방법 논문

Telomeric 반복 포함 된 RNA 테라에서 살아있는 세포에서 단일 Telomere 표현 시각화 하 암 세포 클론의 세대

DOI:

10.3791/58790

⸱

2019년 1월 17일

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology and Molecular Genetics, Department of Cellular, Computational and Integrative Biology - CIBIO, University of Trento, 2Department of Life Sciences, University of Trieste

이 논문에서

요약

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여기, 선물이 단일 subtelomere에서 MS2 시퀀스 태그를 포함 하는 암 세포 클론을 생성 하는 프로토콜. MS2 GFP 시스템에 의존 하는이 방법은 생 성적표의 telomeric 반복 포함 된 RNA (테라)에서 살아있는 세포에서 단일 telomere 표현의 시각화 수 있습니다.

초록

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Telomeres는 복사할 수, 반복 포함 하는 긴 noncoding RNAs (테라), telomeric를 야 기한는 telomere 생물학, telomere 길이 항상성 섬으로 형성 등 중요 한 역할을 제안 되었습니다. 최근 연구 결과 밝혀 테라 분자도 마우스 배아 줄기 (ES) 세포에 유전자 발현을 조절 하기 위해 내부 염색체 영역 상호 작용. 이 증거에 따라 RNA 형광 제자리에서 교 잡 (RNA-물고기) 분석만 하위 집합으로 나타났습니다 테라의 성적표는 염색체 끝에 지역화. 테라 분자의 역학의 더 나은 이해는 그들의 기능 및 행동의 메커니즘을 정의 하는 데 도움이 됩니다. 여기, 우리 고 MS2 GFP 시스템을 사용 하 여 암 세포에서 단일 telomere 테라 성적표를 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 이 목표에 선물이 안정적인 클론을 생성 하는 프로토콜 MS2 시퀀스에서 단일 subtelomere 통합을 포함 하 AGS 인간 위 암 세포 라인을 사용 하 여. MS2 태그 telomere에서 테라의 전사 (MS2-GFP) GFP 융합 MS2 RNA 의무적인 단백질의 공동 식 시 라이브 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 시각 MS2 태그 테라 분자의 표현을 결과입니다. 이 방법은 수 연구원은 암 세포에서 단일 telomere 테라 분자의 역학을 공부 하 고 다른 셀 라인에 적용 될 수 있습니다.

서론

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긴 noncoding RNA 테라 염색체의 subtelomeric 지역에서 복사할 및 그것의 녹음 방송 종료 telomeric 반복로1,2내 염색체 끝을 향해. 이러한 이유로, 테라 사본 그들의 5' 끝에 subtelomeric 파생 시퀀스의 구성 하 고 telomeric 반복 (척추 동물에 UUAGGG)3종료. 역할 제안 되었습니다 테라,7,8 끝 telomeres4,5, DNA 복제6, 염색체 가운데 동종 재결합을 추진에서 섬으로 형성을 포함 하 여 중요 한 , 9, telomere 구조10및 telomere 길이 항상성2,11,,1213통제. 또한, 테라 성적표 마우스 배아 줄기 (ES) 세포14에 광범위 한 유전자 발현 조절에 수많은 extratelomeric 사이트와 상호 작용 합니다. 이 맞춰 증거, RNA 형광 제자리에서 교 잡 (RNA-물고기) 분석만 테라 성적 하위 집합 나타났습니다 telomeres1,,215에서 지역화 합니다. 또한, 테라 폼 핵 집계 마우스 세포2,16에서 X와 Y 염색체에서 지역화를 보고 되었습니다. 이러한 연구 결과 테라 성적표는 핵 내에서 복잡 한 역학 받아야 나타냅니다. 테라 분자의 역학을 이해 그들의 기능 및 행동의 메커니즘을 정의 하는 데 도움이 됩니다.

