무기 Polyphosphate 박테리아에 대 한 시 금

요약

그람 양성, 그람 음성, mycobacterial 종 등 다양 한 박테리아에 무기 polyphosphate의 급속 한 정량화를 위한 간단한 방법을 설명 합니다.

초록

무기 polyphosphate (폴립) 셀 생활의 모든 도메인에 있는 생물학 고분자 이며 독성 및 많은 박테리아에 스트레스 반응. 많은 노동 집약 하거나 구분 하지 않습니다, 그들의 유용성을 제한 하는 생물 자료에 측량 용 종에 대 한 방법의 다양 한이 있다. 선물이 여기 박테리아, 부 량 폴립에 대 한 효율적인된 방안을 여러 샘플, 폴립 전용 exopolyphosphatase ScPPX와 폴립의 소화 및 감지의 신속한 처리를 위해 최적화 된 실리 카 막 열 추출 사용 하는 결과 민감한 ascorbic 산 기반 색도계 분석 결과 함께 무료 인산 염. 이 절차 간단, 저렴, 이며 다양 한 세균성 종에 신뢰할 수 있는 폴립 정량화를 수 있습니다. 그램 음성 박테리아 (대장균), 그람 양성 젖 산 박테리아 (유산 균 reuteri), 및 mycobacterial 종 (진 균 smegmatis)에서 대표적인 폴립 정량화 선물이. 우리는 또한 어떤은 현재 상업적으로 사용할 수 밀리 그램 양의 ScPPX, 니켈 친 화력 정화에 대 한 간단한 프로토콜 포함.

서론

무기 polyphosphate (폴립)은 인생^1,2,3의 모든 도메인에 있는 phosphoanhydride 연결 인산 염 단위의 선형 biopolymer 이다. 다양 한 박테리아에서 폴립 스트레스 반응, 운동 성, biofilm 형성, 세포 주기 제어, 항생제 내성, 및 독성^{4,,56,7,8이 필수적입니다. ,9,,1011}. 박테리아 물질 대사 폴립의 연구는 따라서 질병의 원인이 다양 한 환경에서 번 창 하는 박테리아의 기능에 대 한 근본적인 통찰력을 얻을 수가 있다. 그러나 많은 경우에,, 세균성 세포 측정 폴립에 대 한 사용할 수 있는 방법 이러한 연구에 제한 요인이 있습니다.

현재 생물학 물자에서 폴립 수준을 측정 하는 데 사용 하는 여러 방법이 있다. 이러한 메서드는 일반적으로 두 가지 단계를 포함: 폴립을 추출 하 고는 폴립 측정 그 추출 물에 존재. Bru와 동료¹², DNA 및 RNA 페 놀을 사용 하 여 추출 폴립 효 모 Saccharomyces cerevisiae 에 대 한 개발 현재 골드 표준 방법 및 클로 프롬, 에탄올 강수량, 치료 뒤 deoxyribonuclease (DNase) 및 ribonuclease (RNase), 그리고는 S. cerevisiae 폴립 저하 효소 exopolyphosphatase (ScPPX)¹³ 를 사용 하 여 계량 다음은 자유로운 인산 염, 결과 순화 된 폴립의 소화는 말라 카이트 그린 기반 색도계 분석 결과입니다. 이 절차는 매우 양적 하지만 단일 실험에서 처리할 수 있는 세균성 샘플에 대 한 최적화 되지 않은 샘플의 수를 제한 하는 노동 집약. 다른 다양 한 세포와 실리 카 비즈 (이 하 "glassmilk") 또는 실리 카 막 열^{6,14,15,,1617를 사용 하 여 조직에서에서 폴립을 추출 보고 있다 18}. 이 방법을 할 효율적으로 추출 하지 짧은 체인 폴립 (60 인산 염 단위)^12,,1415, 비록이 일반적으로 생각 되 고 주로 합성 박테리아에 대 한 더 적은 관심 긴 체인 용 종³. 강한 산^19,20 를 사용 하 여 폴립 추출의 이전 방법 더 이상 널리 사용 폴립¹²산 성 조건 안정 되어 있기 때문.

