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방법 논문

Apoptotic 응답 안티 mitotic 치료 학을 평가 하기 위해 DR3 Overexpressing 셀 라인 구축

6.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58705

⸱

2019년 1월 11일

 ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Tsinghua University, 2Department of Radiology, University of California, San Francisco, 3Beijing Advanced Innovation Center for Structural Biology

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

Overexpressing 유전자 기능 연구 관심사의 유전자 안정적인 셀 라인 구축 그들에 transfecting 통해 retroviral 감염 후 안정 되어 있는 transfection 따기 단일 클론에 의해 할 수 있습니다. 여기 우리가 HT29 DR3 셀 라인 이런 방식으로 생성 된 메커니즘 수용 체 3 (DR3) antimitotics-유도 된 apoptosis에 기여 하는 어떤 죽음에 의해 명료 하 게 보여줍니다.

초록

관심사의 유전자의 기능을 공부 하는 것은 감소 하는 최저의 셀 라인의 식을 overexpression 셀 라인의 식을 증가 등 식의 그것의 수준을 조작 하 여 얻을 수 있습니다. 과도 하 고 안정적인 transfection 외 인 진 식에 자주 사용 되는 두 가지 방법이 있습니다. 과도 transfection는 안정 되어 있는 transfection 있습니다 호스트 세포 게놈으로 통합 외 인 유전자 그것은 지속적으로 표현 될 것입니다 어디에 단기 식에 유용 합니다. 그 결과, 안정 되어 있는 transfection는 보통 채택 연구에 대 한 장기 유전 규칙에. 여기 우리는 overexpressing 태그 죽음 수용 체 3 (DR3) DR3 함수를 탐구 하는 안정적인 셀 라인을 생성 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 동질성과 안정적인 셀 라인의 순수성을 유지 하기 위해 retroviral 감염 후 단일 클론을 선택. 이 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 안정적인 셀 라인 따라서 재구성 HT29 셀에 apoptotic 응답 antimitotic 약물에 민감한 DR3 불충분 한 HT29 셀을 렌더링 합니다. 또한, DR3에 플래그 태그 좋은 DR3 항 체의 불가능에 대 한 보상 하 고는 antimitotic 에이전트 apoptosis를 유도 하는 분자 메커니즘의 생 화 확 적인 연구를 용이 하 게.

서론

분리 유전자 발현은 관심사의 유전자의 기능 연구를 종종 고용 된다. 두 가지 방법, 과도 및 안정 되어 있는 transfection, 세포 및 분자 생물학에 prevalently 호스트 셀1,2에 DNA 또는 RNA의 세그먼트를 삽입 하 되. 뚜렷이 transfected DNA 또는 RNA 전달할 수 없습니다 딸 세포에 유전 변경만 시간의 짧은 기간 동안 보존 될 수 있도록. 다른 한편으로, 안정적 transfected 세포, 세 유전자 셀 라인에의 식을 유지 호스트 세포 게놈으로 통합 됩니다. 따라서, 안정 되어 있는 transfection 장기 유전 규칙에 대 한 연구에 대 한 일반적으로 소유 되는 방법입니다. 안정적인 셀 라인 비보에 대 한 마우스 모델에 xenografts 공부3에 이식 수 있습니다. 안정 되어 있는 transfection는 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다: 바이러스 및 nonviral. Nonviral transfection에 비해 바이러스 감염 다양 한 높은 효율4,5,,67인간 세포로 유전자를 전송할 수 있습니다. 또한, 하나의 클론에서 안정적인 셀 라인 동질성과 클론 순도의 이점을 제공합니다.

과 통제 세포 성장 암의 가장 구별 특징은. 임상 설정에서 antimitotic 에이전트는 다양 한 유형의 종양8주 치료. 그러나, antimitotic 에이전트의 몇 가지 중요 한 제한이 무시할 수 없습니다. 첫째, 이러한 chemotherapies 또한 원치 않는 암 세포와 정상 세포를 죽 일 수 있다 그리고, 따라서, 심각한 부작용8발생할 수 있습니다. 두 번째, antitubulin 약물 tubulin의 유비 쿼터 스 식 cytoskeletal 단백질9,10다양 다른 조직에에서도 불구 하 고 종양의 모든 종류에 대해 유효 하지 않습니다. 그것은 명확 하지 않습니다 antitubulin 에이전트에 대 한 유망한 효능 보여 난소, 폐, 그리고 신장, 콜론, 또는 췌 장 암11에 임상 치료, 혈액 암. 마지막으로, 심지어 동일한 유형의 종양 환자에 응답할 수 있는 antimitotics 다르게 예측할 수 없는 방식으로. Antimitotic 에이전트, 임상 치료12에서 본 다양 한 결과 결과로 다른 환자의 민감도 영향을 미치는 주요 효과 기 분자를 있을 수 있습니다. 따라서, antimitotic 치료에 환자의 잠재적인 차동 감도 해야 될 고려 치료 개입13를 최적화 하기 위해.

