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방법 논문

원래의 배달 옥수수 단백질에 대 한 Ustilago maydis 트로이 목마 사용 하

11.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58746

⸱

2019년 2월 8일

 ,  , 
1Department of Biology, Regensburg University, 2Department of Biology, Ludwig-Maximilians University of Munich

이 논문에서

요약

이 작품 옥수수 조직의 세 가지 유형으로 옥수수 단백질 분 비의 원래의 장소에 배달에 대 한 Ustilago maydis 트로이 목마 스트레인의 복제에 대해 설명 합니다.

초록

Homer´s 트로이 말 신화에서 영감을, 우리 옥수수 병원 체 Ustilago maydis vivo에서 phenotypic 분석을 허용 하는 옥수수 apoplast으로 분 비 단백질을 제공 하도록 설계. 이 방법은 옥수수 변환에 의존 하지 않는 하지만 미생물 유전학 및 병원 균의 분 비 기능을 악용. 여기, vivo에서의 검사 전달 감염 사이트 및 직물의 다른 종류에서 spatiotemporal 고해상도 단백질 분 비 수 있습니다. 트로이 목마 전략 정도 기능 단백질 도메인, 분석에서 대상 단백질 효과, 또는 온 사 이드 단백질 overdosage를 위한 강력한 도구를 만드는 연구를 특성화 하기 위해 옥수수 기능 손실 고기를 보완 하기 위해 이용 될 수 있다 옥수수 작물 시스템에서 단백질 연구입니다. 이 작품 뒤에 3 개의 다른 옥수수 조직 형식에이 메서드를 적용 하는 표준화 된 감염 프로토콜 트로이 목마 긴장을 생성 하는 방법에 정확한 프로토콜을 포함 합니다.

서론

Biotrophic 병원 체 Ustilago maydis 1옥수수 smut 질병 원인이 되는 에이전트입니다. 그것은 모든 공중 부분 melanized, 검은 포자를 포함 하는 큰 종양에 따른 옥수수의 감염. 글로벌 수준에서 미국 maydis 종양 멕시코의 gastronomical 진미로 평가 되는 동안 옥수수 생산량의 약 2%의 연간 손실 발생으로 추정 된다. 식물 감염 옥수수 표 피 세포의 첫 번째 계층에 침투를 lysing 효소 세포 벽을 분 비 하는 appressorium에 의해 시작 됩니다. 1 차 감염 사이트에서 미국 maydis 성장 침 및 intercellularly, 모든 주1,2레이어 1 ~ 2 셀에 침입. 5 일 시 보이는 종양으로 공장 비 대에 성공적인 감염 결과 감염1,,34게시. 모든 감염 단계 곰 팡이 균 invaginate 호스트 세포질1,2에 직접 접촉 하지 않고 공장 세포질 막. 감염 균과 식물 원형질 막 사이 공간을 꽉 apoplasmic biotrophic 상호 작용 영역 이라는 호스트/병원 체 인터랙티브 사이트로 간주 됩니다. 극복 하기 위해 공장 타고 난 면역 계통, 미국 maydis biotrophic 상호 작용 영역1에 effector 단백질의 배열을 은닉 한다. 반면 다른 사람 biotrophic 상호 작용 영역5,6,,78에 어떤 이펙터 식물 세포에 의해 찍힌다. 1 apoplastic 이펙터 UmPit2 신호 펩 티 드 ZmZIP1 ZmPROZIP에서 apoplastic 프로 테아 제 활동9,10의 출시를 방지 하기 위해 옥수수 apoplastic 프로 테아 제와 상호 작용 하는.

