Apoptotic 응답 안티 mitotic 치료 학을 평가 하기 위해 DR3 Overexpressing 셀 라인 구축

요약

Overexpressing 유전자 기능 연구 관심사의 유전자 안정적인 셀 라인 구축 그들에 transfecting 통해 retroviral 감염 후 안정 되어 있는 transfection 따기 단일 클론에 의해 할 수 있습니다. 여기 우리가 HT29 DR3 셀 라인 이런 방식으로 생성 된 메커니즘 수용 체 3 (DR3) antimitotics-유도 된 apoptosis에 기여 하는 어떤 죽음에 의해 명료 하 게 보여줍니다.

초록

관심사의 유전자의 기능을 공부 하는 것은 감소 하는 최저의 셀 라인의 식을 overexpression 셀 라인의 식을 증가 등 식의 그것의 수준을 조작 하 여 얻을 수 있습니다. 과도 하 고 안정적인 transfection 외 인 진 식에 자주 사용 되는 두 가지 방법이 있습니다. 과도 transfection는 안정 되어 있는 transfection 있습니다 호스트 세포 게놈으로 통합 외 인 유전자 그것은 지속적으로 표현 될 것입니다 어디에 단기 식에 유용 합니다. 그 결과, 안정 되어 있는 transfection는 보통 채택 연구에 대 한 장기 유전 규칙에. 여기 우리는 overexpressing 태그 죽음 수용 체 3 (DR3) DR3 함수를 탐구 하는 안정적인 셀 라인을 생성 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 동질성과 안정적인 셀 라인의 순수성을 유지 하기 위해 retroviral 감염 후 단일 클론을 선택. 이 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 안정적인 셀 라인 따라서 재구성 HT29 셀에 apoptotic 응답 antimitotic 약물에 민감한 DR3 불충분 한 HT29 셀을 렌더링 합니다. 또한, DR3에 플래그 태그 좋은 DR3 항 체의 불가능에 대 한 보상 하 고는 antimitotic 에이전트 apoptosis를 유도 하는 분자 메커니즘의 생 화 확 적인 연구를 용이 하 게.

서론

분리 유전자 발현은 관심사의 유전자의 기능 연구를 종종 고용 된다. 두 가지 방법, 과도 및 안정 되어 있는 transfection, 세포 및 분자 생물학에 prevalently 호스트 셀^1,2에 DNA 또는 RNA의 세그먼트를 삽입 하 되. 뚜렷이 transfected DNA 또는 RNA 전달할 수 없습니다 딸 세포에 유전 변경만 시간의 짧은 기간 동안 보존 될 수 있도록. 다른 한편으로, 안정적 transfected 세포, 세 유전자 셀 라인에의 식을 유지 호스트 세포 게놈으로 통합 됩니다. 따라서, 안정 되어 있는 transfection 장기 유전 규칙에 대 한 연구에 대 한 일반적으로 소유 되는 방법입니다. 안정적인 셀 라인 비보에 대 한 마우스 모델에 xenografts 공부³에 이식 수 있습니다. 안정 되어 있는 transfection는 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다: 바이러스 및 nonviral. Nonviral transfection에 비해 바이러스 감염 다양 한 높은 효율^4,5,....

프로토콜

여기에 설명 된 모든 마우스 실험 승인 되었고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 칭화 대학에서 수행 note 하시기 바랍니다.

1입니다. 세대 DR3 Overexpression 셀 라인의

1. 3 전장 DR3 cDNA를 삽입 하 여 DR3 식 (pMXs-IRES-DR3-깃발)에 대 한 플라스 미드를 생성 플래그 retroviral 벡터 pMXs-IRES-Blasticidin BamHI/XhoI의 제한 사이트에 C-말단에 x.
2. Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)의 4 mL와 60mm 요리에서 같은 A 세포 성장. 셀 합류 80%-90%에 도달 하면, 다음 날 transfect 플라스 미드 pMXs-IRES-DR3-플래그의 2 μ g으로 셀 transfection 시 약을 사용 하 여 ( 재료의 표참조)에 따라 제조 업체의 수동²⁰.
3. 후 72 h는 상쾌한 수집, 0.45 μ m 살 균 필터를 사용 하 여 미디어를 여과 하 고 어둠 속에서 4 ° c.에 바이러스 성 현 탁 액을 유지
4. HT29 셀 DMEM 60 mm 접시에 성장 하 고 5% CO₂와 37 ° C에서 ....

