특정 성장 속도로 타 바이러스의 세포 바인딩 기능에 대 한 분석

RNA 바이러스는 그들의 돌연변이 비율, DNA 기반 생물의 보다 높은² 인해 quasispecies¹로 알려진 유전으로 다양 한 인구를 형성 한다. Quasispecies에 인구 구조는 돌연변이, 유전적 부동, 선택의 압력 등 인구 유전 요인에 의해 영향을 받습니다. 단일 유전 계보 내의 긴장 유전적 다양성 때문에 다른 고기를 표시할 수 있습니다. 예를 들어 Rachmadi 외. 무료 염소 감도 플 라크 정화 스트레인 S7-p p 3의³에서 murine 노로바이러스 긴장 가운데 다른 했다 보여주었다.

Rotaviruses (reoviridae 가족에 속으로)는 비 싸여 ds RNA 바이러스 quasispecies²를 형성. 위에서 설명한 인구 유전 요인 뿐만 아니라 게놈 reassortment 영향을 미칩니다로 타 바이러스의 유전적 다양성을 때문에이 바이러스는 11 세그먼트 유전자⁴. Rotaviruses는 주로 유아, 중 설사를 일으킬 하 고 2013 년에 유아 죽음 250000⁵에 대 한 추정 했다. 하지만 일부 연구 자들은 이제 백신 탈출 돌연변이^6,,78, 의 존재를 논의 하는 두 백신 여러 국가에서 사용 하 고로 타 바이러스 감염의 부담을 줄이는 효과가 있다 ⁹. 이러한 돌연변이의 특성 백신 탈출 메커니즘을 이해 하는 것이 중요 하다.

여기, 우리가 특정 성장 율 및 변종/돌연변이 간의 phenotypic 차이 이해 하기 위해로 타 바이러스의 세포 바인딩 능력을 평가 하기 위한 두 개의 분석 실험에 대 한 프로토콜 제시. Rotaviruses의 성장 곡선 이전 보고서¹⁰, 발표 되었습니다 하지만 특정 성장률 등 성장 매개 변수는 일반적으로 측정 되지 않습니다. 실시 셀 바인딩 분석 결과 이전 immunofluorescent 얼룩 기법¹¹를 포함 한다. 우리는 여기 패 분석 결과 및 RT-정량, 양적 바이러스 고기에 차이 논의 하기 위해 우리를 사용 하 여 쉽게 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 고기 특성에 대 한 적절 한 하 고 마침내 여러 genotypes에 대 한 효과적인 새로운 백신의 건설에 기여할 수 있습니다.

1. 매체 준비

1. 세포 배양 매체 (혈 청에 포함 된 매체)을이 글의 MEM 분말의 4.7 g 증류수 500 mL를 추가 합니다. 20 분 하 고 실내 온도에 보통 쿨에 대 한 120 ° C에 고압. 소 태아 혈 청에 추가 (최종 농도: 10%), L-글루타민 (2mm), 페니실린 스 (1%), 나트륨 중 탄산염 (1.125 g/L). 1 개월에 4 ° C에서 저장 합니다.
2. 소 태아 혈 청 하지 않고 단계 1.1에서 설명 된 대로 바이러스 전파에 대 한 혈 청 자유로운 매체를 준비 합니다. 1 개월에 4 ° C에서 저장 합니다.
3. 상 패 분석 결과 대 한이 글의 메모리 매체 (비 포함 된 페 놀 레드) 100 mL 압력가 마로 소독 하 여 소독. 실내 온도에 냉각 하 고 2% 추가 매체를 하자 FBS, 2% 페니실린 스, L-글루타민, 4mm와 2.25 g/L NaHCO₃. 4 ° c.에 게
4. 상 패 분석 결과 대 한 압력솥으로 2.5 %agarose 젤 100 mL 소독. 젤 패 시험 실시 당일 준비. 물 욕조에 47 ° C에 젤을 저장 합니다.