MS2 GFP 시스템은 다양 한 유기 체17,18에서 살아있는 세포에서 RNA 분자를 시각화 하기 위해 널리 사용 되었습니다. 이 시스템은 이전 태그를 S. cerevisiae12,19에서 단일 telomere 테라 분자 시각화 사용 되었습니다. 이 시스템을 사용 하 여, 최근에 보였다는 효 모 테라 성적표 지역화 세포질 내 게시물-diauxic 이동 단계 동안 테라 extranuclear 기능20발휘 수 있습니다 제안. 최근 암 세포21단일 telomere 테라 성적표 공부 MS2 GFP 시스템을 사용 했습니다. 이 목표를 우리 MS2 시퀀스는 단일 telomere (telomere 15q,이 하 Tel15q)에 통합 하는 CRISPR/Cas9 게놈 편집 도구를 고용 하 고 얻은 MS2 태그 내 생 Tel15q 테라 (테라 MS2 클론)을 표현 하는 클론. 인식 하 고 생활에 단일 telomere 테라 성적 MS2 RNA 시퀀스 수 시각화를 바인딩합니다 MS2 RNA 바인딩 GFP 융합 단백질 (MS2-GFP)의 공동 식21세포. 여기 설명 하는 프로토콜의 목적은 테라 MS2 클론의 생성에 필요한 단계를 자세히 설명 하는 것입니다.

테라 MS2 클론을 생성 하려면 MS2 카세트 telomere 15q의 subtelomeric 지역 통합은 테라 발기인 지역 및 전사 시작 사이트의 다운스트림. MS2 카세트 lox p 사이트에 의해 형벌 네오 마이 신 저항 유전자를 포함 하 고 subtelomere 15q에의 통합 CRISPR/Cas9 시스템22를 사용 하 여 수행 됩니다. 카세트, 단일 클론 MS2의 transfection 선택 후 카세트의 subtelomeric 통합 PCR에 의해 확인 된다 DNA 시퀀싱 및 남쪽 오 점. 긍정적인 복제품만 MS2 시퀀스 및 subtelomere 15q에 단일 lox p 사이트는 카세트에 선택 표시를 제거 하려면 Cre 표현 아 데 노 바이러스와 감염 됩니다. Tel15q에서 MS2 태그 테라 성적 표현의 실시간 정량 Pcr에 의해 확인 됩니다. 마지막으로, MS2 GFP 융해 단백질은 표현 형광 현미경 검사 법에 의해 MS2 테라 성적표를 시각화 하기 위해 retroviral 감염을 통해 테라 MS2 클론에. 테라 성적표 RNA 물고기에 의해 쉽게 검출 될 수 있다 고 반복 전용 telomeric를 사용 하 여 라이브 셀 이미징 프로브1,2,,1523. 이러한 접근에는 단일 셀 해상도에서 테라 분자의 전체 인구의 지역화에 대 한 중요 한 정보가 나와 있습니다. 단일 subtelomere에서 MS2 시퀀스를 포함 하는 클론의 세대에는 단일 telomere 테라 성적 기능과 테라의 행동의 메커니즘을 정의 하는 데 도움이 됩니다 살아있는 세포에서의 역학을 공부 하는 연구자 수 있게 된다.