높은 처리량 전체 게놈 siRNA 도서관 화면 DR3 최저 민감한 세포 antimitotic 약물, 화학요법 유도 된 apoptosis14역할 DR3 위한 연루에 저항을 렌더링 수 설명 했다. 종양 괴 사 인자 수용 체 (TNFR) superfamily의 일 원으로, DR3 다양 한 시스템15,16,,1718세포 apoptosis 중재에 보고 되었습니다. 따라서, 우리는 antimitotic 마약 apoptosis를 유도 하는 분자 메커니즘 연구 DR3 overexpressing 안정 셀 라인 구축에 착수. 인간 결 장 암 세포 선 DR3 결핍 발견 했다 HT29 DR3 overexpression 공부에 대 한 적절 한 셀 모델을 제공할 수 있습니다. 또한, 클리닉, 결 장 암 않습니다 민감한 antimitotic 약19.

이 문서에서는, 우리는 retroviral 감염을 통해 HT29 DR3 안정적인 셀 라인의 생성을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 더 DR3 식 부 럽을 사용 하 여 이러한 셀에서의 유효성을 검사 하는 방법과 세포 생존 능력 분석 실험 및 형태학 적 관찰을 사용 하 여 antimitotic 에이전트에 감도 평가 하는 방법을 보여줍니다. 셀 단일 클론에서 증폭 하 고, 따라서, 균질 유전 배경의 이점이 있다. 또한, DR3에 플래그 태그 허용 셀룰러 DR3의 시각화에 대 한 현미경 검사 법 및 유전자 표현과 단백질 상호 작용의 분석에 의해 생 화 확 적인 접근. 또한, 셀 추가 종양 진행 antimitotics vivo에서14에 대 한 응답을 분석 하는 쥐에 xenografted 수 있습니다.

여기에 제시 된 HT29 DR3 셀 시스템 antimitotics 암 세포14를 죽 일 방법의 분자 메커니즘을 공부를 위한 효과적인 도구를 제공 합니다. Overexpression 및 최저의 세포 유전자 기능 연구에 대 한 일반적인 도구 때문에,이 프로토콜 수 관심 또는 다른 셀 라인의 다른 유전자에 쉽게 적응 되며, 따라서, 광범위 하 게 사용 된 접근 방식을 바 뀌.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 마우스 실험 승인 되었고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 칭화 대학에서 수행 note 하시기 바랍니다.