2. 세포 배양

1. 액체 질소 용기에서 MA104 셀 라인을 포함 하는 cryotube를 제거 합니다. 세포를 해 동 37 ° C에서 물 욕조에는 cryotube를 놓습니다. T75 플라스 크에서 혈 청에 포함 된 매체의 20 mL에 세포 현 탁 액 1 mL를 추가 합니다. 2 또는 3 일 동안 37 ° C, 5% CO₂ 배양 기에 플라스 크를 품 어.
   참고: 현 탁 액에서 최종 셀 농도 약 10⁶ 셀/mL 이다.
2. 일단 셀 단층 80 %confluency 도달는 상쾌한을 제거 하 고 Dulbecco의 PBS (인산 염 버퍼 식 염 수) x 1의 5 mL로 두 번 셀을 세척.
3. 0.05% 트립 신-EDTA의 4 mL 플라스 크에 추가 하 고 플라스 크에서 세포를 분리 하려면 5 분 동안 37 ° C에서 품 어. 15 mL 튜브를 5 분 동안 190 x g에서 원심 분리기 세포 현 탁 액을 전송 합니다.
4. 삭제는 상쾌한 고 중간에 준비 1.1 포함 하는 혈 청 1 mL에 수송과 세포 (10⁶ 셀) resuspend. 약에서 resuspended 셀을 희석 매체와.
5. 6-잘 (패 분석 결과) 또는 (대 한 셀 바인딩 분석 결과), 24-잘 접시의 각 음을 각각 희석된 세포 현 탁 액 3 mL를 추가 합니다. 2 ~ 3 일에 대 한 포화 증기에서 37 ° C, 5% CO₂ 인큐베이터에 접시를 품 어.
   참고: T75 플라스 크 샘플 볼륨 상쾌한 (1 mL)의 총 표면에 뜨는 볼륨 (30 mL)에 비해 무시 될 수 있기 때문에 시간 코스 샘플을 수집 하는 게 적당 하다. 한편,는 일반적으로 6-잘 접시를 사용 하 여 수행 상 패 분석 결과 각 상쾌한에 바이러스의 감염 titer 측정 됩니다. 24 잘 플레이트 세포 바인딩 분석 결과 대 한 활용 됩니다.

3. 특정 성장 율으로 타 바이러스의

참고: 붉은 털으로 타 바이러스 (RRV, 유전자 형: G3P[3]) RRV 신속 하 고 쉽게 MA104 셀과 플 라크를 형성 수 있습니다 때문에이 프로토콜에서 이용 된다.

1. 해 동 장소-80 ° c에서 37 ° C에 물 목욕 저장 혈 청 자유로운 매체에 바이러스 중지 (10⁷ pfu/mL) 1 mL를 포함 하는 관. 돼지 췌 장에서 바이러스 정지 (최종 트립 신 농도 4 µ g/mL) 그리고 소용돌이의 1 mL 1 µ µ g/L 트립 신을 추가 합니다. 30 분에 대 한 포화 증기에서 37 ° C, 5% CO₂ 에서 바이러스 정지를 품 어.
   참고: 트립 신 다른 소스에서 사용할 수 있습니다, 그러나로 infectivity에 영향 사전에 테스트할 필요가 있다.
2. 혈 청 무료 매체 조정 0.1 pfu/셀 감염 (MOI)의 다양성을 활성화 바이러스 정지 희석.
3. 추가 희석된 바이러스 서 스 펜 션의 1 mL MA104 셀 라인 (80% 합칠) T75 플라스 크에 셀 (2.1) 도금 후에 3 일, 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어 하 고 부드럽게 흔들어 플라스 크 매 15 분.
4. 그런 다음, 30 mL 플라스 크에 돼지 췌 장에서 trypsin의 0.13 µ g/mL를 포함 하는 혈 청 무료 매체의 추가. 포화 증기에서 37 ° C, 5% CO₂ 플라스 크를 품 어.
5. 0, 6, 12, 18, 24에 플라스 크에서 상쾌한의 1 mL 및 36 (또는 48) h 후 감염 (hpi)를 수집 하 고는 피 펫을 사용 하 여 1.5 mL 튜브에 상쾌한 대체.
6. 동결 (-80 ° C)를 실시 하 고 37 ° C 사이클에서 세 번 물 욕조에 녹아. 다음 4 ° c.에서 10 분 동안 12600 x g 에서 튜브 원심 상쾌한을 수집 합니다.
7. 소 주 0.2 µ m 필터 셀 일부를 제거 하는 상쾌한을 필터링 합니다. 바이러스 titer 측정 하기 위한 패 분석 실험에 적용까지 표면에 뜨는-80 ° C 냉장고에 저장 합니다.
8. 37 ° c.에 물 목욕에서 수집 된 상쾌한 (3.5 단계)를 포함 하는 튜브를 배치 10 희석된 샘플의 1 mL를 4 µ g/mL의 트립 신을 추가 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
9. 3.8에 30 분 인큐베이션 기간 동안 시작 시간 코스 샘플 (3.5 단계)에서 얻은 바이러스 titer 측정 하기 위한 패 분석 결과 씻어 6 잘 플레이트 1 x PBS의 2 mL와 두 번의 MA104 셀 포함 하는 혈 청 매체를 제거한 후.
10. 직렬 혈 청 무료 매체 incubated 샘플을 희석 하 고 각 우물에 희석된 샘플의 1 mL를 접종. 37 ° C, 5% CO₂ 포화 증기, 아래에서 90 분 동안 접시를 품 어 그리고 부드럽게 흔들어 접시 마다 15 분.
11. 부 화, 후 6 잘 플레이트에서는 inoculum을 제거 합니다. (1.3 단계)에서 준비 하는 중간에 4 µ g/mL의 트립 신을 추가 합니다. 부드럽게 하지만 즉시 각 음을 agarose 젤 (비율은 1:1) 혼합 매체의 3 mL를 추가 합니다.
12. (Agarose 젤 고체까지) 10 분 이상 실 온에서 접시를 유지 하 고 포화 증기에서 37 ° C, 5% CO₂ 에서 2 일 동안 품 어.
    참고: 우물의 가장자리에서 agar와 혼합 매체를 붓는 다.
13. 각 음을 1 x PBS에 희석 0.015% 중립 빨강 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 포화 증기에서 37 ° C, 5% CO₂ 에서 품 어. 3 h 후 염료를 제거 하 고 포화 증기에서 37 ° C, 5% CO₂ 1 일 품 어.
14. 다음 날, 각 잘에서 플 라크의 수를 세 고 계산 pfu/mL. 신중 하 게 패 분석 결과 패 숫자를 보장 하기 전에 셀 합류를 확인 하십시오.

