방법 논문

CRISPR-Cas9-기반 경쟁 분석 실험을 사용 하 여 유전 종속성의 조사

DOI:

10.3791/58710

⸱

2019년 1월 7일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Tumor Initiation and Maintenance Program, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 3Department of Bioengineering, University of California, San Diego

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고에서 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포 증식에 여러 후보 유전자의 역할의 간단 하 고 신속 하 게 조사에 대 한 클러스터 정기적으로 Interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) CRISPR-Cas9-기반 방법을 설명 합니다. 병렬입니다. 이 기술은 확장성 이며 다른 암 세포 라인에 적용 될 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

진 섭 동 연구 AML pathogenesis 개별 유전자의 역할을 조사 하기 위해 광범위 하 게 사용 되었습니다. 이러한 연구의 대부분을 만들었습니다 달성을 위한 완전 한 유전자 장애, 복잡 한 유전자 녹아웃 모델의 사용. 녹아웃 쥐와 이러한 연구는 유전자 형 관계를 조사 하는 우아하고 시간 시스템 제공, 후보 유전자를 평가 하기 위한 신속 하 고 확장 가능한 방법 하는 AML 세포 증식에 역할 또는 재생 AML 모델에 생존 여러 후보 유전자의 병렬 심문을 촉진 하는 것을 도울 것 이다. 게놈 편집 기술에서 최근의 진보는 극적으로 전례 없는 규모에 유전 섭 수행 하는 우리의 능력 향상 된. 편집 하는 게놈의 한 그러한 시스템 대상 셀 게놈에 신속 하 고 효과 변경을 하는 데 사용할 수 있는 CRISPR-Cas9-기반 방법입니다. 편리 하 고 CRISPR/Cas9-중재 유전자 삭제의 확장성은 유전자의 많은 수의 심문에 대 한 가장 매력적인 기술 중 하나 phenotypic 분석 실험에 있습니다. 여기, 우리 인간의 생존 또는 확산에 중요 한 역할을 재생할 수 있는 유전자의 역할을 조사 하기 위해 중재 CRISPR/Cas9 유전자-중단 높은 처리량 흐름 cytometry-기반 경쟁 분석 실험 결합을 사용 하 여 간단한 분석 결과 제시 하 고 murine AML 셀 라인입니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지난 몇 년간 주요 분자 경로 급성 골수성 백혈병 (AML) 병 인에의 기여를 식별에 초점을 맞춘 많은 연구 노력을 보았다. 전통적으로, 급성 골수성 백혈병 세포에 유전자 중단 조건부 녹아웃 쥐 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 사용 하 여 수행 되었습니다. 녹아웃 쥐의 유전자 삭제 spatio 시간적 제어를 위한 정교한 시스템을 제공, 유전자 녹아웃 쥐 생성 이며 노동 집약, 시간이 걸리는 비싼. 또한, 유전자 녹아웃 재결합 전략을 사용 하는 쉽게 확장할 수 없습니다; 이러한 전략 병렬로 여러 유전자의 심문에 잘 자신을 빌려 하지 않습니다. 노크 다운 생 mRNAs 작은 간섭 RNA (siRNA) 또는 shRNA 사용 하 게 RNA 방해 방법의 발견 후 많은 그룹 AML에 있는 특정 유전자의 역할을 조사 하기 위해 RNA 간섭 기법을 사용 하 여 시작 했다. 모두 인간과 murine AML 셀 악명 어려운 전통적인 지질에 기초를 둔 transfection 방법 transfect 이기 때문에, 대부분 급성 골수성 백혈병 세포에 유전자 기능 연구에 대 한 고용 lentivirally 또는 retrovirally로 인코딩된 shRNA 공부 한다. 최근 검색 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 그리고 관련된 Ca nucleases (CRISPR-Cas9) 유전자를 대상으로 기술1,2,3에 혁명을 했다. CRISPR-Cas9를 사용 하 여, 특정 유전자 또는 genomic 지구 수 수 삭제, 편집 또는 태그와 효율성 및 용이성. CRISPR-Cas9-기반 유전자 편집은 이제 단순, 효과, 및이 기술의 광범위 한 적용 다양 한 셀 형식에 유전자 형 관계를 조사 하기 위한 선택의 방법으로 나오고 있다. CRISPR-Cas9-기반 방법은 방법의 AML, 뿐만 아니라 개별 유전자를 심문 하지만 또한 기준점과 또는 풀링된 유전 스크린에 여러 유전자를 대상 하는 방법을 위한 잠재력으로 동시에 여러 유전자 조사에 선택 되 고 또한 있다 AML 종속성4,,56.