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프로토콜

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1입니다. 네오 마이 신 내성 클론의 선택

  1. 햄의 F-12_K (Kaighn) 매체와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 페니실린 (매체의 mL 당 0.5 단위), 스 (중간의 mL 당 0.2 µ g) 37 ° C, 5% CO2보충에 AGS 세포 성장. SgRNA/Cas9 벡터와 MS2 카세트 1시 10분에 표현 된 50-60% 합류에 셀 transfect 어 금 니 비율21.
    참고: 병렬 실험에서 GFP 표현 벡터 (즉, Cas9-GFP 벡터) transfecting 여 transfection 효율을 확인 합니다. 적어도 60-70 %transfection 효율을 달성 한다.
  2. 다음 날, 0.7 µ g/mL 최종 농도 (선택적 매체)에서 네오 마이 신을 포함 하는 매체 자란 매체를 바꿉니다.
    참고: 셀 분할 하 고 그들을 시드 선택적인 매체에 다음날 transfection 선택 프로세스 속도가 향상 됩니다. 모든 비 페 셀 즉시 죽을 것 이다. Transfection 6 잘 플레이트에서 수행 하는 경우이 경우는 60%에서 각 잘 합류 포함 약 0.7 x 106 셀, 셀 10 cm 접시 포함 하 선택적인 매체에 단일 우물에서 분할 될 수 있습니다 다음 날 됩니다.
  3. 계속 셀 선택적인 매체에 7-10 일에 대 한 변화 하는 매체 마다 하나 또는 이틀, 단일 복제 될 때까지 표시 됩니다.
  4. 세포 클론의 따기
    1. 포함 하는 각 음에 0.25 %trypsin 10 µ L 96 잘 접시를 준비 합니다.
      참고: 두 준비 96 잘 접시 경우에 이상의 96 클론 선택 될 것으로 예상 된다.
    2. 현미경의 사용으로 표시 각 클론의 위치 표시 10 cm 접시에는 마커를 사용 하 여 접시의 바닥에 점 여. 각 점 하 식민지에 대응 됩니다.
    3. 대체 자란 매체와 충분 한 인산 염 버퍼 염 분 (PBS) 클론에 액체의 얇은 필름을 형성 하 여 세포 복제 따기 동안 건조 하 게 하지.
    4. 10 µ L 피 펫을 사용 하 여 단일 식민지를 선택 하십시오. 트립 신 식민지의 5 µ L을 포함 하는 팁을 부착 하 고 천천히 식민지에 지역화 된 유지 trypsin 출시. 1 분에 대 한 셀을 분리 다음 팁과 식민지를 긁 고 팁으로 그것을 빨을 트립 신을 수 있습니다.
      참고:이 절차 동안 내리고 한쪽에 약간 접시 포착 되 고 식민지 주위 PBS의 볼륨을 감소 도움이 될 것입니다 따기 프로세스 식민지 주위 trypsin diluting 피하 여 그래서. 클론 링을 사용 하 여 또한 단일 클론을 따기 도움이 수 있습니다.
    5. 0.25 %trypsin 10 µ L을 포함 하는 96 잘 접시의 우물에는 식민지에서 세포를 놓습니다.
    6. 실 온에서 5 분을 품 어 다음 선택적 매체 (햄의 F-12 K (Kaighn 의) 중간 10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (매체의 mL 당 0.5 단위), 스 (중간의 mL 당 0.2 µ g) 보충과 네오 마이 신에 포함 된의 150 µ L 잘 채워 0.7 µ g/mL의 농도입니다.
      참고: 보육 시간 동안 다른 클론 선택 수 있습니다. 가능한 많은 클론을 선택 하는 것이 좋습니다. 더 많은 클론 선택 가능성이 높은 긍정적인 것 들을 식별 될 것입니다.
    7. 일단 모든 클론 선택 96 잘 접시에 전송, 허용 선택적 매체 10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (매체의 mL 당 0.5 단위), 스 (0.2 µ g mL 당 보충 햄의 F-12 K (Kaighn 의) 중간에에서 몇 일 동안 성장 하는 세포 매체)의 90%의 합류를 도달할 때까지 37 ° C, 5% CO2, 0.7 µ g/mL의 농도에서 네오 마이 신을 포함 하 고.
  5. 클론의 분
    1. 3 준비 96 잘 접시 잘, 당 젤라틴의 추가 100 µ L에 의해 젤라틴 코팅 실 온에서 30 분 동안 품 어 후 PBS로 두 번 씻어. 이 번호판 DNA 추출 (DNA 플레이트)과 냉동 (냉동 번호판) 복제에 사용 됩니다.
      참고: 젤라틴 첨부 파일의 세포와 DNA의 우물을 추진 하겠습니다. 특히, 젤라틴 코팅 DNA DNA 추출 하는 동안 우물의 바닥에 막대기 및 절차 (아래 설명)을 씻어 수 있습니다. 복제 분할 절차 동안에 그것은 멀티 채널 피 펫을 사용 하는 것이 좋습니다.
    2. 클론 90% 합류에 도달, 96 잘 접시의 각 우물에서 매체를 발음, PBS로 세척, 잘, 당 0.25 %trypsin 30 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 품 어
      참고: 클론은 클론 당 선택 하는 셀의 수에 따라 달라 집니다 것입니다 또한 다른 속도로 성장할 것입니다. 따라서,이 단계는 다른 클론 90% 합류를 도달 하는 때 몇 일 동안 수행 됩니다.
    3. 잘 당 선택적인 매체의 70 µ L을 추가, 웰 스, 내부를 위아래로 pipetting으로 세포 덩어리를 중단 다음 gelatinized 냉동 번호판 prefilled 재치를 잘 하 고 30 µ L 당 선택적인 매체의 120 µ L로 prefilled gelatinized DNA 접시를 100 µ L의 30 µ L를 전송 (선택) 없이 h 50 µ L 미디어.
    4. 인큐베이터에서 DNA 접시를 놓고 90% 합류까지 37 ° C, 5% CO2 에서 성장 하는 세포를 허용 합니다.
    5. 냉동 접시의 각 음에 얼음의 80 µ L 갓 만든 동결 매체 (80 %FBS 20% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)) x 2를 추가, parafilm (70% 에탄올 뿌리) 각 잘 밀봉, 뚜껑 위에 놓고 포장 알루미늄 호 일 접시에 이렇게 접시 위에 추가. -80 ° c.에 냉동 번호판을 배치
    6. 분할 된 PCR 검사 결과까지 문화에서 그것을 유지 하는 클론을 포함 하는 원래 96 잘 접시를 잘 당 선택적인 매체의 90 µ L를 추가 합니다. 이 접시는 백업 접시로 사용 됩니다.

