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방법 논문

S100 단백질 및 단백질 유전자 제품 9.5에 대 한 면역 염색 직장 흡입 생 검을 이용한 히 르 츠 스프링 병의 진단

13.6K 조회수

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DOI:

10.3791/58799

⸱

2019년 4월 26일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 cal망막, S100 단백질 및 단백질 유전자 생성물 9.5에 대 한 면역 염색 직장 흡입 생 검을 하는 과정을 기술 한다. 히 르 츠 스프링의 질병에 대 한이 새로운 보조 제 진단 방법은 민감성 및 특이성 비율이 바람직하다.

초록

히 르 츠 스프링의 질병 (HD)는 유아에서 검거나을 전달 하는 무 능력 또는 어린이 장기 변 비로 임상적으로 나타나는 선 천 성 장 질환. 신경 절 세포 및 신경 비 대의 부재를 결정 하는 직장 흡입 생 검 (RSB)은 현재 헌팅턴 병 진단을 위한 가장 정확한 시험 이다. 전통적인 헤 마 톡 실린-에 오신 염색은 감도와 특이성을 결여 한다. 아 세 틸 콜린에 테라 제 염색은 복잡 한 과정으로 인해 널리 사용 될 수 없다. RSBs에서 실시 한, S100 단백질 및 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP 9.5)에 대 한 면역 염색의 새로운 프로토콜은 96.49%의 높은 민감도와 특이성 비율 (95% 신뢰 구간, 0.88) 및 100% (95% 신뢰)를 나타냅니다. 간격, 0.97) 각각. 헌팅턴 병에 영향을 받는 분절은 종종 비 점 막 조직에서 신경 대의 마커가 되는 칼 레 티 인, S100 단백질 및 PGP 9.5의 발현의 부재로 서 존재 한다. 이 프로토콜은이 새로운 진단 방법의 자세한 운영 프로세스를 설명 합니다.

서론

히 르 츠 스프링의 질병 (HD)은 말단 장관1의 다른 세그먼트에 신경 절 세포의 부족을 특징으로하는 일반적인 선 천 성 장 질환입니다. 인간 장 용 성 신 경계는 배아 신경 세포의 침 윤이 완료 될 때 형성 된다. 과정의 교란이 있고 침공이 완료 되지 못하면 신생아의 말단 장은 aganglionic2가 됩니다. 이 잠재적으로 치명적인 상태는 허쉬 스프링의 질병 이라고. 증식, 운동 성 및 창 자 성장은 성공적인 식민지 화에 대 한 세 가지 주요 구성 요소입니다.

전통적인 헤 마 톡 실린 및에 오신 (H & E) 염색은 제한 된 점 막 생 검으로 서 수술 로부터 얻어진 전체 두께 조직의 H & E 염색으로 서의 만족 스러운 결과를 달성할 수 없다. 추가적으로, 직장 흡입 조직의 아 세 틸 콜린 (AChE) 염색은 91%의 부적절 한 민감도와 동결 된 섹션3의 복잡 한 처리로 인해 이론적으로 어렵습니다. 포 르 말린 고정 및 파라핀이 포함 된 표본에서 염색 될 수 있는 신경 절 세포 들의 몇몇 그밖 면역 조직 화학 마커는 점차적으로 주류 HD 진단이 되 고 있습니다. 칼 레 티 인은 헌팅턴 병에 영향을 받는 세그먼트5의 장 용 성 및 점 막 신경 총에서 발현 되지 않는 비타민 D 의존성 칼슘 결합 단백질 이다. S100 단백질은 신경에 유래 된 세포에서 발현 되며,이는 종종 헌팅턴 병에 영향을 받는 세그먼트6의 점 막 조직에서 신경 비 대를 제시 하는 신경과 세포와 같은 신경을 섬유 이다. 단백질 유전자 생성물 9.5 (PGP 9.5) 신경 섬유와 신경 절 세포를 확실 하 게 얼룩; PGP 9.5 염색은 특히 분리 된 hypoganglionosis의 경우 염색에 대 한 보충으로 작용 합니다. S100 및 PGP 9.5 이중 염색은 거짓 음의 속도를 감소 시키고 민감도를 증가 시킬 수 있다. 전제 조건으로 서, 현재 연구는이 새로운 진단 방법의 적당 한 특이성 그리고 높은 감도를 지키기 위한 것을 작정입니다. 우리의 새로운 프로토콜은 aganglionic 소장과 비 대 신경 섬유의 차별에 대 한 세 가지 마커를 모두 사용. 318 어린이의 예비 연구는 우리의 실험실에 의해 수행 하 고 이전에 상세한 프로토콜 없이 출판7. 자세한 프로토콜 및 주의 사항은이 문서에서 설명 합니다. 출생 또는 그밖 일반적인 질병을 제외 하 고 만성 변 비를 가진 아이 들 때문에 가혹한 배변 문제로 고통 받은 신생아는 직장 흡입 생 검 (RSB)를 위한 잠재적인 후보자입니다. 당사의 새로운 프로토콜은 RSBs 뿐만 아니라 전체 두께의 생 검 또는 수술 시 편을 염색 하 여 최종 진단을 내리는 데 적합 합니다.