1입니다. 세대 DR3 Overexpression 셀 라인의

  1. 3 전장 DR3 cDNA를 삽입 하 여 DR3 식 (pMXs-IRES-DR3-깃발)에 대 한 플라스 미드를 생성 플래그 retroviral 벡터 pMXs-IRES-Blasticidin BamHI/XhoI의 제한 사이트에 C-말단에 x.
  2. Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)의 4 mL와 60mm 요리에서 같은 A 세포 성장. 셀 합류 80%-90%에 도달 하면, 다음 날 transfect 플라스 미드 pMXs-IRES-DR3-플래그의 2 μ g으로 셀 transfection 시 약을 사용 하 여 ( 재료의 표참조)에 따라 제조 업체의 수동20.
  3. 후 72 h는 상쾌한 수집, 0.45 μ m 살 균 필터를 사용 하 여 미디어를 여과 하 고 어둠 속에서 4 ° c.에 바이러스 성 현 탁 액을 유지
  4. HT29 셀 DMEM 60 mm 접시에 성장 하 고 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.
  5. 셀 30%-50% 합류에 도달 하면, 다음 날, 바이러스 성 현 탁 액의 밀리 리터 당 1, 5-디 메 틸-1, 5-diazaundecamethylene polymethobromide의 8 μ g의 존재 바이러스 서 스 펜 션의 2 mL로 세포 감염. 후 37 ° C에 외피의 4-6 h, 바이러스 성 현 탁 액을 발음 하 고 신선한 DMEM의 4 mL를 추가 하 고 인큐베이터에 접시를 반환.
  6. 요리 24 h 바람직합니다에서 미디어를 삭제 하 고 신중 하 게 prewarmed PBS의 2 mL로 세포를 씻어. 트립 신-EDTA의 1 mL에 있는 셀에 추가 하 고 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.
  7. 대부분 세포의 분리 된 10 배 확대에 현미경으로 관찰 후 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 포함 하는 완전 한 DMEM의 2 mL와 trypsinization을 중지 합니다. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 하 고 실 온 (RT)에서 5 분 동안 200 x g 에서 세포를 원심.
  8. 상쾌한을 제거 하 고 10 ml DMEM의 셀 펠 릿 resuspend. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 잘 섞는다. 30, 100, 및 300의 요인에 의해 셀을 희석. 시드 1 µ g/mL blasticidin 포함 된 DMEM의 20 mL와 함께 150 mm 접시에 셀입니다. 1 ~ 2 주 동안 5% CO2 와 37 ° C 배양 기에서 품 어.
  9. 이 기간 동안 관찰 식민지 매일 10 배 확대에 거꾸로 현미경으로. 때 식민지 직경은 약 1-2 m m 접시의 바닥에 잘 격리 된 식민지를 표시 합니다.
  10. 매체를 발음 하 고 미리 데워 공영 3 mL로 세포를 씻어. 60 mm 접시에 트립 신-EDTA의 2 밀리 리터를 추가 합니다. 소독 집게를 사용 하 여 데리 압력가 마로 소독 살 균 복제 실린더, 그리고 60 mm 접시에 그들을 배치. 트립 신-EDTA를 포함 하는 실린더를 선택 하 고 부드럽게 표시 식민지 그들을 배치. 있는지 확인 모든 복제 실린더만 포함 한 식민지 근처 식민지와 오염을 방지 합니다.
  11. 3 분 동안 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
  12. 3 분 후 10 배 확대 여부 그들은 분리 되는 보고에서 현미경 아래에 있는 셀을 확인 합니다. 셀 들어 올렸다 때 비활성화 된 트립 신을 각 실린더를 문화 매체의 70 μ를 추가 합니다. 부드럽게 믹스 200 μ 피펫으로 세포 현 탁 액. 이 과정은 실린더를 이동 되었는지 확인 합니다.
  13. 각 식민지에서 잘 당 DMEM 1 mL를 포함 하는 2 개의 24-잘 격판덮개 세포 현 탁 액을 전송. 잘 당 세포 현 탁 액의 30 μ 플레이트 A에에서 추가 하 고 해당 70 μ 접시 B. 라벨에에서 제대로 판 우물 및 인큐베이터에 다시 넣어.

2. 확인 DR3 Overexpression 셀 라인의

  1. 플레이트 B 셀 90% 합류에 때, 미디어를 제거 하 고 신중 하 게 씻어 1 mL의 PBS로 세포. 완전히 PBS를 제거 하 고 SDS 페이지 로딩 버퍼 x 1의 50 μ를 가진 세포를 lyse. 원심 분리기 튜브 1.5 mL를 24-잘 접시에서 세포 lysates 전송 및 100 ° c.에서 10 분에 대 한 샘플을 끓여
  2. 15 분 동안 80 V의 정 전압에서 그리고, 1 시간에 120 V에서 10% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 젤에는 샘플을 실행 합니다.
  3. 400의 정 전류에 젖은 전송에 의해 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막 단백질을 전송 2 h mA.
  4. 반대로 깃발 항 체, 부정적인 컨트롤 (그림 1)으로 서 야생-타입 HT29 셀을 사용 하 여 다른 클론에 DR3 식을 테스트 합니다. TBST에 녹아 5000에서 5% 탈지 우유의 요인에 의해 1 차적인 항 체 희석 (Tris 버퍼 염 0.1%를 포함 트윈-20). 4 ° C에서 플래그 항 체로 막 밤새 품 어.
  5. TBST 가진 막 TBST 세척 시간 15 분의 총에 대 일 분 마다 실시간 새로 고침에서 200 rpm decoloring 셰이 커에 흔들어 씻어.
  6. 5-6 h 4 ° C에서 10, 000에 5% 탈지 우유의 요인에 의해 희석 방지 마우스 2 차 항 체로 막 품 어.
  7. 2.5 단계에 설명 된 대로 다시 막 씻으십시오.
  8. 부 향상 된 화학 (ECL) 기판을 사용 하 여 플래그 식 감지 하 고 젤 문서 시스템 막 이미지 ( 재료의 표참조). 긍정적인 복제품으로 DR3를 표현 하는 클론을 식별 합니다.
  9. 6 잘 플레이트에 플레이트 B에에서 긍정적인 클론에 해당 하며 10 cm 요리에서 그들을 성장 때까지 세포를 증폭 하는 플레이트 A에에서 클론을 전송 합니다. 긍정적인 복제품에서 성장 하는 세포의 냉동된 주식을 확인 하 고 나중에 사용-80 ° C에서 저장.