4. 셀 바인딩 분석 결과

참고: 이 프로토콜은 Gilling의 보고서¹³을 기반으로 합니다.

1. (2.1에서 같은 방식으로)에 돼지 췌 장 (최종 트립 신 농도 4 µ g/mL) 바이러스 정지 그리고 소용돌이의 1 mL에 1 µ µ g/L 트립 신을 추가 합니다. 조정 1 pfu/셀의 나 혈 청 자유로운 매체와 바이러스 정지 희석.
2. 다음, MA104 셀 Tris 버퍼 식 염 수 1ml와 24-잘 접시에 두 번 세척 (TBS; 2.53 g/L 트리 스 베이스, 6.54 g/L NaCl, KCl, 0.3 g/L 0.046 g/l Na₂HPO₄ 증류수 1 L에 도달).
3. 셀, 24-잘 접시의 각 잘 희석된 바이러스 정지의 100 µ L를 접종 하 고 부드러운 떨고 모든 15 분으로 90 분, 4 ° C에서 품 어.
4. 바이러스 inoculum을 제거 하 고 세척 tbs.의 1 mL로 두 번 셀 더블-좌초 (ds) RNA는로 타 바이러스의 추출, 추가 PBS x 1의 140 µ L 및 RNA 추출 버퍼의 560 µ L ( 재료의 표참조) 각 잘 하. 피 펫 (10 x에 대 한 때까지 또는 연 무 또는 버퍼에 있는 세포의 오염 나타나지 않습니다)와 적절 하 게 믹스.
5. 회복 후 제조업체의 프로토콜에 따라 이중 좌초 RNA (dsRNA), 1.5 mL 튜브 dsRNA 추출 dsRNA, 변성 다음 즉시 얼음에 튜브를 배치 하 고 2 이상의 품 어 5 분 동안 95 ° C에서 열 블록에 포함 된 배치 분입니다.
6. 반전 녹음 방송을 사용 하 여는 cDNA를 합성 키트 ( 재료의 표참조). 혼합물 (표 1)의 16 µ l을 포함 하는 PCR 튜브에 변성된 바이러스 성 RNA 솔루션의 4 µ L을 추가 하 고 거품 생성을 하지 피 펫으로 신중 하 게 혼합. 튜브 아래로 회전 합니다.
7. 표 2에 표시 된 조건 하에서 열 cycler와 반전 녹음 방송을 수행 합니다. cDNA 즉시 사용 하지 않으면 최대 1 년 동안-20 ° C에서 cDNA를 포함 하는 PCR 튜브를 저장 합니다.
8. 정량 PCR를 위한 뇌관을 사용 하 여 (앞으로 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', 역; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')¹⁴ 와 프로브를 끄는 삽입 (정량 프로브; 5'-/ 팸/ATGAGCACA/끄는/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA/3 '), 대상에 963-NSP3로 타 바이러스의 게놈 세그먼트의 1049 지역 (ST3 스트레인, 은행: X81436).
   참고: 끄는 쩡 외.¹⁴ 에 의해 설계 된 프로브 삽입 됩니다.
9. 표준 플라스 미드를 직렬로 희석 (10 10⁶ 복사본/mL을¹ ) PCR과 정량 혼합 (표 3)에 물을 학년 고 정량 다음 표 4에 대 한 마스터 믹스 (20 µ L/샘플).
10. 96-잘 PCR 격판덮개의 우물을 마스터 믹스 20 µ L을 추가 하 고 10 번 pipetting으로 cDNA 샘플의 5 µ L 또는 표준 플라스 미드의 5 µ L를 혼합. 표 4에 표시 된 조건에 따라 정량 시스템의 반응을 시작 합니다.
11. MA104 세포 표면에 바인딩된로 타 바이러스 게놈을 계산 하려면 Ct 값과 표준 플라스 미드의 알려진된 게놈 수 사이의 선형 회귀를 수행 하 고 샘플의 게놈 수 예상 합니다. 다음 그 초기 inoculum (G₀)에 virion 숫자 바인딩 셀 (G_t)의 비율을 계산 합니다.