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프로토콜

이 의정서는 과학 기술의 화홍 대학 연합 병원의 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 직장 흡입 생 검

  1. 잘 훈련 된 소아 외과 의사 및 보호자 로부터 정보에 근거한 동의를 얻은 후 Rbi2 흡입 직장 생 검 시스템을 사용 하 여 직장 흡입 생 검을 수행 하십시오.
    1. 다음과 같은 징후가 있는 환자에서 rsb를 수행 하십시오. 유아에 있는 검거나을 통과 하는 무 능력 또는 아이 들에 있는 변 비 없이 장기 팽만 감; 배변을 완료 하기 위해 파라핀 오일이 필요한 장기 변 비를 가진 아이 들; 장 폐색을 겪고 있는 아이 들에 있는 불명 한 이유를 가진 장의 방해 또는 장 천공.
      참고: RSB에 대 한 금기 사항은 다음과 같습니다. 심한 증상이 있거나, 신체적 상태가 좋지 않거나, RSB에 내성을 갖지 못하는 어린이; 급성 단계 장 염을 가진 아이 들; 완전 한 치유 없이 장 문 합을 겪고 있는 어린이.
  2. 창 자 준비 36 h로 정상적인 생리 식 염 수 유지 관장을 수행 하 고 점 막의 대변을 느슨하게 하 고 과도 한 부 종을 피하는 절차 전에. 어린이가 심한 변 비를 하는 경우 황산 마그네슘 용액을 첨가 하십시오. 신생아에 게 비타민 K (1mg/kg)를 투여 하십시오.
    참고: 수술 전 혈액 검사를 수행 하거나 항생제를 투여 하지 마십시오, 그들은 필요 하지 않습니다.
  3. 환자를 쇄 석 절제술 위치에 둡니다. 파라핀 오일을 사용 하 여 튜브 표면을 코팅 합니다. 뒤 또는 측면 벽을 향한 측면 구멍이 있는 직장에 둔 부 관 4-7 cm을 삽입 하십시오.
  4. 튜브에 부드러운 압력을가 하 여 직장 벽에 대 한 측면 구멍의 적절 한 접착을 촉진 합니다. 트리거를 누르고 즉시 도구를 철회 하십시오.
  5. 생 검 기기를 사용 하 여 3cm의 지름과 치과 라인에서 6cm, 그리고 전후 면의 후방에 있는 4 개의 흡입 바이오를 얻습니다. 바늘을 사용 하 여 염 수로 적신 거 즈에 표본을 놓습니다.
  6. 수술 후 2 시간까지 환자를 관찰 하 여 직장 출혈을 배제 하십시오. RSB 이후 처음 24 시간 내에 더 많은 직장 및 항문 조작을 피하십시오.

2. RSB 섹션의 준비

  1. 직장 흡입 생 검을 6 시간 동안 4% 파라 포름알데히드에 넣고 조직을 고정 시킵니다. 고정 볼륨은 조직 부피 보다 5 배 이상 사용 하십시오.
  2. 11 시간 동안 병리학 적 조직 탈수 기를 사용 하 여 조직을 탈수. 전체 프로그래밍 된 프로세스는 다음 5 단계로 구성 됩니다.
    1. 포 름 알 데히드에 티슈를 넣고 1 시간 동안 고정 합니다.
    2. 4 시간 동안 75% 에탄올에 조직을 놓습니다.
    3. 티슈를 절대 에탄올에 넣습니다 (각각 1 시간, 2 개의 변화).
    4. 티슈를 절대 에탄올 (각각 30 분)에 놓습니다.
    5. 조직을 자일 렌 (각각 1 시간)에 놓습니다.
  3. 파라핀 왁 스 (58-60 ° c)에 조직을 배치 하 고 (각각 1 시간 마다 3 개의 변화). RSB 조직을 파라핀 블록에 포함 시킵니다.
  4. 조직이 완전 한 단면 평면으로 완전히 노출 될 때까지 마이크로 톰을 사용 하 여 파라핀 블록을 자릅니다.
  5. 마이크로 톰을 사용 하 여 블록을 0.4 μ m 섹션으로 자릅니다.
  6. 섹션이 평평한 판으로 퍼질 수 있도록 몇 초간 45-50 ° c의 물에 섹션을 배치 합니다.
  7. 파라핀 섹션을 슬라이드에 옮겨 놓습니다.
  8. 3-5 시간 동안 60 ° c 오븐에 슬라이드를 구워. 항 원의 손실로 이어질 수 있는 너무 오래 베이킹 하지 마십시오.
  9. Deparaffinized 슬라이드를 자일 렌에 넣습니다 (각각 15 분).
  10. 슬라이드를 절대 에탄올 95%, 80% 및 75% 에탄올에 각각 5 분간 수화물 합니다. 그 다음, 역삼 투 (RO) 정제 수를 다른 5 분 동안 헹 궈 냅니다.