이 원고에서 우리는 유전자-중단 안정적인 CRISPR Cas9 중재 하는 유전자-편집 높은 처리량 cytometry 뒤에 따라 급성 골수성 백혈병 세포의 성장에 미치는 영향을 측정 하기 위한 간단한 경쟁 성장 분석 결과 설명 합니다. 이 방법은 간단 하 고 효율적인, 중간 처리 실험 조사 AML 셀에 동시에 여러 유전자의 역할에 대 한 확장입니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 생성 AML 셀 라인 클론 안정적이 고 적극적인 Cas9의 높은 식

  1. Cas9 lentivirus의 생산
    1. 하루 0: 플레이트 4 x 106 293T 세포 (BSL2) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)과 페니실린 biosafety 수준 2에서에서 10cm 조직 문화 접시에 L-글루타민과 DMEM의 10 mL에 셀 문화 후드 인증. 37 ° C 배양 기에서 접시를 놓습니다.
    2. 제 1 일: 도금된 293T 세포 주 1 70-80% 합칠 해야 합니다. 오후에는 다음과 같은 프로토콜을 사용 하 여 transfection를 수행 합니다.
    3. Transfection 매체, 문화 미디어와 transfection 시 실내 온도를 따뜻하게. Transfection에 대 한 모든 필요한 플라스 녹여
    4. PsPAX2, pMD2.G의 0.9 µ g 5 mL 튜브에서 transfection 매체의 500 µ L 함께 pLenti Cas9 플라스 미드의 9 µ g의 믹스 9 µ g.
    5. 하단 튜브 라운드 14 ml transfection 매체의 1.7 mL를 추가 합니다. 튜브는 튜브의 벽을 만지지 마십시오 transfection 매체에 직접 transfection 시 약의 57 µ L를 추가 합니다.
    6. 부드럽게 transfection 시 솔루션 전체 플라스 미드 믹스를 추가 하 고 측면에 튜브를 부드럽게 눌러 혼합. 20-30 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어. 한편, 시드 293T 접시에서 매체를 변경 합니다.
    7. 접시에 dropwise transfection 믹스를 추가 하 고 부드럽게 옆으로 효율적인 혼합 접시 바위. 37 ° C 배양 기에서 접시를 놓습니다.
    8. 제 2 일: 셀 하지 방해 또는 접시에서 제거 되도록 transfection 접시에서 상쾌한 부드럽게 발음. 폐기는 상쾌한. 셀을 dislodging 피하려고 접시의 측면에서 부드럽게 아래로 슬라이딩 하 여 신선한 10 %DMEM 매체의 10 mL를 추가 합니다.
    9. 제 3 일: 10 cm 살 균 주사기로 그려서 천천히 상쾌한 transfection 접시에서를 포함 하는 바이러스를 수집 합니다. 주사기에는 상쾌한 수집 후 주사기를 살 균 0.45 μ M 필터를 연결 누르고 주사기와 필터 폴 리 프로필 렌 신선 하 고 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 있습니다. 부드럽게 상쾌한을 포함 하는 폴 리 프로필 렌 15 mL 원뿔 튜브에 0.45 μ M 필터를 통해 바이러스를 필터링 하는 주사기를 찔 러.
    10. Aliquots-80 ° c.에 2 mL cryovials에서 2 mL를 각각의 바이러스 성 조절된 매체 저장
  2. AML 셀 라인의 변환
