구조와 원자 힘 현미경 이미징 사용 하 여 Nucleosomes의 역학 조사

요약

여기, 우리는 프로토콜 nucleosome 정적 및 시간 경과 원자 힘 현미경 (AFM) 이미징 기술을 사용 하 여 단일 분자 수준에서 입자의 특성을 제시. 설명 된 표면 기능화 방법 구조의 캡처 및에 nucleosomes의 역학에 대 한 수는 nanoscale에 고해상도.

초록

nucleosome subunits의 긴 사슬, chromatin DNA 복제 그리고 녹음을 진 핵 세포 에서도 이러한 중요 프로세스에 대 한 수 동적 시스템입니다. Nucleosomes의 역학 복제 및 전사 기계에 의해 DNA에 액세스를 제공 하 고 비판적으로 기본 chromatin 기능 분자 메커니즘에 기여. 단일 분자 연구 원자 힘 현미경 (AFM) 같은 이미징 nucleosome 구조 역학의 역할의 우리의 현재 이해에 크게 기여 했다. 현재 프로토콜 고해상도 AFM 이미징 기술을 공부 nucleosomes의 구조와 동적 속성을 사용 하는 단계를 설명 합니다. 프로토콜은 H3 히스톤의 대응 centromere 단백질 (CENP A)으로 대체 됩니다 centromere nucleosomes에 대 한 AFM 데이터 표시 되어 있습니다. 프로토콜의 모노 nucleosomes 연속 희석 방법을 사용 하 여 어셈블리와 함께 시작 합니다. 기능성된 nucleosome 이미징에 사용 되는 aminopropyl silatrane (APS-운 모)와 운 모 기판의 준비 nucleosomes 설명의 AFM 시각화에 대 한 중요 한 이며 기판 준비 하는 절차를 제공 합니다. Nucleosomes APS-운 모 표면에 입금 됩니다 먼저 nucleosome 인구의 스냅샷을 캡처 정적 AFM을 사용 하 여 몇 군데. 이러한 이미지의 분석에서 DNA는 nucleosomes 감싸의 크기 같은 매개 변수 측정 될 수 있다 고이 과정은 또한 상세. 액체의 절차 이미징 시간 경과 AFM 몇 프레임을 캡처할 수 있는 고속 저속 AFM에 대 한 설명의 초당 nucleosome 역학. 마지막으로, 동적 프로세스의 정량적 특성을 사용 하는 nucleosome 역학 분석 설명 이며 그림.

서론

진 핵 세포에서 DNA는 매우 압축 하 고 염색체에 조직. ¹ 염색체 내 DNA 조직의 첫 번째 수준은 147에서 nucleosomes의 어셈블리는 DNA의 혈압은 단단히 히스톤 octamer 코어 주위에 싸여. ^{2 , 3} 높은 소형 염색체 단위 형성 될 때까지 다음 구성 하는 chromatin 배열을 형성 하는 긴 DNA 분자에 nucleosome 입자 조립. ⁴ chromatin의 해체를 DNA 유전자 전사 및 게놈 복제와 같은 중요 한 세포질 과정에 필요한 제안 하는 chromatin는 매우 동적 시스템을 무료로 액세스를 제공 합니다. ^{5 , 6 , 7} elucidating 어디 실수 세포 죽음 또는 암과 같은 질병의 발전으로 이어질 수 있습니다 분자 수준에 유전 과정에 대 한 중요성은 다양 한 염색 질 수준에서 DNA의 동적 속성을 이해. ⁸ 매우 중요 chromatin 속성은 nucleo....

프로토콜

1. 연속 희석 모노 nucleosomes의 어셈블리

1. 생성 하 고는 오프 중심으로 Widom 601 nucleosome 시퀀스 위치를 포함 하는 약 400 bp DNA 기질을 정화. ⁵⁵
   참고: 제한 하려면 디 nucleosomes의 원치 않는 형성, 각 '팔' 측면에 서는 위치 시퀀스 초과 해서는 안됩니다 ~ 150 혈압.
   1. 플라스 미드 pGEM3Z-601 설계 된 프라이 머를 함께 사용 하 고 PCR를 사용 하 여 기판 DNA를 증폭. 앞으로 122 및 154 bp 팔 길이 여기 사용 423 bp 기판 사용 (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3')와 역 (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') 뇌관.
   2. 튜브 열 cycler는 반응 혼합물을 포함 하는 95 ° c.에 preheated 추가 95 ° C, 30 s 49 ° C에서 열 처리, 72 ° c.에 35 s 확장에서 95 ° c: 30의 변성에서 5 분에 대 한 초기 변성 후 33 주기 위해 다음 프로그램을 실행 33 주기를 다음 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장을 설정 합니다.
   3. 상업적으로 이용 가능한 PCR 정화 키트를 사용 하 여 PCR 혼합물에서 DNA를 정화. PCR 정리 열에서 D....