3. 셀의 Antimitotic 에이전트에 Apoptotic 반응의 평가

참고: Diazonamide는 다른 tubulin 불안정 에이전트21거울 암 세포 성장 억제에 놀라운 활동이 해양 자연 제품의 새로운 클래스입니다. 그러나, 행동의 모드 불분명 남아 있습니다. Antimitotic 에이전트에 셀의 세포질 응답을 테스트 하려면 paclitaxel와 diazonamide 야생-타입 HT29 세포와 HT29 DR3 세포 치료에 사용 되었다. 마약 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 10 밀리미터 주식을에 해산 되었고, 다음, 더 다양 한 농도 희석: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1000 nM, 3000 nM, 그리고 10000 DMSO에 nM.

  1. HT29 및 HT29 DR3 셀 trypsinization에 의해 수집 합니다. 자동 셀 카운터를 사용 하 여 셀 밀도 측정 합니다. 그런 다음, 잘 당 3 x 104 의 세포의 밀도에 DMEM에서 12-잘 접시에 셀 씨. 다음 날, 10 nM diazonamide를 추가 하 고 부정적인 제어로 1 %DMSO 사용. 치료의 48 h 후 10 배 확대 (그림 2)에서 현미경으로 세포를 이미지.
  2. 씨 HT29와 HT29 DR3 잘 당 3 x 103 셀의 밀도에서 96 잘 접시 DMEM에서 세포 고 37 ° c.에 하룻밤 성장 하도록 허용 그런 다음 복용량 고조 diazonamide 농도 0.3 추가 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30, 및 100 nM 부정적인 제어로 1 %DMSO 사용 하 여 각 잘.
  3. 치료의 48 h 후 제조업체의 설명서에 따라 발광 기반 세포 생존 능력 분석 결과 키트를 사용 하 여 세포 생존 능력을 측정 합니다.
    1. 인큐베이터에서 96 잘 접시를 꺼내와 그것은 실시간에 약 30 분 동안 서 보자. 다음, 각 음을 분석 실험 시 약의 50 µ L lyse 세포를 2 분 동안 RT에 접시를 흔들 그리고 microplate 리더 (그림 3)를 사용 하 여 각의 또 다른 10 분 확인 오일안에 대 한 실시간에 접시를 품 어 추가 합니다.
      참고: 셀 생존 나타냅니다 각각의 상대적 발광 강도 잘 컨트롤의 잘 1 %DMSO 치료.
  4. 6 주 된 여성 BALB/c 누드 마우스를 사용 하 여는 vivo에서 연구14.
    참고: 쥐 특정 병원 체 자유로운 조건에서 유지 되었다.
    1. HT29 및 HT29 DR3 셀 trypsinize 하 고, 다음, trypsinization DMEM 37 ° c.에 prewarmed를 사용 하 여 중지 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 하 고 1000 rpm에서 실시간 삭제는 상쾌한 10 분에 대 한 세포를 원심 FBS 없이 DMEM 매체에서 셀 펠 릿 resuspend. 셀을 다시 원심 고 PBS에 셀 펠 릿 resuspend.
    2. 자동 셀 카운터를 사용 하 여 셀 및 셀 2.5 x 10의 농도를 희석7 셀/mL PBS를 사용 하 여. 각 마우스 (5 x 106 셀/마우스)22의 맞은 측면에 HT29 또는 HT29 DR3 셀 서 스 펜 션의 200 μ의 피하 주사를 통해 종양을 생성 합니다.
    3. 캘리퍼스 마다 2 d를 사용 하 여 이식 후 종양 볼륨 (TV)를 측정 합니다. 계산 하는 다음 수식을 사용 하 여 TV: TV = 1/2 L x 폭 x 폭 (여기서, w: 종양 폭, l: 종양 길이). 평균 종양 볼륨 약 100 m m3에 도달 하면 컨트롤 또는 치료 그룹으로 쥐를 무작위 (n = 그룹 당 6) 치료를 시작 하 고.
    4. 다음과 같이 paclitaxel 솔루션을 준비 합니다. 첫째, paclitaxel의 총 볼륨 5% 에탄올에 완전히 녹이 고, 다음, 추가 5% polyoxyl 35의 최종 볼륨의 수소 아주까리 기름. 마지막으로, D5W로 볼륨의 나머지 90%를 확인 (물, pH 7.4에에서 5% 포도 당).
    5. 3 20 mg/kg의 복용량에 정 맥으로 paclitaxel을 주사 2 주 동안 주당 x. 종양 볼륨 및 몸 무게 3 주14x를 측정 합니다. 실험을 종료 하 고 체중 20% 감소 또는 종양 볼륨 약 2000 m m3에 도달 하는 경우는 동물을 안락사.