    1. -1 주: 살 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 10 µ g/mL을 1 mg/mL 재조합 인간 fibronectin 조각 재고 희석. 코트 조직 문화 승인 BSL2 셀 문화 후드에서 6 잘 플레이트 10 µ g/mL 재조합 인간 fibronectin 조각 작업 솔루션의 2 개 mL를 취급. 집착 포장 손실을 방지 하기 위해 증발 하 고 실내 온도에 상점에 하룻밤 사이에 접시를 래핑하십시오.
    2. 하루 0: Cas9를 포함 하는 바이러스 성 상쾌한 녹여. 바로 전에 spinfection 코팅된 접시에서 완전히 재조합 인간 fibronectin 조각 솔루션 발음 접시에 Cas9와 함께 바이러스 성 조절된 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 1300 x g 35 ° c.에 90 분에서 그것을 회전합니다 바이러스 성 입자 spinfected 잘 연결할 수 있습니다.
    3. 한편, 불리고 수를 셀의 개수 및 폴 리 프로필 렌 15 mL 원뿔 튜브에 2 x 106 셀 아래로 회전. 상쾌한 발음 하 고 신선한 문화 미디어의 2 mL에 펠 릿을 resuspend.
    4. Spinfection, 후는 spinfected에서 모든 바이러스 상쾌한을 잘 제거 하 고 삭제 합니다. 상쾌한에서 retroviral 입자는 spinfected의 바닥에 잘 붙어 있다. 이 음, 위의 단계에서 매체의 2 ml에서 resuspended 2 x 106 셀을 추가 합니다.
    5. 1300 x g 아주 짧게 (1-2 분) 하단에 정착 셀 수 있도록 충분 한에서 다시 접시를 회전 합니다. 인큐베이터에 접시를 놓고 우물에 연결 된 spinfected 바이러스 성 입자와 변환에 대 한 하룻밤 둡니다.
    6. 제 1 일: 셀 밀도 따라 자라 난을 피하기 위해 transduced 세포에 더 많은 매체를 추가 합니다.
    7. 제 2 일: pLenti Cas9 플라스 미드 Blasticidin 저항 마커 있기 때문에, 10 µ g/mL 복용량을 불리고 untransduced (제어) MOLM13에 Blasticidin 또는 마우스 MLL AF9 백혈병 세포 세포를 표현 하는 Cas9의 선택에 대 한 추가 합니다.
      참고: Untransduced 컨트롤의 모든 셀을 제거 하는 때 Blasticidin 선택 Cas9 불리고 MOLM13 또는 MLL AF9 백혈병 세포의 완전 한 여겨진다. 최적의 복용량을 사용할 수 있도록 MOLM13과 MLL AF9 백혈병 이외의 셀 라인, 복용량 응답 곡선이이 실험 전에 수행 해야 합니다. 바이러스 성 상쾌한의 적정도 낮은 변환 속도 경우 수행할 수 있습니다.
  3. 높은 Cas9 표현 세포의 클론.
    참고: 우리 일부 급성 골수성 백혈병 세포 라인에 클론 선택 되지 않을 수도 있습니다 필요 것으로 나타났습니다: 대량 Cas9 Blasticidin 선정 인구는 이미 높은 게놈 편집 효율을 하고있다. 이 경우 1.3 단계를 생략 하 고 서 부 blotting에 의해 대량 Cas9 blasticidin AML 셀에 Cas9 식 평가 단계 1.4 이동 가능 하다. 그것은 여전히 경쟁 분석 실험을 진행 하기 전에 대량 Cas9 AML 셀 (단계 1.5)에 유전자 편집 효율성을 평가 하는 중요 한 것입니다. 우리는 높은 Cas9 단일 클론의 선택 다른 단일 가이드 RNAs (sgRNAs)의 수를 테스트 하는 경우 특히 중요 한 게놈 편집 가변성 감소 육 신.