2. 네오 마이 신 내성 클론의 심사

  1. 96 잘 DNA 접시에서 DNA 추출입니다.
    1. 클론 DNA 접시에 배양 도달 90% 합류, PBS, 2 회 세척 후 50 µ L 세포의 용 해 버퍼 (10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 10 mM NaCl, 0.5 %SDS, 고 1 mg/mL 가수분해 K) lyse. Parafilm으로 플레이트 커버, 뚜껑을 넣어 각 잘 밀봉, 포장지로 커버 하 고 37 ° C에서 밤새 껏 두기 위하여.
    2. 추가 냉 에탄올 (동부 표준시-OH)의 100 µ L/NaCl 솔루션 (100% 에탄올에 0.75 M NaCl) 각 잘 6 h 또는 하룻밤 실 온에서 침전.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
    3. 접시를 반전 하 여 동부 표준시-오/NaCl 솔루션을 제거 하 고 잘 당 70% 에탄올의 200 µ L로 3 번 세척.
    4. 증류수에 RNAse A 솔루션의 25 µ L을 추가 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
  2. 게놈 DNA의 3 µ L를 사용 하 여 PCR 증폭에 대 한. 네오 마이 신 저항 유전자와 subtelomere 15q 단련 하는 뇌관을 사용 하 여 선택 된 클론의 PCR 검사를 수행 합니다. PCR 확대 표준 중 합 효소 효소와 PCR 프로토콜21을 사용 하 여 수행 됩니다.
    참고: PCR MS2 뇌관 (MS2-subtel15q-뇌관-S와 MS2 입문서로)과 클릭률 뇌관 (클릭률 프라임 S 및 클릭률 뇌관으로)에 대 한 조건은 다음: 20 98 ° C의 변성 단계 및 98 ° C 10 s, 58 ° C 20 s, 72 ° C 15 s 34 주기 다음으로 25 µ L에서 중 합 효소 효소를 사용 하 여 반응 혼합 ( 재료의 표참조). 뇌관 순서는 표 1에 표시 됩니다.
  3. Agarose 젤에 PCR 반응을 실행 하 고 표준 젤 추출 절차 (젤 추출 시 약에 대 한 재료의 표 참조)를 사용 하 여 긍정적인 클론에서 얻은 PCR 밴드를 추출.
  4. MS2 시퀀스21의 존재의 확인을 위해 젤 추출 PCR 제품의 DNA 연속 분석을 수행 합니다.
    참고: 시퀀싱 분석 수행할 수 있습니다 PCR 검사에 사용 되는 뇌관을 사용 하 여.
  5. PCR 긍정적인 클론의 남쪽 오 점 심사
    1. 클론 PCR 및 시퀀싱 심사 원래 96 잘 접시 (백업 플레이트)에서 10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (매체의 mL 당 0.5 단위), 스 (0.2 µ g 당으로 보충 하는 햄의 F-12 K (Kaighn 의) 중간에 6 잘 플레이트를 긍정적인 성장 매체의 mL) 37 ° C 5% CO2에서 0.7 µ g/mL의 농도에서 네오 마이 신을 포함 하 고.
      참고: 또는, 있다면 이러한 일부 손실, 해 동 냉동 번호판 (프로토콜 2.6 참조) 중 하나에서 그들.
    2. 클론에 90% 합류에 일단 6 잘 플레이트, PBS로 세포 세척 하 고 잘 당 0.5 µ g 가수분해 K를 포함 하는 세포의 용 해 버퍼의 250 µ L을 추가.
    3. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 긁 고 lysate 1.5 mL 튜브에 전송.
    4. 16 h 37 ° C에서 품 어.
    5. 100% 에탄올의 1 mL를 추가 하 고, 적극적으로, 악수 2 시간 이상 침전 또는-20 ° c.에서 하룻밤 DNA를 허용
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
    6. 10 분 동안 4 ° C에서 13,400 x g에서 회전 시키십시오, 상쾌한, 삭제 하 고 70% 에탄올과 펠 릿을 세척. 산 탄 어 실 온에서 건조 하 게. 또는, 진공 집중 장치를 사용 하 여.
    7. RNAse A를 포함 하는 증류수 50 µ L에서 DNA 알갱이 resuspend 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어