특정 성장 속도 플 라크-정화 RRV 긴장의 셀 바인딩 분석 결과 대 한 두 개의 프로토콜에 대 한 개요는 각각 그림 1A 와 2A에 표시 됩니다.

특정 성장 율에 대 한 분석 결과, 마지막 바이러스 titer T75 플라스 크에 전파할 때 10 이상7 pfu/mL에 도달 합니다. 최대 농도 107 pfu/mL 보다 낮은 경우에, MA104 셀 confluent 될 않을 수 있습니다 또는 RRV는 트립 신에 의해 잘 활성화 되지. 일부 성장 모델 감염 단위 데이터를 사용 하 여 특정 성장 율 추정을 위한 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 수정된 Gompertz 모델12 ; 예를 들어 고용

여기서 N0 (104 pfu/mL이이 연구에서)과 Nt (104 108 pfu/mL) 0와 t 바이러스 감염 titer (pfu/mL)는 (예: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, 각각, A는 점근 값 [로그 (N∞/N0 )] (예: 3 ~ 4), μ 특정 성장 율 [1/h] e는 네이피어의 상수 이며, λ는 지연 기간 [h]. 모델 매개 변수 관찰 및 모델 값의 차이의 제곱의 합을 최소화 하는 분석 소프트웨어의 해 찾기 함수에 의해 얻을 수 있습니다. 그림 1B에서 예제에서 특정 한 성장 율 (μ) 0.197 [1/h] 추정 되며 지연 기간 (λ) 6.61 [h] 초기 titer (고정 단계에서 수정 Gompertz 모델과 상대 바이러스 titer를 최소 제곱 메서드를 적용 하 여 로그 스케일) (A)는 3.15 [로그 (N∞/N0)]. 우리 총, 6로 타 바이러스 복제를 테스트 하 고 특정 성장 율의 추정된 값 0.27 [1/h] 0.19에서 ranged. 이 값은 신뢰할 수 있는의 결정 값 모델 피팅 계수 0.98 보다 더 있기 때문에 추정.

RRV virions 셀 표면에 바인딩 했다 약 103 복사본/mL (바인딩 효율은 약 1%) 셀 바인딩 분석 결과 (그림 2B)에 대 한 24-잘 접시를 사용 하는 경우. 분석 결과 일반적으로 모든 샘플에 대 한 세 번을 수행 하 고 복사본 수에 큰 차이 샘플에서 관찰, 트립 신에 의해 RRV의 부족-세탁기 활성화 등 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. Ct 값 정량 초과 약 36.0 바람직 이며 우리의 정량 상태에서 검출 한계 미만 이어야 하 고 여겨진다.

표 1: 마스터는로 타 바이러스 게놈의 cDNA 합성에 대 한 구성 믹스.

로 타 바이러스 게놈의 cDNA 합성 표 2: 반응 조건입니다.

표 3: 마스터는로 타 바이러스 게놈의 양이 많은 PCR에 대 한 구성 믹스.

로 타 바이러스 게놈의 양이 많은 PCR에 표 4: 반응 조건입니다.

그림 1:로 타 바이러스 성장 추정과로 타 바이러스의 성장 곡선의 도식 개요. (A)로 타 바이러스의 감염 단위 패 분석 실험으로 측정 됩니다. (B) 곡선 (파란색 선)는 우리의 실험실 (흰색 원)에서 관찰 된 데이터 수정된 Gompertz 모델에서 직선 근사 줄. 특정 성장 율 [μ]; [h-1], 0.197 지연 기간 (λ); 6.61 [h], 초기 titer (로그 눈금)에 고정 단계에서 상대 바이러스 titer (A); 3.15 [로그 (N∞/N0)]. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 도식 개요 및 우리의 실험실에 있는 플 라크에서 정화 5 RRV 긴장의 셀 바인딩 분석 결과의 대표적인 결과. (A) A 셀 문화 접시와로 타 바이러스 접종 억제 세포로 바이러스 침공 4 ° C에서 incubated입니다. 부 화 후에 셀에 언바운드 바이러스 성 입자를 제거, 바운드 바이러스 입자에서 발생 하는 실시간 정량 Pcr과 세포 표면에는 게놈의 수 계량. (B) 셀 바인딩 결과 분석 결과 바인딩 했다 그는 inoculum에 바인딩된 바이러스 성 입자의 비 효율 (%)로 표시 됩니다. 대담한 바: 중간, 월말 상자: 사분 위 수 편차, 라인의 끝: 최대 및 최소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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