    1. 일종의 Cas9-Blasticidin MOLM13과 MLL AF9 백혈병 세포 이제부터 불리고 MOLM13 Cas9 MLL AF9 Cas9 세포, 각각, FACS 정렬 승인 BSL2 후드에 포함 된를 사용 하 여 선택한 단일 셀을 수행 합니다. 정렬 하는 것은 5-10 둥근 바닥 조직 문화 치료 96 잘 접시에 수행할 수 있습니다.
    2. 일단 MOLM13 Cas9 단일 MLL AF9 Cas9 클론 선택 되었습니다 하 고 개별적으로 명명 된, 10 µ g/mL Blasticidin의 Cas9 식의 유지 보수를 보장 하기 위해 문화 미디어에 10-20 클론 확장.
  4. 식은 immunoblotting 여 안정적인 Cas9 단백질의 확인 합니다.
    1. 제조 업체의 프로토콜에 의하여 핵 추출 키트를 사용 하 여 MOLM13과 MLL AF9 백혈병의 모든 Blasticidin 선택 클론의 핵 추출 물 확인 합니다. Cas9 단백질 표정을 반대로 플래그 pLenti Cas9 플라스 미드에 Cas9부터 M2 항 체는 N 맨끝 플래그 epitope에 연결을 사용 하 여 확인 하십시오.
    2. 10% 두번째-트리 스 젤과 위 밴드는 잘 분리까지 120 V에서 젤을 실행에 각 핵 추출에서 총 단백질의 50 µ g를 로드 합니다.
    3. 5% 우유 솔루션 1 h TBST 버퍼에 막을 차단 합니다.
    4. 하룻밤에 4 ° C에서 1 µ g/mL의 최종 농도에 반대로 플래그 M2 항 체의 1:1,000 희석와 막 품 어.
    5. 다음 날, TBST 버퍼 막 세척 하 고 HRP 활용된 반대로 마우스 2 차 항 체로 1 시간에 대 한 실 온에서 1:5,000 (최종 농도 0.16 µ g/ml)의 희석에 품 어.
    6. TBST 가진 철저 하 게 막 세척 하 고 오 점 ECL 기판을 사용 하 여 개발.
    7. 추가 기능 분석 (그림 1)에 대 한 서 부 blotting에 의해 보이는 것과 같이 Cas9의 가장 높은 단백질 식이 3-4 클론을 선택 합니다.
  5. 선택 된 클론에서 높은 Cas9 활동 보장
    1. 인간을 대상으로 하는 sgRNAs와 sgRNA 인코딩 벡터에서 lentiviral 상쾌한 준비 또는 단계 1.1에 설명 된 대로 AAVS1 세이프 하버 로커 스 마우스.
    2. 상단 Cas9 표현 MOLM13 transduce 또는 위에서 설명한 spinfection 메서드를 사용 하 여 안티 AAVS1 sgRNA lentiviral 상쾌한와 함께 복제 하는 MLL AF9 백혈병. 4 일 동안 2.5 µ g/mL Puromycin 선택 합니다.
    3. MOLM13-Cas9에서 게놈 DNA를 정화 또는 제조업체의 지침에 따라 게놈 DNA 추출 키트를 사용 하 여 각각 야생-타입 컨트롤 함께 Puromycin 선택 후 복제 하는 MLL AF9 Cas9 백혈병. Taq 중 합 효소 및 표 1에 나열 된 PCR 프로그램의 마스터 믹스 x 2를 사용 하는 AAVS1_test_primers와 PCR을 수행 하는 템플릿으로 DNA의 사용 50 ng.
    4. 2 %agarose 젤에 PCR 제품을 실행 하 고 젤 정화 268 기본적인 쌍 밴드 제조 업체의 프로토콜에 따라 젤 추출 키트를 사용 하 여. 생어 시퀀스 젤 AAVS1_target frag_F 뇌관을 사용 하 여 PCR 제품을 정화.
    5. 편집 편집 AAVS1의 비교 및 wildtype 시퀀스 온라인 웹 기반 도구 (그림 2)를 사용 하 여 효율성을 평가 합니다.