결과

모노-nucleosomes 처음 실험 연속 희석 조립 방법 (그림 1)를 사용 하 여 이미징 AFM 준비 했다. 준비 nucleosomes 다음 불연속 SDS 페이지 (그림 2)를 사용 하 여 확인 했다. 운 모 표면은 다음 기능성 APS, 고해상도 이미징 (그림 3)에 대 한 부드러운 배경을 유지 하면서 표면에 nucleosomes를 캡처를 사용 하 여. Nucleosomes는 APS-운 모에 예금 되었다 고 이후 정적 AFM 이미지를 사용 하 여 몇 군데 있었다. 어셈블리 및 증 착에 대 한 컨트롤, H3 모노 nucleosomes 준비 했다 하 고 정적 AFM을 사용 하 여 몇 군데. H3 모노 nucleosomes (그림 4A)의 이미지 nucleosomes 성공적으로 조립 되었다 확인 하는 증 착 전에 순간 .......

토론

위에서 설명한 프로토콜은 오히려 간단 하 고 재현성 높은 결과 제공 하는 몇 가지 중요 한 문제를 강조 수 있습니다. 기능성된 APS-운 모는 안정적이 고 재현 가능한 결과 얻기를 위한 주요 기판. APS-운 모의 높은 안정성 이미징 기판 사용 준비 중인 후 2 주 이상 사용할 수 있는 사전에 준비를 한이 기판의 중요 한 기능 중 하나입니다. ^{59 , 그러나 61} , 표면 수 있습니다 손상 될 접착제의 증기에 의해 운 모는 금속 퍽에 장착에 사용 됩니다. 따라서, 운 모 프로토콜 (2 절)에 설명 된 대로 장착에 대 한 두 배 지팡이 테이프를 사용 하는 것이 좋습니다. 경우에 접착제의 사용이 필요한 경우 예를 들어 이미징 액체, 금속 디스크에 돌비 늘의 설치를 위한 접착제를 사용 하는 일부 사용자 섹션 6.1.3 HS AFM 이미징 위한 샘플 준비에에서 설명 된에서 수정 다음 절차는 권장 . 운 모는 금속 디스크 또는 다른 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Plasmid pGEM3Z-601	Addgene, Cambridge, MA	26656
PCR Primers	IDT, Coralville, IA	Custom Order	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
polymerase	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	EP0701	카탈로그 번호 200 units
PCR purification kit	Qiagen, Hilden, Germany	28104	50 단위
Tris base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	10708976001	카탈로그 번호 250 g
	EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	15576028	카탈로그 번호 500 g
(CENP-A/H4)2, 재조합 human	EpiCypher, Durham, NC	16-0010	카탈로그 번호 50 ug
H2A/H2B, 재조합 human	EpiCypher, Durham, NC	15-0311	카탈로그 번호 50 ug
H3 Octamer, recombinant human	EpiCypher, Durham, NC	16-0001	카탈로그 번호 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI 투석 장치 키트, 10K MWCO, 0.1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	69574	카탈로그 번호 10 장치
카탈로그 번호 Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	카탈로그 번호 500 mg
아미콘 울트라-0.5  mL 원심 필터	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	8개 장치의 카탈로그 번호
HCl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25ML	25 mL
Tricine	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	카탈로그 번호 25 g
SDS	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	카탈로그 번호 1 kg
과황산 암모늄 (AmmPS)	Bio-Rad, Hercules, CA	1610700	카탈로그 번호 10 g
30% 아크릴아미드/비스 용액, 37.5:1	Bio-Rad, Hercules, CA	1610158	카탈로그 번호 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hercules, CA	1610800	번호 5 mL
4x Laemmli 단백질 시료 버퍼 SDS-PAGE	Bio-Rad, Hercules, CA	1610747	카탈로그 번호 10 mL
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	카탈로그 번호 10
mL ageRuler Prestained Protein Ladder	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	26616	카탈로그 번호 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie	Stain Bio-Rad, Hercules, CA	1610786	1 L
부직포 클린룸 와이프의 카탈로그 번호: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, NC	TX604
Muscovite Block Mica	AshevilleMica, Newport News, VA	Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS)	22
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	카탈로그 번호 25g
스카치 테이프	Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm 프로브(정적 이미징용)	Bruker AFM 프로브, Camarillo, CA
MSNL-10 afm 프로브(표준 타임랩스 이미지용)	Bruker AFM 프로브, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue	Toagosei America, West Jefferson, OH	AA480	카탈로그 번호 2g 튜브
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M8266-100G	카탈로그 번호 100g
Millex-GP 필터, 0.22  &마이크로; m	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	10개 장치에 대한 카탈로그 번호
BL-AC10DS-A2 afm 프로브 (HS-AFM용)	Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan
화합물 FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan
MultiMode Atomic Force Microscope	Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy	Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan

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