세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

요약

여기 설명 (1) 갓 그대로 뇌 내 피 "튜브" 및 내 피 칼슘과 막 내 피 파생 hyperpolarization 동안 잠재적인의 (2) 동시 측정을 분리에 대 한 프로토콜이 있습니다. 또한, 이러한 메서드는 내 피 세포 칼슘 및 개별 또는 대화형 실험 변수로 전기 신호의 약리 튜닝 수 있습니다.

초록

대뇌 동맥 및 그들의 각각 미세 혈액 흐름 규칙을 통해 뇌에 산소와 영양분을 제공합니다. 내 피 세포의 변화 수요를 충족 하는 데 필요한 혈관과 혈관 직경에서 명령 변경의 루멘 라인. 막 잠재력 (V_m) 및 질소 산화물의 hyperpolarization의 기본 내 피 종속 신호 경로 일반적으로 중재 혈관 확장 및 혈액 흐름 증가 하는 동시에 작동 합니다. 혈관의 혈관 길이 몇몇 밀리미터 이상의 조정에 필수적인, 하지만 내 피 파생 hyperpolarization (EDH)의 구성 요소 역사적으로 측정 하기 어려운 되었습니다. EDH의 이러한 구성 요소 세포내 캘리포니아^{2 +} [캘리포니아^{2 +}]_나 증가의 작은-후속 활성화 수반 및 중간 계수 캘리포니아^{2 +}-K⁺ 를 활성화 (SK_Ca/IK_Ca) 채널.

여기, 우리가 마우스 대뇌 동맥;에서 신선한 피 내 막의 절연의 단순화 된 그림 제시 내 피 [캘리포니아^{2 +}]_i 와 V_m 각각; Fura-2 광도 및 세포내 날카로운 전극를 사용 하 여 동시 측정 그리고 소금 솔루션 및 약리 에이전트 생리 조건 (pH 7.4, 37 ° C)에서 지속적인 superfusion. 윌리스의 원형에서 후부 대뇌 동맥 제거 됩니다 후부 통신 및 두개골 기저 부의 동맥. 청소 후부 대뇌 동맥 세그먼트 및 후속 분쇄의 효소 소화 adventitia, 혈관 주위 신경, 그리고 부드러운 근육 세포의 제거를 촉진 한다. 결과 후부 대뇌 동맥 내 피 "튜브" 다음 현미경으로 확보 하 고 카메라, 광 전 증폭 관 관, 고 1 ~ 2 연속 superfusion에서 electrometers를 사용 하 여 시험. 내 피 [캘리포니아^{2 +}]_나 변화와 그대로 따라 밀리미터 거리까지 간격 접속점 통해 EDH의 확산 뿐만 아니라 개별 세포 위치에 V_m 이 방법은 동시에 측정할 수 있습니다 피입니다. 이 방법은 정상과 병에 걸린 뇌에 혈액 흐름의 메커니즘을 기본 대뇌 내 피 기능의 높은 처리량 분석을 얻을 전망 이다.

서론

두뇌를 통해 혈액 흐름 중 대뇌 동맥과 혈관 네트워크¹arterioles 혈관의 조정에 의해 통제 된다. 내 피 세포 신경^1,2,3의 대사 요구에 맞게 필요에 따라 혈관 직경에 대뇌 저항 동맥 명령 변경 안 감. 내 피 파생 hyperpolarization (일반적으로 라고도 EDH), 동안에, 특히 세포내 캘리포니아^{2 +} ([캘리포니아^{2 +}]_나) 및 내 피 세포 좌표 혈관 내 피 세포 사이에서 전기 신호 그리고 그들의 간격 접속점 동맥 이완⁴통해 주변의 부드러운 근육 세포. EDH의 생리 개시 순차적으로 G_q의 자극을 수반-결합 수용 체 (GPCRs), [캘리포니아^{2 +}]_나, 그리고 내 피 성장 작은 및 중간 Ca^{2 +}의 활성화에서 증가-K^{활성화 +} (SK_Ca/IK_Ca) 채널 hyperpolarize 대뇌 내 피 막 잠재력 (V_m

프로토콜

다음과 같은 실험을 수행 하기 전에 모든 동물 보호 사용 및 확인 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되 고 국가 연구 위원회의 "가이드에 수행 관리 및 활용에 대 한 실험실 동물' (8^번째 판, 2011)와 도착 지침. Loma Linda 대학의 IACUC 남성과 여성의 C57BL/6 마우스에 대 한이 원고에 대 한 사용 되는 모든 프로토콜을 승인 했습니다 (나이 범위: 3 ~ 30 개월).

1. 장비 및 재료

참고: 프로토콜에 필요한 자료의 세부 정보 테이블의 재료, 시 약설명서 또는 해당 공급 업체와 관련 된 웹사이트에서 찾을 수 있습니다.