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결과

안정적으로 DR3 표현 하는 HT29 세포의 특성은 그림 1에 표시 됩니다. 클론 익스프레스 DR3, 다양 한 수준의 동안 부정적인 제어 역할 야생-타입 셀 exogenous 유전자 발현을 표시 하지 않습니다. 여기 우리 5 복제품, 표시는 1 복제 하 고 5 표현할 DR3의 최고 수준. 클론 1 및 5 다음과 같은 실험에 대 한 선택 했습니다.

Diazonamide의 관리 후 HT29와 HT29 DR3 세포의 형태는 그림 2에 10 배 확대에는 거꾸로 한 현미경으로 관찰 되었다. 10 nM diazonamide 48 h 치료, 후 HT29 DR3 깨진된 세포 막과 세포 파편 (하단 패널) 명백한 apoptosis를 보여주었다. 그러나, HT29만 라운드-최...

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토론

이 원고에서 우리 HT29 DR3 안정적인 셀 라인을 생성 하는 방법을 설명 합니다. HT29-DR3 셀 DR3 antimitotic 에이전트에 의해 유도 된 apoptosis에 기여 하는 분자 메커니즘을 공부에 대 한 모델을 제공 합니다. 이 방식은 다양 하 고 반복 합니다. 절차의 성공, 프로토콜의 4 개의 중요 한 단계 해야 간주 합니다. 첫째, 높은 생성 하기 위하여 충분 한 바이러스 titer 그것 것이 좋습니다 같은 A 셀에 80%-90% 합류 때 DNA transfection를 수행. 둘째, 바이러스 성 정지 2 주 보다는 더 이상 빛에서 커버에 4 ° C에서 저장 되어야 한다. 셋째, 150 mm 접시에 감염 된 세포를 분리 하는 경우 그것 감염 효율 변화 다른 세포로 잘 분리 된 식민지를 직렬 희석 하 고 좋습니다. 마지막으로, 단일 식민지를 따기 때 거기 해서는 안됩니다 주변 식민지에 대 한 어떤 오염 든 지.

이 프로토콜 대부분 셀 라인에서 잘 작동 하지만 단...

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공개 사항

저자는 선언할 수 없다.

감사의 글

이 작품은 (김소)에 53110000117 및 043222019 (X.W.)에 칭화 대학에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMInvitrogenC11965500BT10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신
발광 세포 생존도 분석PromegaG7571
PaclitaxelSelleckS1150
pMXs-IRES-BlasicidinCell BiolabsRTV-016
Dimethyl sulfoxideSigmaD2650
PBSInvitrogenC14190500BT
Trypsin-EDTA (0.25%)Invitrogen25200056
1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromideSanta Cruzsc-134220
  형질주입 시약PromegaE2311
안티 마우스 2차 항체Jackson ImmumoResearch115-035-166
안티 플래그 항체SigmaF-3165
HT29 세포주ATCCHTB-38
plat-A 세포주Cell BiolabsRV-102
PVDF Immobilon-PMilliporeIPVH00010
클로닝 실린더SigmaC1059
세포 이미징 다중 모드 리더BiotekBTCYT3MV
CKX53 도립 현미경OlympusCKX53
12웰 세포 배양 플레이트Nest712001
60mm 세포 배양 플레이트Nest705001
15mL 원심분리기 튜브Nest
0.22 & m 멸균 필터MilliporeSLGP033RB
Centrifuge 5810 REppendorf5810000327
96 웰 화이트 폴리스티렌 마이크로플레이트 Corning3903
Western ECL SubstrateBIO-RAD1705060
ImageQuant LAS 4000GE 헬스케어ImageQuant LAS 4000 
디컬러링 셰이커 HINOTECHTS-2000A
BlasticidinInvivoGenant-bl-1
자동 세포 계수기BIO-RADTC 20
Opti-MEM I 환원 혈청 매체Thermo Fisher31985070
601052

참고문헌

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