지난 십년 동안 미국 maydis 되었다만 식물 병원 체 상호 작용에서 곰 팡이 유전학 뿐만 아니라 생명 공학 파악된 수명 주기, 쉬운 유전 접근 가능성 때문에 귀중 한 도구에 대 한 모델 및 분리 식의 분 비 단백질11,,1213. 모두 기존과 파격적 단백질 분 비에 대 한 신호 posttranslational 수정14의 제어를 허용 결정 되었습니다. 최근, 미국 maydis 트로이 목마 도구 작은, 공부를 해 라15옥수수 단백질 분 비로 고용 되었다. 트로이 목마 접근 작은, 분 비 단백질은 꽃 밥 개발에 관여 하는 ZmMAC1의 기능 분석을 성공적으로 사용 되었다. ZmMAC1 유도 만능 세포 및 세포 운명 명세의 새로 형성된 된 셀15의 periclinal 부문 합니다. 같은 방법으로는 옥수수 손상 관련 된 펩 티 드 ZmZIP1의 생물 학적 기능으로 밝혀졌다. 미국 maydis 귀착되 었 다 ZmZIP1 옥수수 은닉 종양 형성10손상. 따라서, 트로이 목마 접근 방식을 나타내는 단백질도 않는 spatiotemporal 고해상도 현장 연구에 귀중 한 대체 경로 필요 안정적인 옥수수 변환 라인도 함께 조직 침투의 세대 heterologously 표현 및 순화 된 단백질입니다. 특히, 트로이 목마 전략 옥수수 apoplast에 어떤 분리 단백질의 분 비와 같은 조직 내에서 감염 되지 않은 식물 세포 감염 대 의 직접 비교 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 관심사의 단백질을 공부 하는 미국 maydis 트로이 목마 스트레인을 생성 하기 위한 주요 단계를 보여 줍니다. 그것은 더 포함 (성인 잎, 술과 귀) 3 다른 옥수수 조직 유형의 감염 절차에 정확한 정보 미 maydis, spatiotemporal 감염 진행 및 단백질 기능을 공부에 대 한 전제 조건입니다. 이러한 대상 조직. 아니 추가 사양은 옥수수 유전자 증폭에 부여 하 고 있기 때문에 이러한 단계는 특정 대상 및 악기 종속적 기법, 영상 현미경입니다. 따라서,이 프로토콜은 표준 분자 생물학 기술의 숙련 된 사용자에 게 제시 된다.

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프로토콜

1. 미국 maydis 트로이 목마의 건설

참고: 그림 1을 참조 하십시오.

  1. 옥수수 cDNA 유전자 특정 뇌관과 교정의 DNA 중 합 효소를 사용 하 여에서 관심사의 유전자를 증폭. 기본 PCR 제품을 복제 하 고 대장균 플라스 미드 공급 업체의 지침. 구조를 변환 생어 시퀀싱 전에 다음 복제 단계 사용 하 여 관심 시퀀스의 정확한 유전자를 확인 합니다.
    참고: PCR 사양 뇌관 순서 특이성 및 최적의 DNA 중 합 효소 반응 조건 최적화가 필요 합니다.
  2. 신호 펩 티 드 (SP) 인코딩 순서 없이 관심의 옥수수 유전자를 증폭 하는 뇌관 디자인.
  3. RSIATA 모티브와 Nco역방향 뇌관의 5´ 끝 확장 나 절단 사이트 (표 1).
  4. 교정 DNA 중 합 효소 PCR 템플릿으로 1.1에서 생성 된 PCR 구문을 사용 하 여 함께 관심의 옥수수 유전자를 증폭.
  5. 더블-다이제스트 PCR 제품 및 미국 maydis 변환 플라스 미드, p123 PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-하15 Xba어 Nco I. 소화 PCR 제품 및 플라스 미드 정화.
  6. 템플릿으로 p123 PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-하 T4 DNA 리가 manufacturer´s의 지침을 사용 하 여 소화 PCR 제품을 선. 대장균 으로 결 찰 제품을 변환 하 고 생어에 의해 관심 시퀀스의 정확한 유전자 확인 연속.
  7. 선형화는 p123 PUmpit2-SpUmpit2-Zm관심-mCherry의 유전자-제한 효소 Ssp와하 어 변환 solopathogenic 미국에 DNA maydis SG20016스트레인. Carboxin 선택에 의해 미국 maydis transformants를 분리 하 고 남부에 의해 격리 된 transformants 오 점 분석16확인.
    참고: 관심, 적어도 3 개의 독립적인 미국 maydis 의 각 단백질에 대 한 transformants 절연 해야 하 고 임의의 배경 돌연변이의 표현 형 효과 추정 하는 분석 했다.