2. 복제 및 AML Cas9 셀에 sgRNAs의 변환

  1. 보통 처리량 sgRNAs의 클로닝
    1. 웹 기반 CRISPR 디자인 소프트웨어를 사용 하 여 관심사의 유전자에 대 한 4-6 sgRNAs 디자인. 있다 다양 한 CRISPR 디자인 도구 사용 가능한 온라인 입력된 DNA 시퀀스를 기반으로 하는 sgRNA 시퀀스를 생성 하는 http://crispr.mit.edu/와 같은.
      1. 별표와 필드에 적절 한 정보를 입력. SgRNA 디자인에 대 한 대상 게놈에 클릭 합니다. 순서 상자에 대상 시퀀스를 붙여 하 고 제출 버튼을 클릭 합니다.
    2. PKLV2-U6gRNA5 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-에서 복제에 대 한 W sgRNA 식 플라스 미드, 뉴클레오티드 "CACC" 감각 올리고 하 "AAAC" 역방향 보충된 센스 oligo 앞에 추가 주문 하기 전에. 96 잘 접시에 혼합 순서와 반대로 감각 oligos oligonucleotide 종합 회사에서 올리고-혼합 이라는.
      참고: 우리가 만든 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-U6gRNA5 pKLV2의 사용 W 플라스 미드, sgRNA 복제 BbsI 제한 사이트 있다. 다른 sgRNA 식 플라스 미드를 사용 하는 경우에 sgRNA oligonucleotides 사용 돌출부 적절 하 게 변경 해야 합니다.
    3. 어 닐 링 플레이트를 붙인 별도 U 아래 96 잘 접시를 가져가 라. 1 µ L의 마스터 믹스 만들기 T4 PNK, T4 DNA 결 찰 버퍼 x 10의 1 µ L 및 어 닐 링 반응 당 물의 6 µ L.
    4. 어 닐 링 플레이트의 각 음을 마스터 믹스의 8 µ L를 추가 합니다. 100 µ M의 1 µ L, 감각 및 센스 올리고 (또는 혼합된 감각 안티 감지 oligos의 2 µ L) 마스터 믹스를 추가 합니다. 2-3 번 플라스틱 부드럽게 잘 섞어, 우물의 바닥에 믹스를 잠시 접시를 회전.
    5. 다음과 같은 어 닐 링 프로그램을 사용 하 여 PCR 기계에: 2 분 30 s 95 ° C에서 37 ° C에서 30 분 뒤에 느린 냉각 속도 0.1의 22 ° C에 ° C/s. 어 닐 링, 후 희석 OligoMix이라는 신선한 96 잘 접시를 가져가 라. 이 접시에 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 물 (1: 200)로 위의 반응에서 phosphorylated 고 단련 oligos 희석.
    6. PKLV2-U6gRNA5 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-의 다이제스트 5 µ g W 벡터 BbsI 제한 효소 (10000 단위/mL)의 1.5 µ L 사용 하 여 적절 한 버퍼를 37 ° C에서 2 시간에 대 한 결 찰 나중에 대 한 선형화.
    7. 신선한 96 잘 접시 결 찰 격판덮개 를 표시 하 고 추가 20 ng는 BbsI의 소화 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-pKLV2-U6gRNA5 W 벡터 원하는 sgRNA 결 찰 당 하나의 잘 하. 이 희석 OligoMix 접시에서 phosphorylated, 단련 oligos의 2 µ L를 추가 합니다.
    8. 10 x T4 리가 버퍼의 1 µ L 및 T4 DNA 리가 효소의 1 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 멀티 채널 피 펫과 플라스틱 하 고 2 시간에 대 한 실 온에서 결 찰 믹스를 품 어.
      참고: 결 찰 믹스-20 ° C 변환 단계를 나중에 저장할 수 있습니다.
    9. 한편, 화학적으로 유능한 대장균 의 해빙 90 µ L 얼음 10 분 전에 결 찰 단계 끝에 세포.
    10. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 별도 96 잘 접시의 각 음에 유능한 세포의 10 µ L aliquots를 확인 합니다.