또한 측정 폴립에 대 한 보고 방법의 다양 한이 있다. 가장 일반적인 가운데 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 더 일반적으로 DNA를 얼룩 사용 형광 성 염료 이다. DAPI 폴립 단지 DAPI DNA 단지^21,22, 보다 다른 형광 여기 및 방출 맥시 마 하지만 상당한 간섭 RNA, 뉴클레오티드, 이노 시 톨 등 다른 세포질 분 대에서 인산 염^12,15,,1623, 특이성 및이 메서드를 사용 하 여 만든 폴립 측정의 감도 감소. 폴립과 아데노신 diphosphate (ADP)를 아데노신 3 인산 염 (ATP) 사용 하 여 순화 된 대장균 으로 변환할 수 또는 폴립 키 (ppk 모델)와 luciferase^{14,17 사용 하 여 계량 결과 ATP ,18}. 이 매우 적은 양의 폴립, 탐지를 허용 하지만 두 효소 반응 단계와 소와 매우 순수한 ADP, 비싼 시 약입니다. ScPPX로 특별히 다이제스트 폴립 무료 인산 염^6,12,13,24, 간단 방법, 하지만 ScPPX을 사용 하 여 감지 될 수 있는 DNA와 RNA¹², 저해 포함 하는 폴립의 필요로 DNase 및 RNase 처리를 추출합니다. Ppk 모델도 ScPPX 상업적으로 사용할 수 있으며 ppk 권총 정화는 상대적으로 복잡 한^25,26.

있으 나 세포 lysates 또는 추출에 폴립 DAPI 부정적인 얼룩^27,,2829,30, 체인 길이의 평가 허용지 않습니다 하지만 하는 방법에 의해 polyacrylamide 젤에도 구상 될 수 있다 낮은 처리량 그리고 저조한 양적.

우리는 이제 다양 한 세균성 종의 수준 폴립의 급속 한 정량화를 허용 하는 빠르고, 저렴 한, 중간 처리량 폴립 분석 결과 보고 합니다. 이 메서드는 셀룰러 가수분해, 여러 샘플의 신속한 처리를 위해 최적화 된 실리 카 막 열 추출 다음 비활성화를 4m guanidine isothiocyanate (GITC)¹⁴ 에서 95 ° C에서 세균성 세포를 lysing 여 시작 합니다. 결과 폴립 포함 된 추출 다음 DNase 및 RNase 처리를 위한 필요를 제거 하는 ScPPX의 큰 과잉을 가진 소화 된다. 우리는 ScPPX 밀리 그램 양의 간단 니켈 친 화력 정화에 대 한 프로토콜을 포함합니다. 마지막으로, 무료 인산 폴립 파생 된 간단 하 고, 민감한, ascorbic 산 기반 색도계 분석 결과²⁴ 정량 이며 총 세포질 단백질에 정규화. 이 메서드 세균성 세포에 폴립의 측정을 간소화 하 고 우리 그람 음성 세균, 그람 양성 세균 및 mycobacteria의 대표 종으로 그것의 사용을 보여 줍니다.

프로토콜

1. 정화 효 모 Exopolyphosphatase (ScPPX)