2입니다. 문화 미디어

  1. YEPSlight 액체 중간16준비: 1.0% (w/v) 효 모 추출 물, 0.4% (w/v) Bacto 펩 고 0.4% (w/v) 자당. DdH2O와 15 분; 121 ° C에서 압력솥의 모든 구성 요소를 분해 더 높은 온도에 압력가 마로 소독의 시간 또는 반복 해 서 더 긴 기간에 대 한 매체의 품질을 줄일 것 이라고.
  2. 감자 포도 당 한 천 (agar PD)20준비: 3.9% (w/v) 감자 포도 당 한 천, 그리고 1.0% (w/v) 1 M Tris HCl pH 8.0 (f.c. 0.01 M). 압력가 마로 소독 한 병에 직접 모든 구성 요소를 혼합 하 고 추가 ddH2O 플러스 자석 저 어 바. 15 분; 121 ° C에 고압 더 높은 온도에 압력가 마로 소독의 시간 또는 반복 해 서 더 긴 기간에 대 한 매체의 품질을 줄일 것 이라고.
  3. PD-숯 agar20준비: 3.9% (w/v) 감자 포도 당 한 천, 1% (w/v) 숯, 그리고 1.0% (v/v) 1 M Tris HCl pH 8.0 (f.c. 0.01 M). 압력가 마로 소독 한 병에 직접 모든 구성 요소를 혼합 하 고 추가 ddH2O 플러스 자석 저 어 바. 15 분; 121 ° C에 고압 더 높은 온도에 압력가 마로 소독의 시간 또는 반복 해 서 더 긴 기간에 대 한 매체의 품질을 줄일 것 이라고.