    11. 2.1.8에는 잘 포함 된 유능한 세포, 피 펫 아래 위로 부드럽게 단계에서 결 찰 혼합물을 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.
    12. 피 펫 5 µ L 6으로 위의 반응에서 직접 박테리아 DNA 혼합의 잘 접시 파운드-한 천 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 하. 변환 반응의 각각에 대해 반복 합니다.
    13. 6 잘 플레이트의 개별적 이라는으로 각 변환 반응 접시 각각 약 5-8 유리 구슬 잘 원형 운동에 있는 8-10 번 전체 6 잘 플레이트를 흔들어 추가 합니다.
    14. 살 균 20 µ L 피 펫 팁 각 우물에서 1-2 단 하나 식민지를 선택 하 고 파운드 agar와 100 mg/mL 암 피 실린 살 균 10 cm 배양 접시에서 신중 하 게 이라는 자리에 행진. 파운드 플레이트에 질주 후 단순히 하단 튜브 라운드 14 mL에 포함 매체 표시 해당 세균성 복제 수 클론 파운드-암 피 실린의 3 mL로 질주 사용 팁을 꺼냅니다.
    15. 생어에 직접 세균 접시를 보내 인간의 U6 발기인 앞으로 뇌관 시퀀싱.
    16. 복제 sgRNAs의 시퀀스 확인, 후 제조업체의 지침에 따라 소형 예비 키트를 사용 하 여 해당 14 mL 튜브에서 DNA를 정화.
    17. 분 광 광도와 농도 미니 preps의 각각의 품질을 측정 합니다. 각 소형 예비 sgRNA 클론 판표시 96 잘 접시에 15 ng / µ L와 피 펫의 농도를 정상화.
      참고: 이 접시-20 ° C에 저장 하거나 바이러스 준비에 대 한 직접 사용 될 수 있습니다.
  2. SgRNA 구문 및 변환의 바이러스 성 생산
    1. 96-잘 형식에서 sgRNA lentiviral 입자의 생산에 따라는 "shRNA/sgRNA/ORF 높은 처리량 바이러스 생산 (96 잘)" 광범위 한 연구소의 유전 섭 동 플랫폼 (GPP 웹 포털)에서 프로토콜 (URL: https:// portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols)입니다.
    2. 무 균 튜브에 바이러스 상쾌한의 200 µ L를 전송 하 고 즉시-80 ℃에서 동결.
    3. 주-1: 플랫 바닥 비 조직 문화 취급 96 잘 접시 BSL2 셀 문화 후드에서 10 µ g/mL의 농도에서 재조합 인간 fibronectin 조각의 100 µ L로 코트. 격판덮개 증발 손실을 방지 하 고 벤치에 그것을 떠나 하룻밤을 집착 포장을 사용 하 여 포장.
    4. 하루 0: 각 우물에서 재조합 인간 fibronectin 파편을 제거 합니다. 실 온에서 각 sgRNA의 바이러스 상쾌한 녹여 잘 변환 접시의 코팅 각 각 튜브에서 바이러스 상쾌한의 50 µ L를 추가 합니다. 1300 x g 35 ° c.에 90 분에서 변환 접시를 회전
    5. Spinfection의 끝 문화 플라스 크에서 MOLM13-Cas9 (클론 b 3) 셀을 계산 합니다. 100 µ L 볼륨에 잘 당 10000 셀을 사용 합니다. 죽은 볼륨을 고려 모든 변환 우물에 대 한 셀을 계산 합니다.
    6. 90 분 spinfection 후에 상쾌한 접시를 기울이기로 50 µ L를 천천히 조정 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 모든 우물에서 제거 합니다. 각 잘 천천히 아래로 슬라이딩 가장자리에서에 MOLM13 Cas9 클론 b 3 셀의 문화의 100 µ L를 추가 합니다.
    7. 셀 아래에 정착 하 게 35 ° C에서 2 분 동안 1300 x g 에서 접시를 회전 합니다. 37 ° C 조직 문화 학년 인큐베이터에 접시를 전송.
    8. 주: 1 각 잘 포함 sgRNA 신선한 매체의 100 µ L 불리고 Cas9 MOLM13 또는 Cas9-MLL-AF9 백혈병 세포는 최종 중간 볼륨 200 µ L를 추가 합니다.

