조작된 nanomaterials에 독의 검출 nanomedicine 분야에서 대상 과제 중 하나를 나타냅니다. 여기, 우리는 나노 입자에서 잠재적인 내 오염 추정 세 가지 다른 랄 형식으로 구성 된 프레임 워크를 설명 하는 사례 연구를 제시.
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이 논문에서
요약
초록
제약 제품에 존재 하는 경우 (종종 라고도 lipopolysaccharide) 그람 음성 세균의 세포 벽 구성 요소 내 염증, 발열, 저자 또는 고혈압, 발생할 수 있습니다. 그리고, 극단적인 경우에 수 있습니다. 조직 및 장기 손상으로 이어질 수 있습니다. 치명적 된다. 따라서, 제약 제품에도의 양은 엄격 하 게 통제 된다. 도 탐지 및 정량화에 대 한 사용할 수 있는 방법, 중 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 결과 주로 세계적으로 사용 됩니다. 어떤 제약 제품 랄 분석 결과 방해할 수 있습니다, 하는 동안 나노-공식 그들의 복잡으로 인해 특정 도전을 나타냅니다. 이 문서의 목적은 연구 설계 나노 소재 및 나노 공식화 약물 독 추정에 미숙한 실용적인 가이드를 제공 하. 여기, 탁도, 발을 포함 한 세 랄 포맷 응고 젤 분석 실험을 수행 하기 위한 실질적인 권장 사항은 설명 합니다. 이 분석 실험 나노기술 기반 약물 제품, 백신, 그리고 adjuvants 내 오염 확인을 사용할 수 있습니다.
서론
내 그람 음성 세균 세포 벽1,2의 빌딩 블록 이다. 그것은 매우에 면역 세포를 활성화할 수 있습니다 (picogram) 농도1,2낮은. 셀 한도에 대 한 응답에 의해 생성 된 proinflammatory 중재자 (cytokines, leukotrienes, eicosanoids, 등) 발열, 저 혈압, 고혈압, 그리고 여러 기관 실패를 포함 하 여 더 심각한 건강 문제에 대 한 책임은 1 , 2 , 3. 면역 중재 측면-효과도 의해 실행의 심각도 내 구성과 구조에 의해 결정 고도 국제 단위 (IUs 또는 EUs)3에서 측정 된 힘에 따라 달라 집니다. 이러한 단위 몸 무게의 킬로그램 당 수는 내 화성 복용량을 임계값을 설정 하는 데 사용 됩니다. 이 복용량은 EU/5kg 약 제품에 대 한 관리 를 통해 intrathecal 경로 하지만 모든 노....
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프로토콜
1입니다. 나노 샘플의 준비
- 준비 랄에 연구 샘플 학년 물.
- 샘플 pH 범위를 6-8 인 경우에, pyrogen 무료 수산화 나트륨 또는 염 산을 사용 하 여 pH를 조정 합니다.
- 랄을 사용 하 여 학년 물 연구 샘플의 여러 희석을 준비 합니다. 높은 희석은 최대 유효 희석 (MVD)를 초과 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. MVD 추정에 대 한 자세한 토론 섹션을 참조 하십시오.
2. 랄 형식 사이 시 약 일반의 준비
- LAL 시 약 물 pyrogen 무료를 사용 하 여 0.1 n.의 농도에서 작업 솔루션을 준비 하는 집중된 수산화 나트륨 재고 희석
- LAL 시 약 물 pyrogen 무료를 사용 하 여 집중된 염 산 주식을 희석 하 고 0.1 n.의 최종 농도에 작업 솔루션을 준비
- 제어 표준도 (CSE)의 준비
- 제조업체에서 제공 하는 분석의 인증서에 따라 CSE reconstitute
참고: 인증서에 제공 하는 정보에 관한 중요 사항에 대 한 토론 섹션을 참조 하십시오. 카탈로그 번호 및 다른 랄 형태로 특정된 CSE 공식의 응용 프로그램에 대 한 세부 사항에 대 한 테이블의 자료
- 제조업체에서 제공 하는 분석의 인증서에 따라 CSE reconstitute
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결과
LAL 분석 실험에서이 테스트 한 후 생성 된 데이터의 예는 표 1에 표시 됩니다. PEGylated 자주 독 소 루비 5 희석에서 비 랄와 방해. 그러나,이 간섭 큰 희석에 의해 극복 됐다. 50과 200% 사이 스파이크 복구 때이 희석 탁 랄에에서 5에서 뿐만 아니라 희석 50 및 탁도 및 비 랄, 500에서 테스트 되었습니다. 희석 비율 조정, 결과 두 분석 실험에 희석 사이 일관 했다. 또한, 결과 세 가지 분석 결과 형식 사이 일관 했다.