1. 대장균 단백질 overexpression 스트레인 플라스 미드 pScPPX2⁶ BL21(DE3)³¹ electroporation³² 또는³³화학 변환 의해 변환.
2. Lysogeny 국물 (파운드) 100 µ g mL^-1 암 피 실린 포함 하는 pScPPX2 BL21(DE3)의 단일 식민지와 2 L unbaffled 플라스 크에 포함 된의 1 L를 접종 하 고 하룻밤 없이 떨고, 600에서 흡 광도를 37 ° C에서 품 어 nm (₆₀₀)의 약 0.3, 한 분 광 광도 계에서 측정 된
3. (180 rpm)를 동요 하는 문화를 시작 하 고 어느 시간 동안 셀 A₆₀₀ 0.4-의 성장 37 ° C에서 30 분 동안 품 어 0.5.
4. 1mm 및는 추가 100 µ g mL^-1 암 피 실린의 최종 농도에 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 추가한 다음 180 rpm에서 떨고와 37 ℃에서 4 h에 대 한 품 어.
   참고:이 overexpression 프로토콜 녹는 ScPPX의 큰 금액을 생성합니다. 그러나, ScPPX overexpression은 아주 용 서, 그리고 다양 한 다른 일반적인 단백질 overexpression 프로토콜 성공적으로 ScPPX 정화에 사용 되었습니다.
5. 1 L 원심 분리기 병 셀 전송 및 4 ° c.에 5000 x g에서 20 분 동안 centrifuging 여 수확 상쾌한을 제거 하 고 셀 펠 렛 50 mL 원뿔 튜브에 전송.
   참고: 셀 펠 릿에 저장 될 수 무기한-80 ° c.
6. 얼음에 펠 릿을 녹여 다음 50 mm HEPES 9 mL, 0.5 M NaCl 및 5mm 이미 (pH 8) 약 10 ml 전체 볼륨에 대 한 resuspend.
7. (최종 농도) 1 mg mL^-1 lysozyme, 2 mM MgCl₂및 RNA 및 DNA 저하 endonuclease의 50 단위 mL^-1 추가 ( 재료의 표참조)와 얼음에 30 분 동안 품 어.
   참고: ScPPX 묶는 핵 산 (데이터 표시 되지 않음), 그래서 nuclease 치료 정화 동안 필수적 이다.
8. sonicator는 microtip 사용 ( 재료의 표참조), 50% 전력, 펄스 5에서 얼음에 쥡니다의 2 주기에 의해 세포를 lyse s 주기 사이 2 분 나머지와 함께, 및 5 s.
   참고: 적절 한 청력 보호 쥡니다 동안 사용 합니다. 마찬가지로 overexpression의 경우, 세포 세포의 용 해 방법의 다양 한 ScPPX 정화에 대 한 사용할 수 있습니다.
9. 20000 x g 4 ° c.에 20 분에 대 한 lysate centrifuging 여 불용 성 파편을 제거 0.8 µ m 기 공 크기 셀 루 로스 아세테이트 주사기 필터를 통해 결과 상쾌한 (약 10ml)를 필터링 합니다.
10. 킬레이트 화 열 니켈 충전 5 mL에 lysate 로드 ( 재료의 표참조) 연동 펌프 또는 큰 주사기를 사용 하 여.
11. 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 5mm 이미 (pH 8)의 열을 씻어.
12. 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 20mm 이미 (pH 8)의 열을 씻어.
13. ScPPX 50 mm HEPES, 0.5 M NaCl, 그리고 0.5 M 이미 (pH 8) 수집 15 1 mL 분수 elute. 테스트 콘텐츠 Bradford 단백질 분석 결과³⁴ 와 단백질에 대 한 이러한 차입 분수 ( 재료의 표참조) SDS 페이지 젤³⁵ 는 분수 포함 순화 ScPPX 확인을 실행 하 고 (분자량 = 45 kDa).
14. 순수한 ScPPX를 포함 하는 분수를 풀 고 50 mm HEPES 약 2 mg mL^-1 을 0.5 M NaCl 풀링된 단백질의 농도 조정 합니다. 높은 단백질 농도 다음 단계에서 침전 수 있습니다.
15. 투 석 정화 ScPPX 저장소 버퍼 (20 mM Tris HCl [pH 7.5], 50 m m KCl, 10% [v] 글리세롤)으로 교환 합니다. 12000-14000 다 분자량 컷오프 투 석 막 튜브 ( 재료의 표참조)의 봉인된 길이에 풀링된 ScPPX 분수를 놓고 연속 교 반 4 ° C에서 최소한 4 h. 신선한와 함께이 단계를 반복 하는 동안 저장소 버퍼의 1 L에 일시 중단 3 버퍼 변경의 총 저장소 버퍼입니다.
16. 원심 분리기 튜브 또는 튜브와 모든 불용 성 집계 제거 하 4 ° C에서 20000 x g에서 20 분 동안 원심 분리기를 순화, dialyzed 단백질을 전송 합니다. 조심 스럽게 깨끗 한 15 mL 원뿔 튜브는 상쾌한 전송.
17. 1 mg mL^-1 저장 버퍼를 순화 ScPPX의 농도 조정, 0.1% (w/v) 추가 protease 무료 소 혈 청 알 부 민 (BSA; 최종 농도), 및 4 ° c.에서 최대 6 개월까지 저장
    참고: ScPPX 때 냉동된¹³에 그것의 활동의 90% 이상 잃는다.