    8. 밤새 소화 반응 37 ° C에서 배양 하 여 100 µ L 반응 볼륨에서 NcoI 및 BamHI 제한 효소 (2 개의 독립적인 소화)를 사용 하 여 게놈 DNA의 5-10 µ g을 소화.
    9. 완전 한 소화 확인 agarose 젤 (agarose 0.8%)에 소화의 4 µ L를 실행 합니다.
    10. 100% 에탄올의 나트륨 아세테이트 3 M 솔루션 pH 5.2와 2 볼륨의 1/10 볼륨 제한 소화 반응에 추가 적어도 2 시간을 품 어 또는 DNA를 침전에-20 ° C에서 하룻밤.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
    11. 13,400 x g 20 분 동안 4 ° C에에 centrifuge supernatants, 삭제 하 고, 70% 에탄올과 펠 릿을 세척. 실내 온도에 공기를 펠 릿 건조 수 있습니다. 또는, 진공 집중 장치를 사용 하 여.
    12. 20 µ L의 증류수에 펠 릿을 resuspend 하 고 0.8 %agarose 젤에 소화 DNA를 로드 합니다.
      참고: 소화 DNA의 더 나은 해결을 위해 긴 젤 최소 15 cm를 준비 하 고 낮은 전압 (̴30 볼트)에서 밤새 껏 달린다. 전기 이동 법 설정 최적화 되어야 합니다.
    13. 다음 날, 실 온에서 30 분 동안 1 µ L/10 mL 최종 농도에 ethidium 평범한 사람 같은 DNA 라벨 에이전트와 젤을 얼룩이 고 악기 이미징 젤에 젤 가까운 통치자와 사진의 찍을.
    14. 나일론 막에 DNA의 전송을 설정 하 고 막 교 잡 MS2 시퀀스 관련 프로브21표준 절차 사용 하 여 수행.
    15. 녹여 PCR, DNA 시퀀싱 및 남부에서 긍정적인 클론 (다음 단계 참조) 두 개의 냉동 접시 중 하나에서 오 점.
  6. 클론의 해빙
    1. 5 mL의 미리 데워 진된 햄의 F-12 K를 포함 한 15 mL 튜브 준비와 10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (매체의 mL 당 0.5 단위), 스 (중간의 mL 당 0.2 µ g) 해 동 수를 각 복제에 대 한 보충 (Kaighn 의) 중간.
    2. -80 °에서 냉동 접시 중 하나를 제거 하 고 필요에 잘 포함 하는 동 수를 긍정적인 클론을 미리 데워 F12K 완전 한 매체의 100 µ L를 추가.
      참고:이 절차는 신속 하 게 수행 되어야 합니다 고 냉동 남아 다른 클론을 허용 하기 위하여 각 복제 해 동 후에 드라이 아이스에 96 잘 접시 배치 한다. 이것은 여러 클론 같은 96 잘 접시에서 해 동을 해야 하는 경우에 특히 중요 하다입니다.
    3. 매체와 실 온에서 5 분 동안 800 x g에서 원심 분리기의 5 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 세포를 전송 합니다.
    4. 매체를 발음 하 고 미리 예 열된 완료 F12K 매체의 500 µ L에 셀 resuspend 12 잘 플레이트의 단일 잘 각 복제 전송.
  7. Subtelomere 15q MS2 카세트에서 네오 마이 신 저항 유전자의 제거 통합.
    1. 클론 완전 F12K 매체에서 10 cm 접시 12 잘 접시에서 성장 하는 것을 허용 한다.
      참고: 네오 마이 신 안 포함 되어야 합니다는 매체에 명시 되지 않는 한.
    2. Cre 표현 아 데 노비 루스 10 mL 전체 F12K 매체의 합류 점 70%에서 10 cm 접시에 교양된 있는 셀에 추가 합니다.
      참고: Cre GFP 표현 아 데 노 바이러스를 사용 하 여 100% 접근 해야 감염의 효율성의 평가 허용할 것 이다. 아 데 노비 루스 복제 결함 문화에 몇 구절 후 손실 됩니다.
    3. 3 10 cm 요리에서 셀 분할 감염 후 48 시간. 두 요리 사용할 네오 마이 신 유전자 제거의 확인에 대 한 부정적인 선택, 네오 마이 신을 포함 하는 셀을 성장 매체 (첫 번째 접시), 남부 여 (두 번째 접시) 되 리.
    4. 문화 셀 및 RNA 추출에 대 한 복제를 포함 하는 세 번째 접시.