3. 항 원 검색

  1. 4 mL의 EDTA 항 원 회수 완충 액을 RO 정제 수 200 mL와 혼합 하 여 추출 물에 대 한 작업 희석을 수행 합니다. S100 및 PGP 9.5 회수에 대 한 작업 희석을 수행 합니다. 구 연산 나트륨 시트 레이트 완충 액 (100 배) 1 mL을 RO 정제 수 99 mL와 혼합 하 여 추출 합니다.
    참고: 칼 레 티 너는 EDTA 회수 용액에 의해 우선적으로 검색 될 수 있다. 그러나 구 연산 나트륨 시트 레이트 완충 제는 S100 및 PGP 9.5의 검색에 더 적합 하다.
  2. 슬라이드를 coplin 염색 항아리에 넣습니다. 항아리를 검색 용액으로 채우고 예 열 된 끓는 수조에 넣습니다. 20 분 동안 끓인 후, 항아리를 수조에서 꺼내 실 온으로 식혀 주세요. 냉각 과정은 약 10 분 정도 걸립니다. 슬라이드를 제거 하 고 인산 완충 식 염 수 (PBS)로 부드럽게 헹 궈 냅니다.
  3. 마커 펜으로 원을 그려 조직 주위에 다음 절차에 대 한 젖은 상자를 준비 합니다.

4. 차단

  1. RO 정제 수 27ml을 사용 하 여 30% H2o2의 3 ml을 혼합 하 여 작업 희석을 수행 합니다.
  2. 3%의 2 또는 3 방울을 추가하 여 조직에 적가를 차단 합니다. H2O2 솔루션을 즉시 추가 하 여 솔루션이 원에서 오버플로되지 않도록 합니다. 20 분 동안 37 ° c 인큐베이터에서 과산화 산화의 차단을 수행 합니다.
  3. PBS로 슬라이드를 부드럽게 헹 구 십시오 (세 개의 세척, 각각 5 분).
  4. 5% 소 혈 청 알 부 민으로 37 ° c에서 20 분 동안 슬라이드를 차단 하 고, bsa 분말을 30Ml의 RO 정제 수와 함께 1.5 g을 혼합 하 여 제조 하였다.
    참고: 3% H2o로 차단하면 비 특이성 염색의 95%를 방지 할 수 있으며 5% BSA로 차단 하면 비 특이성 염색의 다른 5%를 예방할 수 있습니다. 두 가지 방법을 결합 하 여 신뢰할 수 있는 결과를 얻습니다.

5. 항 원 항 체 반응

  1. 5% BSA를 제거 하 고 1 차 항 체 (cal망막, S100 또는 PGP 9.5)의 50 μ l를 슬라이드에 추가 합니다. 4°c에서 밤새 배양 한다.
  2. PBS로 슬라이드를 세척 합니다 (각각 3 분).
  3. 중합체 증강 제 (시 약 A; 물질 표참조)의 50 μ l를 첨가 하 고 37 ° c 인큐베이터에서 20 분간 배양 한다. 그런 다음 PBS로 슬라이드를 세척 하십시오 (각각 3 분).
  4. 2 차 항 체 B (염소 반 토끼/쥐 IgG 이차 항 체)의 50 μ l를 첨가 하 여 37 ° c 인큐베이터에서 30 분간 배양 한다. PBS로 섹션을 세척 합니다 (각각 5 분).