2. Polyphosphate 추출에 대 한 샘플 채취

1. 폴립 콘텐츠 결정에 대 한 관심의 조건 하에서 박테리아 성장. 이 프로토콜에 대 한 유산 균 reuteri³⁶ 37 ° C에서 하룻밤 malic 효소 유도 (메이) 중간³⁷ 시스테인 (메이-C) 없이 떨고 없이 성장 합니다.
2. 1.5 mL microcentrifuge 튜브 총 세포질 단백질의 50-100 µ g를 원심 분리 하 여 충분 한 세포를 수확 (3 단계 참조). 대장균이 0.2-A₆₀₀ 에서 로그 단계 문화 1 mL는 0.4. L. reuteri, 하룻밤 문화의 1 mL입니다. 관심의 다른 종에 대 한 필요에 따라 조정 합니다.
3. 셀 펠 릿에서는 상쾌한을 완전히 제거 합니다.
4. GITC 세포의 용 해 버퍼 (4m guanidine isothiocyanate, 50 mM Tris HCl, pH 7)의 250 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend와 10 분-80 ° c.에 게 lysates 95 ° C에 외피에 의해 lyse
   참고: 수 세포의 용 해 시간, 일치 때문에 고온에서 장시간된 보육 가수분해³⁸에 의해 폴립의 저하에서 될 수 있습니다. Lysates-80 ° c.에 무기한으로 저장 될 수 있다
   주의: Guanidine isothiocyanate chaotropic 소금 및 장갑 처리와 있어야 유해 폐기물로 폐기 합니다.

3. 세포 Lysates의 단백질 함량을 측정

1. BSA 기준 0, 0.1, 0.2, 그리고 GITC 세포의 용 해 버퍼에 BSA의 0.4 mg mL^-1 을 준비 합니다.
   참고: GITC 색상 개발 Bradford 분석 실험의 영향 때문에 GITC, BSA 기준 수 있도록 중요 하다. BSA 기준-20 ° c.에 무기한으로 저장 될 수 있다
2. Aliquot 5 µ L, 잘 혼합 해 동 세포 lysates의와 명확한 96 잘 접시에 우물을 BSA 기준의.
3. 각 잘을 Bradford 시 약³⁴ 의 195 µ L을 추가 하 고 595에서 흡 광도 측정 플레이트 리더에서 nm (₅₉₅) ( 재료의 표참조).
4. 수식 y를 사용 하 여 BSA 표준 곡선을 비교 하 여 각 우물에서 단백질의 양을 계산 = mx + b, 어디 y는₅₉₅x는 BSA의 µ g, m은 표준 곡선의 기울기 이며, b는 표준 곡선의 y 절편. 0.05 각 샘플에 있는 단백질의 총 mg를 결정 하 여 결과 값을 곱하면 됩니다.

4. 추출 Polyphosphate

1. 각 GITC lysed 샘플 및 혼합 소용돌이를 95% 에탄올의 250 µ L를 추가 합니다.
2. 실리 카 막 스핀 열 및 30에 대 한 원심 분리기에 그 혼합 적용 16,100 x g에서 s.
3. 흐름을 통해 삭제 후 추가 750 µ L 5 mM Tris HCl의 (pH 7.5), 50 m m NaCl, 5 mM EDTA, 50% 에탄올과 30 대 분리기 16,100 x g에서 s.
4. 흐름을 통해 및 16,100 x g에서 2 분 동안 원심 분리기를 삭제 합니다.
5. 깨끗 한 1.5 mL microfuge 관에서 열을 놓고 50 mM Tris HCl (pH 8)의 150 µ L를 추가 합니다.
6. 5 분 동안 실내 온도에 incubate 다음 8000 x g에서 2 분 동안 centrifuging 여 폴립을 elute.
   참고: 원하는 경우는 있다 저장할 수 있습니다-20 ° C에 적어도 1 주 동안.

5. 소화 Polyphosphate

1. 0, 5, 50, 또는 50 mm Tris HCl (pH 8) 200 µ M 칼륨 인산 염을 포함 하는 표준 준비.
   참고: 칼륨 인산 염 표준 실 온에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.
2. Aliquot 100 µ L 각 인산 염 표준의 명확한 96 잘 접시의 별도 우물으로 폴립 샘플을 추출.
3. (샘플) 당 포함 하는 마스터 믹스 준비: 5 x ScPPX 반응 버퍼 (100 mM Tris HCl, 25 m m MgCl₂, 250 m m 염화 아세테이트, pH 7.5)¹³30 µ L, H₂O, 19 µ L 및 순화 된 ScPPX (1 mg mL^-1)의 1 µ L.
4. 96 잘 접시의 각 음을 마스터 믹스의 50 µ L를 추가 합니다. 37 ° c.에 15 분 동안 품 어
   참고: 원하는 경우, 소화 용 종 샘플 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 무기한.