3. 실시간 정량 Pcr에 의해 테라 MS2 대 본 식의 확인

  1. 네오 마이 신 유전자 제거의 확인, 시 총 RNA 추출에서 테라 MS2 클론 유기 용 제 (페 놀 및 guanidine isothiocynate 솔루션)21을 사용 하 여 수행 합니다.
    1. Diethyl pyrocarbonate (DEPC) 물 100 µ L에 10 cm 접시에서 추출한 RNA resuspend
    2. 농도 및 RNA의 무결성을 확인 하려면 denaturating (1% 포름알데히드-포함) 1 x 3-(N-Morpholino) propanesulfonic 산 (MOPS) 젤에 RNA의 3 µ L를 실행 합니다. 또한 RNA 농도 분 광 광도 계를 사용 하 여 분석.
    3. DNAse와 RNA의 3 µ g 나 DNAse의 1 단위를 사용 하 여 치료 나 60 µ L 최종 반응에에서 효소.
    4. 품 어 1 h 37 ° c.에 대 한 반응
  2. 반전 녹음 방송 반응 및 정량 분석
    1. Nuclease 무료 microcentrifuge 관에는 다음 구성 요소 추가: 1 µ M 테라 특정 뇌관, dNTPs 믹스 (10 mM 각)의 1 µ L, DNAse I 치료 RNA (̴300ng RNA에 해당)의 6 µ L의 2 µ L. DEPC 물 4 µ L로 13 µ L 볼륨을 조정 합니다.
      참고: 각 RNA 분석에 대 한 동일한 시 약 하지만 테라 특정 뇌관 대신 참조 특정 뇌관, 포함 된 두 번째 튜브 준비 되어야 한다.
    2. 5 분 동안 65 ° C에 혼합물을가 열 하 고 적어도 1 분 동안 얼음에서 품 어.
    3. 간단히 원심 분리 하 여 튜브의 콘텐츠를 수집 하 고 5 X RT 효소 버퍼, 1 µ L 0.1 m M dithiothreitol (DTT), 1 µ L의 RNAse 억제제 (4 단위) 및 역전사의 1 µ L의 4 µ L 추가 ( 재료의 표참조).
    4. 60 분 동안 42 ° C에서 샘플을 품 어 다음 정량 분석에 대 한 RT 반응의 2 µ L을 사용 합니다.
  3. 정량 Pcr 반응 혼합 2 x qPCR 마스터 믹스, cDNA 템플릿의 2 µ L, 앞으로 뇌관 (10 µ M), 1 µ L의 역방향 뇌관 (10 µ M), 그리고 물 6 µ L의 1 µ L 10 µ L의 구성 20 µ L의 최종 볼륨에서을 준비 합니다.
  4. 정량 Pcr 반응 thermocycler21표준 프로토콜 사용 하 여 수행 합니다.

4. MS2 GFP 표현 레트로 바이러스의 생산

  1. 레트로 바이러스 벡터 (pBabe-MS2-GFP 순수 하지 않아)와 4: 1의 몰 비를 사용 하 여 (예: pCMV-VSVG) 벡터를 표현 하는 환경 을 유전자 MS2 GFP 융해 단백질 80 %confluent 피닉스 포장 셀 MS2 GFP 표현 레트로 바이러스를 생성 하려면 transfect 두 벡터 스
  2. 다음 날, 신선한 중간 포함 10 m m 나트륨 낙 산 염 (DMEM 보충 10 %FBS, 2 m L-글루타민 m와 펜/Strep) 자란 매체를 바꿉니다.
  3. 37 ° c, 5% CO2, 8 h incubate 다음 신선한 자란 매체에서 바이러스 수집 될 것입니다 매체를 바꿉니다.
  4. 48 h 후 피닉스 셀에서 레트로 바이러스를 포함 하는 매체를 제거 합니다. 이 매체 테라 MS2 클론의 감염에 대 한 직접 사용할 수 있습니다, 어떤 경우에 필터 매체 0.45 μ m 필터를 통해, polybrene (30 µ g/mL 최종 농도) 추가 및 셀 (이 경우 5 단계에서 계속 되는 프로토콜)에 그것을 추가. 또는 레트로 바이러스 50% 말뚝-8000/900 m m NaCl 솔루션의 1/5번째 볼륨을 추가 하 고 회전 바퀴에 4 ° C에서 하룻밤 배양 여 50ml 팔 콘 튜브에 침전 될 수 있습니다.
  5. 다음 날, 30 분 2000 x g에서 원심 분리에 의해 펠 레트로 바이러스 입자에 상쾌한, 제거 하 고 혈 청 하지 않고 F12K 매체에 펠 릿을 resuspend.
    참고: 바이러스 입자는 원래 표면에 뜨는 볼륨의 1/100번째 에 resuspended 수 있습니다. 감염 테스트를 효율적으로 세포를 감염 하는 데 필요한 레트로 바이러스의 최소 볼륨을 확인 하기 위하여 수행 되어야 한다.