1. 흐름 챔버
   1. 양극 처리 한 알루미늄 플랫폼에 유리 coverslip 바닥 superfusion 챔버를 고정. 소형 알루미늄 단계에 챔버와 플랫폼을 확보.
   2. 알루미늄 고정 피 펫을 들고 무대에는 micromanipulator 플랫폼의 각 끝에 설정 합니다.
      

결과

위에서 설명한 프로토콜의 도식 데모 연결 된 그림에 표시 됩니다. 두뇌는 젊은 성인 남성 C57BL/6N 마우스 (5 개월)에서 고립 된 그림 1A에 표시 됩니다. 후부 대뇌 동맥은 윌리스의 원, 결합 조직, 없이 제거 하 고 (그림 1B-D) 세그먼트로 잘라에서 신중 하 게 격리 됩니다. 부분적으로 소화 동맥 세그먼트에서 그대로 내 피 튜브 생산 이며 고정 펫을 사용 하 여 유리 커버 슬립에. 부드러운 기계 스트레치 선박 tortuosity 없이 선형 vivo에서 길이을 두 고정 펫을 사용 하 여 적용 됩니다. 이 원고 (그림 2A-D)에 더 명확히 되었습니다. 후부 대뇌 동맥에서 분리 된 내 피 튜브는 ~ 90-100 µ m 폭 및 ≥300 µ m .......

토론

최근 개발^6,15,,1617에 비추어 우리 지금 [캘리포니아^{2 +}]의 동시 측정을 위한 준비에 마우스 대뇌 동맥 내 피 분리 하는 방법을 보여 줍니다. _i 및 V_m EDH 일관 되 게 ~ 2 h 37 ° c.에 대 한 기본 비록 기술적으로 어려운 우리 셀-커플링 뿐 (참조⁶, 그림 1 참조)을 측정할 수 있습니다. 이러한 방식으로 우리 이산 하 고 실시 하는 이벤트를 동시에 신호를 측정할 수 있습니다. 마우스 동맥 피를 분리 하는 동안 직면 하는 일반적인 과제의 계정에 대 한 참조^11,12를 참조 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
포도	시그마 - 알드리치 (미국 미주리 주 세인트루이스)	G7021
NaCl	시그마	S7653
MgCl 2 < / sub>	Sigma	M2670
CaCl2 < / sub>	Sigma	223506
HEPES	시그마	H4034
KCl	시그마	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (미국 펜실베이니아 주 피츠버그)	A466250
콜라겐 분해 효소 (H 형 블렌드)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
플렉시글라스 수퍼퓨전 챔버	워너 인스트루먼트, 캠든, CT, USA	RC-27
유리 커버슬립 바닥 (2.4  &시간;   5.0  cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
아노다이즈드 알루미늄 플랫폼 (지름: 7.8  cm)	워너 인스트루먼트	PM6 또는 PH6
컴팩트 알루미늄 스테이지	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
마이크로매니퓰레이터	Siskiyou	MX10
실체현미경	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
광섬유 광원	Schott, 마인츠, 독일 & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon 반전 현미경	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
위상차 대물렌즈	니콘 인스트루먼트 Inc	( Ph1 DL입니다. 10X & 20X)
형광 대물렌즈	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) 및 40X (Plan Fluor)
Nikon 반전 현미경	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
마이크로 주사기 펌프 컨트롤러 (Micro4 )	World Precision Instruments(WPI), 미국 플로리다주 새러소타	SYS-MICRO4
진동 절연 테이블	기술 제조, 미국 매사추세츠주 피바디	nbsp; Micro-g
증폭기	분자 장치, 미국 캘리포니아주 서니베일	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
헤드스테이지	분자 장치	HS-2A 및 HS-9A
함수 발생기	EZ Digital, 대한민국	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, 미국 플로리다주 새러소타	BM-A-TM
디지털 스토리지 오실로스코프	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
형광 시스템 인터페이스, 아크 램프 + 전원 공급 장치, 하이퍼스위치, PMT	분자 장치, 미국 캘리포니아주 서니베일	IonOptix 시스템
온도 컨트롤러	워너 인스트루먼트	TC-344B 또는 C
인라인 히터	워너 인스트루먼트	SH- 27B
밸브 컨트롤러	워너 인스트루먼트	VC-6
인라인 플로우 컨트롤 밸브	워너 인스트루먼트	FR-50
전자 풀러	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 또는 P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA&	nbsp; MF-900
붕규산 유리관 (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
붕규산 유리관 (핀닝)	Warner Instruments	G150T-6
붕규산 유리관 (날카로운 전극)	Warner Instruments	GC100F-10
주사기 필터 (0.22 µ m)	ThermoFisher Scientific	722-2520
유리 페트리 접시 + 숯 실가드	생활 시스템 기기, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas 스타일 가위 (3 mm & 9.5  mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
가위 3 & 7 mm 블레이드	Fine Science Tools (또는 FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	듀몽 #5 & 뒤몽 #55