3. 경쟁 성장 분석 결과

  1. 주 3: 72 시간 (3 일) 변환, cytometry (FACS)에 의해 각 잘에서 BFP 긍정적인 세포를 포함 하는 sgRNA의 비율을 확인 하십시오. 세포 생존 능력 염료를 사용 하 여 표시 하는 분석에서 제외 하는 죽은 세포.
  2. 다시 도금 셀의 비율으로 새로운 우물 신선한 매체와 동안을 피하기 위해 자라 난 분석 결과 모든 FACS 분석 후 계속 합니다.
  3. BFP 부정적인 (BFP-ve) 대응 (그림 3)에 비해 BFP 긍정적인 (BFP + ve) 세포의 상대적 비율을 확인 하려면 FACS 분석 2-3 일 마다 반복 합니다. BFP (FlowJo 또는 유사한 FACS 분석 소프트웨어를 사용 하 여) 각 시간 지점에 대 한 긍정적인 세포의 비율을 분석 합니다.
    1. FlowJo 소프트웨어를 각 샘플에 대 한 Fcs 파일을 끕니다. 어떤 하나의 샘플 파일에 더블 클릭 하 고 측면 분산형 (SSC)에 FSC SSC X 축 Y 축 대 앞으로 분산형 (FSC)의 점 오 점 플롯. 모든 셀 게이트
    2. 문이 셀을 두 번 클릭 하 고 금감위 높이 (H) 또는 지역 (A) 점 오 점 대 (Y 축)에 생존 얼룩에 플롯. 게이트는 생존 얼룩 네거티브 (라이브) 세포.
    3. 문이 라이브 셀을 두 번 클릭 하 고 플롯 BFP (Y 축)에 FSC (A) 대에 X 축. 게이트 BFP + ve 셀입니다. 그룹 탭에서 모든 샘플 을 선택한 샘플을 드래그 하 여 모든 샘플에 이러한 모든 게이트를 적용 합니다.
    4. 모든 샘플의 분석 테이블을 만드는 테이블 편집기 를 클릭 하십시오. 드래그 BFP + ve 테이블에 하나의 샘플에서 계산 하 고 보고서를 만들 일괄 처리의 모든 샘플 BFP + ve 세포의 백분율을 표시 하는 테이블 테이블 편집기 표시 버튼을 클릭. xls로 테이블을 저장 합니다.
  4. 비례 증가 계산 또는 시간이 지남에 라이브 셀 인구 내의 %BFP 긍정적인 세포 감소 하 고이 비율 (luciferase, 발진 등 GFP sgRNA) 제어 sgRNAs에 있는 BFP 긍정적인 세포의 비율을 비교.
  5. BFP 관심 기준으로 3 일을 사용 하 여 컨트롤의 gene(s)를 포함 하 여 다른 sgRNAs에 대 한 긍정적인 세포의 비율을 플롯 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리의 연구에서 우리는 먼저 MOLM13 인간의 AML 셀 라인 높은 titer 바이러스 Cas9 blasticidin lentiviral 플라스 미드를 인코딩 MLL AF9 전 곰 불리고. 우리의 손에서 정렬 되지 않은 MOLM13 Cas9 셀 서쪽 blotting에 의해 높은 수준의 Cas9 표현식을 표시 하지 않았다 고 또한 효율적인 유전자 편집 사용 하는 방법에 대 한 분석 하는 경우에 잘 실행 하지 않았다 대량7이전 설명. 따라서, 우리가 단일 세포 클론을 구축 하 고 서쪽 더 럽 히 (그림 1)에 의해 보이는 것과 같이 Cas9의 상부를 가진 클론을 선택 하였다. 우리가 2 다른 클론을 포착 하 고 기술 이전7AAVS1 세이프 하버 소재 시에 사이트를 대상으로 하는 sgRNAs로 불리고. MOLM13-Cas9-AAVS1 P...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고에서 우리는 AML 셀 라인-cytometry 인간/murine 급성 골수성 백혈병 세포 (그림 5)에서 사용 하 여 후보 유전자의 역할을 조사 하는 CRISPR-Cas9-기반 경쟁 성장 분석 결과 실시 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 분석 결과의 목표는 급성 골수성 백혈병 세포 증식의 유지 보수에 유전자 삭제의 효과 매체 처리량 규모에 2 ~ 3 주 이상입니다. 몇 가지 중요 한 단계 설명된 프로토콜 확장을 촉진 하기 위하여 신중 하 게 지켜질 필요가 있다. Cas9 lentivirus의 생산, 그것은 바이러스 조절 매체 carryover 293T 세포 상쾌한 포함 된 바이러스를 피하기 위해 0.45 μ M 필터를 통해 필터링 하는 데 필요한. Spinfection, 동안 집착 포장 또는 parafilm spinfection 접시 포장 원심 분리 동안 잠재적인 오염을 방지할 수 있습니다. 그러나, 포장은 조직 문화 인큐베이터에서 다시 spinfected 접...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.J.D는 A2A 제약 (뉴저지) 및 Salgomed 치료제 (샌디에고) 컨설턴트 이다. 다른 작성자 선언 충돌이 없는 있어야 합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PCW Cas9 플라스 미드 에릭 랜더 & 데이비드 사바 티 니 (Addgene 플라스 미드 # 50661)와 pKLV2-U6gRNA5 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-에서 선물 했다 な 연구소 (Addgene 플라스 미드 # 67974에서에서 플라스 미드 W. 우리에 대 한 적시 흐름 분석 및 정렬 SBP 의료 디스커버리 연구소에서 Cytometry 코어를 감사 하 고 싶습니다. 우리 인정 서에 레이디 타 타 기념 재단의 지원 하 고 싶습니다. 우리는 다음 자금 출처의 지원 인정 하 고 싶습니다: NIH/NCI P30 CA030199 암 센터 후원 그랜트, V-기초와 샌디에고 NCI 암 센터 (C3) #PTC2017to A.J.D.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