5. 살아있는 세포에서 테라 MS2 성적표의 시각화

  1. 판 테라-MS2 클론 고 유리 바닥 요리에서 WT AGS 셀. 감염의 날, 매체 (30 µ g/mL 최종 농도) 및 MS2 GFP 표현 레트로 바이러스 polybrene을 추가 합니다.
  2. 24 시간 후, 바이러스가 포함 된 매체를 삭제 하 고 페 놀 레드 없이 신선한 매체를 추가 합니다.
  3. 적절 한 현미경 설정을 사용 하는 거꾸로 한 현미경에서 세포를 분석 합니다. 100 X 셀 또는 큰 숫자 조리개 (1.4 X)와 민감한 카메라 (EMCCD)를 사용 하 여 60 X 목표 이미지. 환경 제어 시스템을 사용 하 여 이미징 동안 37 ° C, 5% CO2 샘플을 유지.

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결과

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그림 1 실험적인 전략의 개요를 나타냅니다. 프로토콜 및 AGS 셀에서 테라 MS2 클론의 세대를 위한 나타내는 타임 라인의 주요 단계 (그림 1A) 표시 됩니다. 1 일에서 6 잘 플레이트의 여러 우물 MS2 카세트와 sgRNA/Cas9 (참조 그림 1B) 벡터 표현 페는. 2 개의 다른 subtelomere 15q 전용 가이드 RNA 순서 Cas9 nickase 표현에서 복제는 pX335 벡터, 공동 transfected MS2 카세트는 2 개의 sgRNA pX335 벡터를 생성. 접시의 한 잘 transfection 효율을 확인 하기 위해 벡터를 표현 하는 GFP와 페 수 있습니다. 2 일에 셀 trypsinized 이며 ...

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토론

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이 문서에서 우리는 subtelomere 15q 통합 MS2 시퀀스를 포함 하는 인간의 암 세포 클론을 생성 하는 방법을 제시. 이러한 클론을 사용 하 여, subtelomere 15q에서에서 복사할 MS2 태그 테라 분자 MS2 GFP 융해 단백질의 공동 식으로 형광 현미경 검사 법에 의해 검색 됩니다. 이 방법은 단일에서 표현 하는 테라의 역학을 공부 하는 연구자 수 생활에서 telomere21세포. 이 프로토콜에서 테라 MS2 클론 AGS 셀 라인, 테라, 테라 식 이기 때문에 인간의 위 암 샘플24upregulated 공부 하는 재미 있는 모델 시스템을 나타내는 선택 됩니다. 그러나, 여기에 설명 된 프로토콜은 다른 셀 라인에서 테라 MS2 클론 선택 적용할 수 있습니다. MS2 시퀀스의 통합 원리에 홍보하실 수 있습니다 subtelomere 다른 telomere 15q에 특정 MS2 카세트 및 CRISPR 전략을 사용 하 여. 여기에 ...

