 항생제 솔루션 | ||
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS의 0.25%, 1mM EDTA |
| 폴리-L-라이신 용액 | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, 멸균 여과, BioReagent, 세포 배양에 적합 |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384웰 조직 culutre treated microplates, 검은색 웰 벽과 고함량 분석에서 세포 이미징을 위한 광학적으로 투명한 고리형 올레핀 바닥이 있는 마이크로플레이트 |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | 뚜껑이 평평한 바닥으로 처리된 조직 배양물, sterile, 검출 가능한 발열원, Rnase, DNase 및 DNA가 없습니다. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, 세포 배양 테스트 |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| 화합물 테스트 | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds purchased from 다른 공급 업체 또는 맞춤형 합성 |
| B6-30 항 로돕신 항체 | Novus | NBP2-25160 | Krzysztof Palczewski 박사의 선물 |
| Cy3 결합 염소 항 마우스 2 차 항체 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16 % 파라 포름 알데히드 | Thermo Fisher Scientific | 28908 | 메탄올 프리 |
| 10 % 일반 염소 혈 | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | 차단 버퍼 |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | 핵 염색 용액 |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® 마이크로 컨포칼 High-Content 이미징 시스템 |
| MetaXpress High-Content 이미지 획득 및 분석 소프트웨어 | Molecular Devices | MetaXpress | High-Content 이미지 획득 및 분석 소프트웨어 |
| 멀티채널 피펫(0.5-10 µ L) | Rainin | 17013802 | 수동 8채널 피펫, 0.5-10 &마이크로; L |
| 멀티채널 피펫 (0.5-10c | Rainin | 17013805 | 수동 8채널 피펫, 20-200 &마이크로; L |
| 전자 멀티채널 피펫(10-200 μ L) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | 96웰 및 384웰 마이크로플레이트 피펫팅 작업용 전자 멀티채널 피펫 |
| 50ml 시약 저장소 | Genesee Scientific | 28-125 | 멀티채널 피펫 분주용 시약 |
| 8채널 아스피레이터 | ABC Scientific | EV503 | 96웰 또는 384웰 플레이트에서 액체 흡인용 8채널 스테인리스강 어댑터 |
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| Origin2018 과학 데이터 분석 및 그래프 작성 소프트웨어 | OriginLab | Origin2018 | 용량 반응 곡선을 생성하기위한 데이터 분석 소프트웨어 |
참고문헌
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. <....
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