3. 식물 감염

  1. 단백질 (예를 들어, 현미경-기반 셀 계산)를 전달 하는 트로이 목마에 대 한 응답에서의 옥수수 세포 분석 수행 미리. 미국 maydis-옥수수 세포 증식을 유도 하 고 후속 종양 형성 4-5 일 포스트 감염 주위 시작. 양적 질병 평가 조직 하 고 14 일 게시물 감염에 6에서 수행 되어야 합니다.
    참고: 고유한 옥수수 재배 미국 maydis 감염 자화 율의 다른 수준을 표시합니다. 옥수수 c대 W23, A188, 개 스 피 플린트, 초기 황금 자그마한 또는 Va35 민감성이 병원이 체로 표시 하 고 따라서 트로이 목마 연구에 대 한 적합 한 재배.
  2. 미국 maydis inoculum의 준비
    1. 모든 트로이 목마 실험에 부정적인 컨트롤로 포함 조상 스트레인 SG200 유전자 변형 변형에 의해 감염에 부작용을 예상. 여기, 부정적인 컨트롤으로 관심사의 단백질의 분 비 되지 않은 버전을 표현 미 maydis 스트레인을 사용 합니다. 그러나, 실행할 수 (예를 들어, 큰 검 진)의 이유로 조상 스트레인 컨트롤의 쉽게 선택이 될 수 있습니다.
    2. 실험을 시작 하기 전에 어떤 양의 감염 문화 필요 예상. 옥수수 조직의 종류에 따라 각 식물의 감염 미국 maydis 서 스 펜 션의 1-1.5 mL를 요구 한다 명심에서 하십시오.
      참고: 야간 문화의 약 1 mL YEPS빛 매체의 0.2에 20 mL의 OD600 희석에 대 한 충분 한 이며 0.8-1.0의 OD600 와 미국 maydis 문화의 25 mL는 13-16 식물의 감염에 대 한 충분 한.
    3. PD 한 천에서 U. maydis 스크래치 접시 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, YEPS빛 매체의 5 mL에 접종 그리고 16 h 200 rpm에서 일정 한 동요와 28 ° C에서 성장 하는 문화.
    4. 감염 전에 적절 한 성장과 400 X 배율에서 세균 오염에 대 한 표준 가벼운 현미경에 의해 미국 maydis 접종 문화를 검사 합니다.
      참고: 적당 한 문화, 시가 모양의 버섯만 표시 (그림 2)입니다.
    5. 야간 문화 100 µ L 900 µ L 신선한 YEPS빛 의 혼합 하 고 OD600 분 광 광도 계 분석에 빈으로 YEPS빛 매체를 사용 하 여 측정 한다.
    6. 0.2의 OD600 신선한 YEPS빛 매체와 숙박 문화를 희석 하 고는 세에 의해 표시 중간 로그 성장 단계에 도달 될 때까지 200 rpm에서 일정 떨고와 28 ° C에서 성장 하는 문화600 nm 0.8-1.0.
      참고: 미국 maydis 셀이이 조건 하에서 2 시간 마다 복제, 따라서 원하는 OD600 재배의 4-5 h 후에 도달 하면.
    7. 10 분 동안 3000 x g 에서 회전 하 여 0.8-1.0의 OD600 세포를 수확 하 고는 상쾌한 삭제.
    8. 워시 셀 펠 릿 ddH2오와 함께 한 시간 이 위해 ddH2O, 3000 x g 스핀 10 분의 1 문화 볼륨을 추가 하 고 삭제는 상쾌한.
    9. DdH2O 20 mL 유리 피 펫을 사용 하 여 그로 인하여 조정 (대 한 트로이 목마 분석 결과) 3.0 또는 1.0 (질병 등급)에 대 한 마지막 세600 셀 펠 릿을 신중 하 게 resuspend.
  3. 트로이 목마의 확인: planta 옥수수 융해 단백질의 분 비에
    1. 트로이 목마 스트레인17옥수수 모 종 감염.
    2. Confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 2-3 일 게시물 감염에서 감염 된 묘 목의 미세한 이미지를 수행 합니다. 이 위해 소비 세 잎 주입의 지점 아래 1 ㎝의 사각형 조각, 현미경 슬라이드에 샘플 놓고 ddH2o.의 한 방울을 추가 MCherry 융합 단백질을 시각화 하기 위해 자극 λ에서 견본 561 및 λ에서 기록 방출 = = 580-630 nm.
  4. 성인 옥수수 잎의 감염
    1. 성인 잎의 단계에 옥수수 식물을 육성 (때 적어도 잎 줄기 내에서 성장 하는 7).
      참고: 이 단계는 14 h, 28 ° C 10 일/h, 22 ° C 밤 리듬 cv W23.를 사용 하 여 온실 조건에서 파 종 시 4 주 후에 도달 된다. 기간 옥수수 재배 온실 조건의 달라질 수 있습니다.
    2. 미국 maydis 문화 전송 (3.2.9 참조) 20G x 1 피하 주사 바늘으로 3 mL 주사기로.
    3. 분열 조직 조직 스토킹에 지역화를 신중 하 게 줄기를 누릅니다. 분열 조직의 부드러운 조직에 더 줄기에서 전환 하 여 구분할 수 있습니다.
    4. 펜을 사용 하 여 줄기에 분열 조직을 표시 합니다.
    5. 미국 maydis 문화 촬영 분열 조직 또는 화 서 분열 조직 1 cm의 1.5 mL를 주사.
    6. 6에서 12 일 게시 감염 질병 증상을 평가.
  5. 술의 감염
    1. 술 단계를 도달할 때까지 옥수수 식물을 성장 한다.
      참고: 꽃 밥과 술 개발에 옥수수 cv W23. 자세한 일정은 앞에서 설명한1819. 술 전 meiotic anthers를 포함 하는 미국 maydis 감염;에 매우 취약 옥수수 cv. W23에서에서 tassels 4-7 cm의 크기 이다.
    2. 줄기에 술을 지역화 하려면 신중 하 게 줄기를 누릅니다.
    3. 팁 및 펜을 사용 하 여 줄기에 술의 기지를 표시 합니다.
    4. 미국 maydis 문화 전송 (3.2.9 참조) 20G x 1 피하 주사 바늘으로 3 mL 주사기로.
    5. 술 주위 inoculum의 1.5 mL를 주사. inoculum의 동등 하 게 분배 되도록 천천히 끝, 중간 부분, 그리고 펜으로 표시 하는 술의 기본에 0.5 mL를 배치 합니다.
    6. 10 일 게시 감염에서 질병 증상을 평가.
  6. 귀 감염
    참고:     귀 조직 개발 및 다른 옥수수 재배 온실 조건에 다릅니다 접종 전에 신중 하 게 관찰 해야 합니다. 비단을 자라 다를 시작 하는 귀는 미국 maydis 감염에 매우 취약.
    1. 미국 maydis 문화 전송 (3.2.9 참조) 20 G x 1 피하 주사 바늘으로 3 mL 주사기로.
    2. 껍질 잎 사이 공간으로 접종 바늘 주사 가능한 깊이 귀를 부상 없이.
    3. 귀 주위 inoculum의 1.5 mL를 릴리스 합니다.
    4. 주사기와 바늘을 제거 하 고 신중 하 게 동등 하 게 미 maydis 솔루션을 배포 하는 개 암 나무 열매를 마사지.
    5. 14 일 게시 감염에서 질병 증상을 평가.
  7. 미국 maydis inoculum의 생존 능력을 확인
    1. PD 숯불 한 접시에는 inoculum의 10 µ L를 삭제 하 고 2 일 동안 실 온에서 품 어.
      참고: 경우는 각각 미국 maydis 문화 양식 필 라 멘 트, 솜 털, 백색 균 된다 표시 (그림 5)