6. 검색 무료 인산²⁴

1. 그래서 4 N H₂의 150 mL을 추가 물 200 mL에 안티모니 칼륨 주석산의 0.185 g을 용 해 하 여 탐지 솔루션 기본 준비₄, 암모늄 heptamolybdate의 1.49 g 추가. 해산 하 고 그 후 456 mL의 최종 볼륨을가지고 저 어. 최대 1 개월 4 ° C에서 빛 으로부터 보호 솔루션 입자를 제거 하 고 저장을 필터링 합니다.
2. 1 M 의약품의 재고 솔루션을 준비 합니다. 상점 최대 1 개월 4 ° C에서 빛 으로부터 보호.
3. 매일 1 M 의약품의 0.88 mL와 탐지 솔루션 베이스의 9.12 mL를 혼합 하 여 탐지 솔루션의 신선한 작업 재고를 준비 합니다. 사용 하기 전에 실내 온도에 서 검색 솔루션을 수 있습니다.
4. 각 샘플을 표준 96 잘 접시에 탐지 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 색상 개발을 허용 하도록 약 2 분 동안 실 온에서 품 어.
5. 882에서 흡 광도 측정 플레이트 리더 nm 칼륨 인산 염 표준 곡선을 비교 하 여 각 샘플의 인산 염 농도 계산 하 고.
   주의: 탐지 솔루션 독성 염 및 강한 산을 포함 한다. 장갑을 착용 하 고 독성 폐기물 초과 솔루션 취급.

7. 계산 셀룰러 Polyphosphate 콘텐츠

1. 각 전체 셀 다음 공식에 따라 lysate에 폴립 파생 인산 nanomoles 6.5 단계에서 결정 하는 인산 염 농도 변환:
   nmol 폴립 = 1.5 x (µ M 인산 / 10)
   참고: 6 단계에서 표준 곡선 기반 메서드는 각 100 µ L 폴립 샘플 단계 5.2에서에서 aliquoted (µ M)에서 인산 염의 농도를 결정합니다. 변환 하려면이 농도 nmol의 수, 100 µ L 나눈 10 L에 볼륨을 주고⁶ 농도 (µmol L^-1)을 곱한 다음 곱한 1000 (nmol에는 µmol 수). 이 10에 나누어 농도를 감소 시킨다. 총 추출 볼륨 4 단계에서 준비 150 µ L 이므로 1.5 전체 추출 물에 있는 인산 염의 nmol 계산 하 여 결과 값을 번 식 해야 합니다.
2. 3.4 단계에서 결정 하는 각 샘플에 mg 총 단백질 nmol 폴립 나누어 총 세포질 단백질을 세포 폴립 콘텐츠를 정상화. 폴립 수준의 개별 폴립 파생 무료 인산 염의 농도 관점에서 표현 됩니다.
   참고: 경우에 따라 샘플에 폴립 파생 인산의 양을 인산 염 표준 곡선 (단계 6.5)의 선형 범위 밖에 빠지다 수 있습니다. 폴립의 수준이 매우 높은 경우에, 단계 4.6에서에서 초과 폴립 포함 eluate 희석된 1시 10분 또는 1: 100, 필요에 따라 수 하 고 5-7 단계에 설명 된 대로 다시 측정.

결과

프로토콜의 주요 단계는 diagrammed 그림 1에서 단순화 된 형태에서.

그램 음성 박테리아, 야생-타입 E. 콜라 이 프로토콜의 사용을 MG1655³⁹ 파운드에서 37 ° C (200 rpm) 떨고 풍부한 매체에 중간 로그 단계로 성장, 다음 씻어 서 되었고에 추가 2 h에 대 한 인 큐베이 팅 morpholinopropanesulfonate 버퍼 (MOPS) 최소한의 중간⁴⁰ 4 g L^-1 포도 당 및 0.1 m m K₂HPO₄, 폴립^14,29

토론

여기에 설명 된 프로토콜 간소화 되 고 완전히 처리 약 1.5 h 복용 24 샘플의 전형적인 세트와 함께 다양 한 박테리아에서 폴립 레벨의 정량화를 가속 한다. 이 샘플의 신속한 심사 및 돌연변이 라이브러리의 분석을 허용 하 고 운동 실험 시간이 지남에 폴립의 축적을 측정을 단순화 합니다. 우리는 프로토콜 대표자 3 다른 문의에 효과적으로 작동 증명: proteobacteria firmicutes, 그리고 actinobacteria, 그들의 탄력에 대 한 악명을 lyse 세포 벽⁴⁹어렵다.