FLAG-M2 항체sigma-aldrichF3165, lot # SLBS3530V
안티-마우스 항체Invitrogen31446, lot # TA2514341
SuperSignal West Femto 최대 감도 기판Thermo Fisher34095
ChemiDoc 이미징 시스템BIO RAD17001401
Sorvall Legend RT 원심분리기Thermo Scientific
BlasticidinThermo FisherR21001
SYTOX RedThermo FisherS34859
Opti-MEMThermo Fisher31985062
DMEMThermo Fisher11965-092
RPMIThermo Fisher11875-093
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher15140122
L-글루타민 (200 mM)Thermo Fisher25030081
Fetal Bovine Serum (FBS)SAFC12303C
single gRNA vectorAddgene #67974pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic 핵 추출 키트sigma-alorichNXTRACT
XtremeGENE 9sigma-alorich6365787001
RetronectinTakaraT100B
유세포 분석기BD Biosciences
T4 PNKNEBioLabsM0201S
T4 DNA 결찰 완충액NEBioLabsB0202S
T4 DNA 리가제 효소NEBioLabsM0202S
암피실린피셔 사이언티픽BP1760-25
LB 한천피셔 사이언티픽BP9724-500
LB 브로스피셔 사이언티픽BP9731-500
Qiagen 미니 준비 키트Qiagen27104
NanoDrop 분광 광도계Thermo FisherNanoDrop One
재조합 쥐 IL-3Peprotech213-13
재조합 쥐 IL-6Peprotech216-16
재조합 쥐 M-CSFPeprotech315-02
안정된 유능 세포NEBiolabsC3040I
10cm 조직 배양 접시Fisher Scientific353003
세포 용해 용액Qiagen158906
단백질 침전 용액Qiagen158910
DNA 수화 솔루션Qiagen158914
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
BbSINew England BioLabsR0539S
APEX 2.0x Taq Red Master Mix KitGenessee Scientific42-138
PuromycinFisher ScientificBP2956100
50 mL 폴리프로필렌 원추형 튜브Fisher scientific1495949A
15mL 폴리프로필렌 원추형 튜브Fisher Scientific1495970C

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  3. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  4. Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
  5. Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
  6. Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
  7. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  8. Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58(2018).
  9. Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
  10. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
  11. Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
  12. Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
  13. Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
  14. Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
  15. Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
  16. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  17. Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, pdb prot4755 (2007).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

CRISPR Cas9Flow CytometryCompetition AssayGene KnockoutAML Cell LinesSingle Guide RNALentiviral TransductionBFP Positive CellsFlow Cytometry AnalysisGenetic Dependencies

관련 논문