결과

안정적으로 DR3 표현 하는 HT29 세포의 특성은 그림 1에 표시 됩니다. 클론 익스프레스 DR3, 다양 한 수준의 동안 부정적인 제어 역할 야생-타입 셀 exogenous 유전자 발현을 표시 하지 않습니다. 여기 우리 5 복제품, 표시는 1 복제 하 고 5 표현할 DR3의 최고 수준. 클론 1 및 5 다음과 같은 실험에 대 한 선택 했습니다.

Diazonamide의 관리 후 HT29와 HT29 DR3 세포의 형태는 그림 2에 10 배 확대에는 거꾸로 한 현미경으로 관찰 되었다. 10 nM diazonamide 48 h 치료, 후 HT29 DR3 깨진된 세포 막과 세포 파편 (하단 패널) 명백한 apoptosis를 보여주었다. 그러나, HT29만 라운드-최.......

토론

이 원고에서 우리 HT29 DR3 안정적인 셀 라인을 생성 하는 방법을 설명 합니다. HT29-DR3 셀 DR3 antimitotic 에이전트에 의해 유도 된 apoptosis에 기여 하는 분자 메커니즘을 공부에 대 한 모델을 제공 합니다. 이 방식은 다양 하 고 반복 합니다. 절차의 성공, 프로토콜의 4 개의 중요 한 단계 해야 간주 합니다. 첫째, 높은 생성 하기 위하여 충분 한 바이러스 titer 그것 것이 좋습니다 같은 A 셀에 80%-90% 합류 때 DNA transfection를 수행. 둘째, 바이러스 성 정지 2 주 보다는 더 이상 빛에서 커버에 4 ° C에서 저장 되어야 한다. 셋째, 150 mm 접시에 감염 된 세포를 분리 하는 경우 그것 감염 효율 변화 다른 세포로 잘 분리 된 식민지를 직렬 희석 하 고 좋습니다. 마지막으로, 단일 식민지를 따기 때 거기 해서는 안됩니다 주변 식민지에 대 한 어떤 오염 든 지.

이 프로토콜 대부분 셀 라인에서 잘 작동 하지만 단.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	Invitrogen	C11965500BT	10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신
발광 세포 생존도 분석	Promega	G7571
Paclitaxel	Selleck	S1150
pMXs-IRES-Blasicidin	Cell Biolabs	RTV-016
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
PBS	Invitrogen	C14190500BT
Trypsin-EDTA (0.25%)	Invitrogen	25200056
1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide	Santa Cruz	sc-134220
형질주입 시약	Promega	E2311
안티 마우스 2차 항체	Jackson ImmumoResearch	115-035-166
안티 플래그 항체	Sigma	F-3165
HT29 세포주	ATCC	HTB-38
plat-A 세포주	Cell Biolabs	RV-102
PVDF Immobilon-P	Millipore	IPVH00010
클로닝 실린더	Sigma	C1059
세포 이미징 다중 모드 리더	Biotek	BTCYT3MV
CKX53 도립 현미경	Olympus	CKX53
12웰 세포 배양 플레이트	Nest	712001
60mm 세포 배양 플레이트	Nest	705001
15mL 원심분리기 튜브	Nest
0.22 & m 멸균 필터	Millipore	SLGP033RB
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	5810000327
96 웰 화이트 폴리스티렌 마이크로플레이트	Corning	3903
Western ECL Substrate	BIO-RAD	1705060
ImageQuant LAS 4000	GE 헬스케어	ImageQuant LAS 4000
디컬러링 셰이커	HINOTECH	TS-2000A
Blasticidin	InvivoGen	ant-bl-1
자동 세포 계수기	BIO-RAD	TC 20
Opti-MEM I 환원 혈청 매체	Thermo Fisher	31985070

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