| 테스트 샘플 | 탁도 랄, EU/mg (스파이크 복구, %) | 비 랄, EU/mg (스파....... |
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토론
이 프로토콜에서 제공 하는 정보15,26 전에 설명 하고있다 고는 미국 식품 의약품 안전 청은 미국 식약청 (FDA) 및 미국 약전 (USP)4 에 의해 게시 된 여러 규제 문서 , 5 , 6 , 27, 그리고 또한 NCL 웹사이트20 프로토콜 STE1.2 (탁도 랄), STE1.3 (젤 응고 랄)에 사용할 수 및 STE1.4 (비 랄).
테스트-나노 LAL 시 약 물 또는 살 균, pyrogen 무료 PBS에서 준비 된다. 연구 샘플의 산도 낮은 (< 6)와 높은 (> 8) pH는 lysate의 최적의 성.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
연구는 국립 암 연구소에서 연방 기금에 의해 지원 되었다 건강의 국가 학회, HHSN261200800001E 계약. 이 발행물의 콘텐츠 뷰 또는 정책의는 부의 보건 및 인적 서비스, 반드시 반영 하지 않습니다도 무역 이름, 상용 제품의 언급지 않습니다 또는 조직 미국 정부에 의해 승인을 의미 합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 탁도 LAL Assay | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma S2770 | 필요한 경우 샘플 pH를 6-8 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | 경우 샘플 pH를 6-8 LAL 사이로 조정하는 데 사용됩니다 |
| Cape Cod | T0051 | 약 | Associates 이 시약은 탁도와 함께 사용할 수 있습니다. 분석 전용 |
| Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | 이 시약은 탁도 및 겔 응고 분석과 함께 사용할 수 있습니다 |
| LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | 이 시약은 모든 LAL 형식과 함께 사용할 수 있습니다 |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | 베타 글루칸의 위양성 반응을 방지하는 데 사용됩니다. |
| 일회용 내독소가 없는 유리 희석 튜브 12 x 75mm | Associates of Cape Cod | TB240 | 이 튜브는 세 가지 분석 모두와 함께 사용할 수 있습니다 |
| 내독소가 없는 유리 반응 튜브 8 x 75mm | Associates of Cape Cod | TK100 | 이 튜브는 탁도 및 발색 분석과 함께 사용할 수 있습니다 |
| 0.25 및 1.0mL의 Pyrogen-free 팁 | RAININ | PPT25, PPT10 | 팁과 피펫은 내독소를 흡착하고 LAL 분석을 방해하는 침출물을 방출할 수 있습니다. 이 RAININ 팁은 LAL 분석에서 최적의 성능을 발휘하는 것이 검증 및 확인되었기 때문에 사용됩니다 |
| . Pyrogen-free microcentrifuge tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | 기타 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다 |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | 기타 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다 |
| 반복 피펫터 | Eppendorf | 4982000020 | 다른 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다. |
| Microcetrifuge | 모든 브랜드 | 모든 브랜드 사용 가능 | |
| 냉장고, 2-8 C | 모든 브랜드 | 모든 브랜드 | |
| Vortex | 모든 브랜드 | 냉 | |
| 동고, -20 C | 모든 브랜드 | 모든 브랜드 | |
| Pyros Kinetix 또는 Pyros Kinetix Flex 리더 | Associates of Cape Cod | PKF96 | 다른 악기를 사용할 수 있습니다. 그러나 이 분석에 사용된 LAL 시약 및 내독소 표준물질은 최적화가 필요할 수 있습니다. 다른 기기를 사용하는 경우 지침에 대해 기기 및 LAL 키트 제조업체에 문의하십시오 |
| Chromogenic LAL Assay | |||
| Pyrochrome LAL Reagent | Associates of Cape Cod | CG1500-5 | 이 시약은 |
| Cape Cod | EC010 | Control Endotoxin Standard | 이 표준은 탁도 및 겔 응고 LAL에 사용되는 표준과 다릅니다. 발색 분석에서 최적의 성능을 발휘하도록 최적화되어 |
| 수산화나트륨 | 시그마 | S2770 | 필요한 경우 샘플 pH를 6-8 |
| 염산 | Sigma | H9892 | 경우 샘플 pH를 6-8 |
| LAL 등급의 물로 | Cape Cod | WP0501 | 이 시약은 모든 LAL 형식의 |