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공개 사항

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저자 아무 경쟁 금융 관심 선언

감사의 글

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우리는 Trento의 대학에 CIBIO의 고급 이미징 시설 및 비엔나에서 BioOptics 빛 현미경 시설 최대 F. Perutz 실험실 (MFPL)에서 직원에 게 감사. 이러한 결과 연구는 기금을 받았다 Mahlke Obermann 재단 및 연구, 기술 개발 및 실증에 대 한 유럽 연합의 7 차 프레임 워크 프로그램에서 부여 계약 없음 609431 적에 EC는 이탈리아 정부 대학 교육 및 연구 (MIUR)에서 리 타 레비 Montalcini 친교에 의해 지원 됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AGS 세포--Christian Baron(Université de Montré al)을 사용합니다.
F12K 너트 믹스 1XGIBCO21127022AGS 세포
L-글루타민용 배양 배지 코닝MT25005CI세포 배양 배지의 구성 요소
페니실린 스트렙토마이신 용액CORNING30-002-CI세포 배양 배지의 구성
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF2442세포 배양 배지의 구성
DMEM 1XGIBCO피닉스 세포
CaCl2Sigma AldrichC1016피닉스 세포 형질주입에 사용됨
HEPES시그마 알드리치H3375피닉스 세포 형질주입에 사용됨(HBS 용액),
KCl시그마, 알드리치P9333피닉스 세포 형질주입(HBS 용액)에 사용됨,
포도당,시그마, 알드리치D9434피닉스 세포 형질주입(HBS 용액)에 사용됨,
NaCl시그마, 알드리치S7653피닉스 세포 형질주입(HBS 용액) 및 레트로바이러스 침전에 사용됨
Na2HPO4Sigma AldrichS3264피닉스 세포 형질주입에 사용됨(HBS 용액),
TRYPSIN EDTA SOLUTION, 세포분할에 사용되는CORNING59430C
DPBS 1XGIBCO14190250Dulbecco의 인산염 완충 식염수
DMSOSigma AldrichD8418세포 동결 매체의 구성 요소 (80% FBB 및 20% DMSO)
G-418 디설페이트FormediumG4185선택 약물 for 
젤라틴 용액 생물 시약Sigma AldrichG139396 웰 DNA 플레이트 및 냉동 플레이트의 코팅
Tris-baseFisher BioReagents10376743게놈 DNA 추출을 위한 세포 용해 완충액의 구성 요소
EDTASigma AldrichE6758게놈 DNA 추출을 위한 세포 용해 완충액의 구성 요소
SDSSigma Aldrich71729게놈 DNA 추출을 위한 세포 용해 완충액의 구성 요소
Proteinase KThermo FisherAM2546게놈 DNA 추출을 위한 세포 용해 완충액의 구성 요소
RNAse AThermo FisherDNA추출 중 RNA 분해
12091021 AgaroseSigma AldrichA5304DNA 겔 준비
Atlas ClearSightBioatlasBH40501아가로스 젤
에탄올피셔 바이오시약BP28184DNA 침전
나트륨 아세테이트에서Sigma Aldrich711963M 농도에서 DNA 침전에 사용 pH5.2
Wizard SV 젤 및 PCR 클린업 시스템PromegaA9282네오마이신 양성 클론의 PCR 스크리닝 중 아가로스 겔에서 PCR 단편 추출
TrizolAMBION15596018RNA 추출에 사용되는 유기 용매
Dnase ITHERMO SCIENTIFIC89836RNA에서 게놈 DNA의 분해 
dNTP는RT 및 PCR 반응에 사용되는Invitrogen10297018
RT 반응에 사용되는DTTInvitrogen707265ML
디에틸 피로탄산염Sigma AldrichD5758물에서 RNAs를 비활성화하는 데 사용됨(1:1000 희석),
RibolockThermo FisherEO0381RNase 억제제
MOPSSigma AldrichM9381RNA 겔
파라포름알데히드준비 전자 현미경 과학15710변성 RNA 겔 준비(1x MOPS에 1% PFA)
위 첨자 III 역전사 효소Invitrogen18080-093역전사 반응
Pfu DNA 중합효소(재조합)Thermo ScientificEP0501PCR 반응
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROXPCR BIOSYSTEMSPB 20.14qPCR 반응
Cre-GFP 아데노바이러스https://medicine.uiowa.edu/vectorcore1174-HT제거하기 위해 TERRA-MS2 클론을 감염시키는 데 사용됩니다
PEG8000Sigma Aldrich89510레트로바이러스 입자의 침전
35µ-Dish Glass BottomIbidi81158TERRA-MS2 클론의 라이브 셀 이미징 분석에 사용됩니다.
요소 요소 용 21068028 배양 배지 , , , , 1X ,성 DNA와 RNA 샘플을 감지하는 데 사용되는 염색 시약; 혼합,,, , , , , , , 는 피닉스 세포에서 레트로바이러스 입자 생성을 촉진하는 데 사용되는 Neomycn 유전자 Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887을 은

참고문헌

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