6.3, 3 산물이 및 헤 마 톡 실린 염색

  1. RO 정제 수 850 μ l를 1.5 mL 튜브에 첨가 하 고 염색 시 약 ( 재료 표참조)을 순서 a, B 및 50 C에 추가 하 여 총 1ml의 3 산물이 (DAB) 작업 용액을 얻었다. 침전 물이 있는 경우 여과 후 용액을 사용 하십시오.
  2. 티슈 섹션에 DAB 작업 용액 한 방울을 추가 하 고 얼룩을 3-10 분. 갈색 얼룩이 검출 될 때까지 실 온에서 DAB에서 슬라이드를 배양 합니다. 명시 야 현미경을 사용 하 여 주의 깊게 모니터링 하십시오. DAB 작업 용액을 빛에서 멀리 하십시오. 그런 다음 5 분 동안 PBS로 슬라이드를 씻으십시오.
  3. 약 1 분 동안 핵을 반대 염색 하는 헤 마 톡 실린을 추가 합니다. 그런 다음, coplin 항아리를 잡고 여분의 염료가 제거 될 때까지 약 30-40 초 동안 물로 씻 습니다. 티슈 부분이 손상 되지 않도록 주의 하십시오.
  4. 25-30 s에 대 한 PBS를 포함 하는 coplin 항아리에 RSB 슬라이드를 담가. 그런 다음 10 초 동안 1% 염 산 에탄올로 분화 하십시오. 1 분 동안 PBS로 슬라이드를 씻으십시오.
  5. 수 화 반대 순서로 슬라이드를 탈수: 75%, 80%, 95% 및 절대 에탄올 (각각 5 분).
  6. 슬라이드를 자일 렌에 노출 시킵니다 (각각 5 분).
  7. 초소형 장착을 사용 하 여 커버 슬립을 장착 합니다. 현미경을 사용 하 여 슬라이드를 시각화 하기 전에 건조 할 수 있습니다.

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결과

총, 318 환자는 우리의 연구에 등록 했다. 모든 환자 들은 RSB를 시행 하 고, 조직은 칼 레 티 인, S100 및 PGP 9.5에 대해 염색 되었다. 우리의 새로운 프로토콜을 기반으로 하는 진단은 97 케이스, 213의 경우 hd가 아닌 경우 8 건에서 hd로 의심 되는 hd 였습니다. 132 수술 환자 중, 99 환자는 수술 후 전체 두께 표본의 면역 염색에 의해 헌팅턴 병으로 진단 되었다. S100 및 PGP 9.5 염색은 99 환자의 92% 및 93%가 각각 신경 트렁크를 비 대 했다는 것을 보여주었다. 다른 83의 186 환자는 전체 두께의 생 검을 시행 하 고 신경 절 세포를 보여주었습니다. 총 103 명의 환자가 보수적 치료에 의해 임상적으로 치료 되었고, HD는 배제 되었다. HD가 의심 되는 8 명의 환자 중 3 명의 환자가 짧은 세그먼트 HD로 분류 되 고 다른 5 명의 환자는 비 HD로 분류 되었습니다.

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토론

여기서 우리는 HD의 진단을 위해 RBS 부분을 염색 하기 위해 세 가지 다른 면역 조직 화학 항 체를 사용 하는 절차를 설명 했습니다. 우리의 진단 프로토콜의 민감도는 96.49% (95% ci, 0.88)이 고 특이성은 100 95% 0.97 이었다.

프로토콜의 가장 중요 한 단계는 RSB 및 항 원 항 체 반응입니다. 생 검의 크기는 염색의 정확도를 결정 합니다. 작은 생 검 정확한 진단을 만들기 위해 충분 한 조직을 제공 하지 않습니다., 큰 생 검 출혈의 높은 위험에 이르게 하는 동안. 경험의 문제로, 직경이 2mm의 생 검은 최적의 크기입니다. 항 원 항 체 반응의 경우 항 체의 적절 한 보존은 무시할 수 없습니다. 단계에 의해 프로토콜 단계를 따라 부드럽게 작업이 필요 합니다. 역삼 투-정제 수는 관찰을 위한 명확한 필드를 산출 하 고 병리학 자가 정확한 진단을 만드는 것을 더 쉽게 만드는 모든 단계에서 추천 됩니다.

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 촬영 실험실을 제공 하는 그의 큰 도움에 대 한 Weibing 당나라 감사 합니다. 이 문서는 공공 복지 연구에 의해 지원 되 고, 특별 기금은 중국의 국민 건강 및 가족 계획에서 받았다 (보조금 201402007).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
calretinin 항체MXB BiotechnologiesMAB-0716 170416405c항체: 1차 항체
S-100 항체MXB BiotechnologiesKit-0007항체: 1차 항체
PGP9.5 항체Shanghai long island antibody Co. LtdR-0457-03항체: 1차 항체
인핸서 시약MXB BiotechnologiesKIT-9902-A 170416405a항체: 2차 항체 A
염소 항토끼/마우스 IgG 2차 항체MXB BiotechnologiesKIT-9902-B항체: 2차 항체 B
DAB 염색 키트(시약 A, B 및 C 포함)MXB BiotechnologiesDAB-0031염색 키트
열 인큐베이터Shanghai yiheng instrument Co. LtdDHP-9082기기
Rbi2 흡입 직장 생검 시스템Aus Systems Pty Ltd, South Australia, AustraliaCP1200 HP1000 SS1000기기
마이크로톰Leica LeicaRM2016기기
구연산 나트륨 구연산염 완충액(100X)MXB BiotechnologiesMVS-0101항원 회수 완충액
병리학적 조직 탈수기wuhan junjie electronic Co. LtdJT-12F기기

참고문헌

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