ScPPX와 소화에 의해 폴립의 탐지 더 구체적이 고 형광 탐지 DAPI와 함께 보다 더 민감한 이며 저렴 하 고 ppk 모델을 사용 하 여 ATP 폴립의 전환 보다 더 기술적으로 간단. ScPPX DNA와 RNA¹²에 의해 저해입니다, 하지만 우리는 6000 이상 nmol 폴립 mg^-1 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
E. coli BL21(DE3)	Millipore Sigma	69450
플라스미드 pScPPX2	Addgene	112877	학술 및 기타 비영리 기관에서 사용 가능
LB broth	Fisher Scientific	BP1427-2	E. coli 성장 배지
암피실린	Fisher Scientific	BP176025
이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)	골드 생명공학	I2481C
HEPES 버퍼	골드 생명공학	H-400-1
수산화칼륨(KOH)	HEPES 완충 용액의 pH 조정을 위한	Fisher Scientific	P250500
염화나트륨(NaCl)	Fisher Scientific	S27110
이미다졸	Fisher Scientific	O3196500
라이소자임	Fisher Scientific	AAJ6070106
염화마그네슘(MgCl2)	Fisher Scientific	BP214-500
Pierce Universal Nuclease	Fisher Scientific	PI88700	Benzonase(Sigma-Aldrich cat. # E1014)는 허용 가능한 대체품입니다
120 음파 분석기	Fisher Scientific	FB-120	다른 세포 용해 방법(예: French Press)도 효과적일 수 있으며
5mL HiTrap 킬레이트 HP 컬럼	GE Life Sciences	17040901	모든 니켈 친화성 크로마토그래피 컬럼 또는 수지로 치환될 수 있으며,
	를 충전하기 위해	니켈(II) 황산염 육수화물	Fisher Scientific
. m 기공 크기 셀룰로오스 아세테이트 주사기 필터	Fisher Scientific	09-302-168
Bradford 시약	Bio-Rad	5000205
Tris 버퍼	Fisher Scientific	BP1525
스펙트럼  Spectra/Por 4 RC 투석막 튜빙 12,000 - 14,000 Dalton MWCO	Fisher Scientific	08-667B	MWCO < 30,000 Da의 기타 투석막도 작동해야 합니다
.	Fisher Scientific	A144-212	트리스 완충 용액의 pH 조절을 위해
염화칼륨(KCl)	Fisher Scientific	P217500
글리세롤	Fisher Scientific	BP2294
10x MOPS 매체 혼합물	Teknova	M2101	E. 대장균 성장 매체
포도당	Fisher Scientific	D161
일염기성 인산칼륨(KH2PO4)	Fisher Scientific	BP362-500
이염기성 인산칼륨(K2HPO4)	Fisher Scientific	BP363-500
탈수 효모 추출물	Fisher Scientific	DF0886-17-0
트립톤	Fisher Scientific	BP1421-500
황산마그네슘 헵타하이드레이트	Fisher Scientific	M63-50
황산망간 일수화물	Fisher Scientific	M113-500
구아니딘 이소티오시아네이	Fisher Scientific	BP221-250
소 혈청 알부민(프로테아제 없음)	Fisher Scientific	BP9703100
투명 평면 바닥 96웰 플레이트	Sigma-Aldrich	M0812-100EA	투명 96웰 플레이트가 작동합니다
Tecan M1000 Infinite 플레이트 리더	Tecan, Inc.	해당 사항 없음	595 및 882 nm에서 흡광도를 측정할 수 있는 모든 플레이트 리더는
에탄올	Fisher Scientific	04-355-451
실리카 멤브레인 스핀 컬럼	Epoch Life Science	1910-050/250
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	Fisher Scientific	BP120500
1.5mL 마이크로퓨지 튜브	Fisher Scientific	NC9580154
아세트산 암모늄	Fisher Scientific	A637-500
안티몬 주석산 칼	Fisher Scientific	AAA1088922
4 N 황산 (H2SO4)	Fisher Scientific	SA818-500
암모늄 헵타몰리브덴산	Fisher Scientific	AAA1376630
아스코르브산	Fisher 과학	AC401471000