| Glucashield Buffer와 함께 사용할 수 있습니다. | Associates of Cape Cod | GB051-25 | 베타글루칸의 위양성 반응을 방지하는 데 사용 |
| 일회용 내독소가 없는 유리 희석 튜브 12 x 75mm | Cape Cod | TB240 | 이 튜브는 세 가지 분석 모두와 함께 사용할 수 있습니다 |
| 내독소가 없는 유리 반응 튜브 8 x 75mm | Cape Cod | TK100 | 이 튜브는 탁도 및 발색 분석과 함께 사용할 수 있습니다 |
| .0.25 및 1.0 ml 용량의 발열원이 없는 팁 | , RAININ | PPT25, PPT10 | 팁 및 피펫은 내독소를 흡착하고 LAL 분석을 방해하는 침출물을 방출할 수 있습니다. 이 RAININ 팁은 LAL 분석에서 최적의 성능을 발휘하는 것이 검증 및 확인되었기 때문에 사용됩니다 |
| . Pyrogen-free microcentrifuge tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | 기타 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다 |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | 기타 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다 |
| 반복 피펫터 | Eppendorf | 4982000020 | 다른 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다. |
| Microcetrifuge | 모든 브랜드 | 모든 브랜드 사용 가능 | |
| 냉장고, 2-8 C | 모든 브랜드 | 모든 브랜드 | |
| Vortex | 모든 브랜드 | 냉 | |
| 동고, -20 C | 모든 브랜드 | 모든 브랜드 | |
| Pyros Kinetix 또는 Pyros Kinetix Flex 리더 | Associates of Cape Cod | PKF96 | 다른 악기를 사용할 수 있습니다. 그러나 이 분석에 사용된 LAL 시약 및 내독소 표준물질은 최적화가 필요할 수 있습니다. 다른 기기를 사용하는 경우 지침에 대해 기기 및 LAL 키트 제조업체에 문의하십시오 |
| Gel-Clot LAL Assay | |||
| LAL Reagent | Associates of Cape Cod | G5003 | 이 시약은 겔-응고 분석에 특이적입니다. |
| Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | 이 시약은 탁도 및 겔-응고 분석과 함께 사용할 수 있습니다 |
| 수산화나트륨 | 시그마 | S2770 | 필요한 경우, 샘플 pH를 6-8 |
| 염산 | 시그마 | H9892 | 경우, 샘플 pH를 6-8 |
| LAL 등급 물 | 케이프 코드 | WP0501 | 이 시약은 모든 LAL 형식 |
| Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | 와 함께 사용할 수 있습니다.베타글루칸의 거짓 양성 반응을 방지하기 위해 사용 |
| 일회용 내독소가 없는 유리 희석 튜브 12 x 75 mm | Cape Cod | TB240 | 이 튜브는 세 가지 분석 모두와 함께 사용할 수 있습니다 |
| 일회용 내독소가 없는 유리 반응 튜브 10 x 75 mm | Cape Cod | TS050 | 이 튜브는 |
| 0.25 및 1 mL 용량의 젤-응고 분석 Pyrogen-free 팁 | RAININ | PPT25, PPT10 | 팁 및 피펫은 내독소를 흡착하고 LAL 분석을 방해하는 침출물을 방출할 수 있습니다. 이 RAININ 팁은 LAL 분석에서 최적의 성능을 발휘하는 것이 검증 및 확인되었기 때문에 사용됩니다 |
| . Pyrogen-free microcentrifuge tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | 기타 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다 |
| Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | 기타 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다 |
| 반복 피펫터 | Eppendorf | 4982000020 | 다른 동등한 소모품을 사용할 수 있습니다. |
| Microcetrifuge | 모든 브랜드 | 모든 브랜드 사용 가능 | |
| 냉장고, 2-8 C | 모든 브랜드 모든 브랜드 | 사용 | |
| 가능 Vortex | 모든 브랜드 | 모든 브랜드 | |
| 동고, -20 C | 모든 브랜드 | 모든 브랜드 | |
| 수조, 37 C | 모든 브랜드 | 모든 브랜드를 사용할 수 있지만 물의 흐름이 응고 형성에 영향을 미치고 위음성 결과를 초래할 수 있으므로 물 순환을 끄거나 비순환 수조를 사용하는 것이 중요합니다 |
참고문헌
- Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).
- Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E.
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재인쇄 및 허가