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결과

미국 maydis 트로이 목마 실험에 대 한 구문은 플라스 미드 p123 PUmpit2-SpUmpit2-관심-mCherry의 유전자-하에 복제 됩니다. 관심의 옥수수 유전자 mCherry 형광 기자와 하는 epitope에 융합-태그. 융해 단백질의 표정은 감염21동안 활성화 특히 미국 maydis Umpit2 발기인의 제어. Biotrophic 상호 작용 영역으로 관심 펩 티 드의 단백질의 직접 분 비를 코딩 지역 미국 maydis Umpit221 (그림 1)의 신호...

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토론

현대 작물 연구에서 유전 분자 분석 및 단백질 수준에 대 한 프로토콜을 요구합니다. 유전 접근을 통해 변환 사용할 수 또는 비효율적이 고 옥수수 등 대부분 작물 종에 대 한 시간이 아니다. 또한, 발기인 기자 시스템 등 신뢰할 수 있는 유전 도구 부족, 어려운 별개 조직 사이트에서 고해상도 spatiotemporal 원래의 단백질 기능을 공부 하는. Apoplastic 단백질 조직으로 heterologously 표현 하 고 순화 된 단백질의 침투에 의해 공부 될 수 있다. 그러나, 분리 단백질 식 발전에 불구 하 고 작물 조직으로 타겟된 침투 어렵고 종종 단백질 기능 분석에 대 한 비효율적인이 남아 있다. 트로이 목마 전략은 변환 또는 단백질 침투를 요구 하지 않는 다른 접근 이다. 미국 maydis옥수수 병원 체의 분 비 기구를 채용 하 여 감염 된 조직의 공장 apoplast으로 이론적으로 어떤 관심사의 단백질의 납품을 얻을 수 있습니다. 관심사의 단백질의 크기에 대 한이 기술의 한계는 아직 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 토마스 Dresselhaus, 마틴 Parniske, 누 Djella, 그리고 아 르 민 힐 데 브란트 실험실 공간 및 식물 소재 제공 감사 하 고 싶습니다. 트로이 목마 방법에 원래 작업 Leopoldina postdoc 친교와 NSF 프로젝트 IOS13 39229에 의해 지원 되었다. 이 문서에 제공 된 작업 (프로젝트 A14 및 나사 B14) SFB924 DFG의 지원 했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2mL 주사기 B. Braun4606027V
23 G x 1 1/4 피하 주사 바늘B. Braun4657640
Bacto Peptone BD211677
cDNAinterrest 유전자를 발현하는 옥수수 조직에서
숯Sigma-Aldrich05105
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경현지에서 사용 가능한 장비를 사용합니다
큐벳 (10 mm x 4 mm x 45 mm)Sarstedt67742
인큐베이터-셰이커 28 °로 설정; C, 200 rpm사용 현지 장비 사용
400배 배율사용 현지 장비 사용
Nco INEBR0193
p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha교신자에게 문의하십시오 
파스퇴르 피펫 (유리, 긴 팁)VWR14673-043
pCR-Blunt-II-TOPOThermo Fisher ScientificK280002pENTR 또는 pJET Potato Dextrose Agar와 같은 다른 기본 클로닝 벡터로 교환할 수 있습니다
.VWR90000-745
Sharpie 펜은 현지에서 사용 가능한 장비를
사용합니다
Ssp INEBR0132
자당시그마-알드리치S0389
T4 DNA 리가제NEBM0202
트리스Sigma-AldrichTRIS-RO
em>Xba INEBR0145
효모 추출물 BD212750
은 의 광학 현미경 는 < (한국어판)

참고문헌

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