세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

요약

여기 설명 (1) 갓 그대로 뇌 내 피 "튜브" 및 내 피 칼슘과 막 내 피 파생 hyperpolarization 동안 잠재적인의 (2) 동시 측정을 분리에 대 한 프로토콜이 있습니다. 또한, 이러한 메서드는 내 피 세포 칼슘 및 개별 또는 대화형 실험 변수로 전기 신호의 약리 튜닝 수 있습니다.

초록

대뇌 동맥 및 그들의 각각 미세 혈액 흐름 규칙을 통해 뇌에 산소와 영양분을 제공합니다. 내 피 세포의 변화 수요를 충족 하는 데 필요한 혈관과 혈관 직경에서 명령 변경의 루멘 라인. 막 잠재력 (V_m) 및 질소 산화물의 hyperpolarization의 기본 내 피 종속 신호 경로 일반적으로 중재 혈관 확장 및 혈액 흐름 증가 하는 동시에 작동 합니다. 혈관의 혈관 길이 몇몇 밀리미터 이상의 조정에 필수적인, 하지만 내 피 파생 hyperpolarization (EDH)의 구성 요소 역사적으로 측정 하기 어려운 되었습니다. EDH의 이러한 구성 요소 세포내 캘리포니아^{2 +} [캘리포니아^{2 +}]_나 증가의 작은-후속 활성화 수반 및 중간 계수 캘리포니아^{2 +}-K⁺ 를 활성화 (SK_Ca/IK_Ca) 채널.

여기, 우리가 마우스 대뇌 동맥;에서 신선한 피 내 막의 절연의 단순화 된 그림 제시 내 피 [캘리포니아^{2 +}]_i 와 V_m 각각; Fura-2 광도 및 세포내 날카로운 전극를 사용 하 여 동시 측정 그리고 소금 솔루션 및 약리 에이전트 생리 조건 (pH 7.4, 37 ° C)에서 지속적인 superfusion. 윌리스의 원형에서 후부 대뇌 동맥 제거 됩니다 후부 통신 및 두개골 기저 부의 동맥. 청소 후부 대뇌 동맥 세그먼트 및 후속 분쇄의 효소 소화 adventitia, 혈관 주위 신경, 그리고 부드러운 근육 세포의 제거를 촉진 한다. 결과 후부 대뇌 동맥 내 피 "튜브" 다음 현미경으로 확보 하 고 카메라, 광 전 증폭 관 관, 고 1 ~ 2 연속 superfusion에서 electrometers를 사용 하 여 시험. 내 피 [캘리포니아^{2 +}]_나 변화와 그대로 따라 밀리미터 거리까지 간격 접속점 통해 EDH의 확산 뿐만 아니라 개별 세포 위치에 V_m 이 방법은 동시에 측정할 수 있습니다 피입니다. 이 방법은 정상과 병에 걸린 뇌에 혈액 흐름의 메커니즘을 기본 대뇌 내 피 기능의 높은 처리량 분석을 얻을 전망 이다.

서론

두뇌를 통해 혈액 흐름 중 대뇌 동맥과 혈관 네트워크¹arterioles 혈관의 조정에 의해 통제 된다. 내 피 세포 신경^1,2,3의 대사 요구에 맞게 필요에 따라 혈관 직경에 대뇌 저항 동맥 명령 변경 안 감. 내 피 파생 hyperpolarization (일반적으로 라고도 EDH), 동안에, 특히 세포내 캘리포니아^{2 +} ([캘리포니아^{2 +}]_나) 및 내 피 세포 좌표 혈관 내 피 세포 사이에서 전기 신호 그리고 그들의 간격 접속점 동맥 이완⁴통해 주변의 부드러운 근육 세포. EDH의 생리 개시 순차적으로 G_q의 자극을 수반-결합 수용 체 (GPCRs), [캘리포니아^{2 +}]_나, 그리고 내 피 성장 작은 및 중간 Ca^{2 +}의 활성화에서 증가-K^{활성화 +} (SK_Ca/IK_Ca) 채널 hyperpolarize 대뇌 내 피 막 잠재력 (V_m)^5,,67. 따라서, 내 피 [캘리포니아^{2 +}]_i 와 V_m 의 친밀 한 관계 혈액 흐름 조절에 필수적인 이며 불가결 하 심장-뇌혈관 기능^6,8. 광범위 한 문학에 걸쳐 다 수의 연구 개발 (예: 고혈압, 당뇨병, 심장 마비, 관상 동맥 질환, 만성 신부전, 만성 질환의 혈관 내 피 기능 장애의 협회 보고 주변 동맥 질환)^9,10, 생리 뿐만 아니라 병 적인 조건에서 내 피 기능 공부의 중요성을 나타내는.

혈관 내 피 hyperpolarization, 혈관 확장, 그리고 조직 관류의 생산에 필수적인 것 이며 따라서, 기본 셀룰러 속성의 검사는 중요 한. 일반 연구 모델로, 마우스 동맥 내 피 튜브 모델의 준비 게시 되었습니다 전에 골격 근^11,12, 창 자¹³,¹⁴, 폐 그리고 최근 뇌⁶. 동시 [캘리포니아^{2 +}]_i 와 V_m 측정 연구 특히 골격 근육 동맥 내 피^15,16 뿐만 아니라 림프 혈관 내 피¹⁷출판 되었습니다. 내 피 튜브 접근을 이용 하 여 기본 연구, 뿐만 아니라 그것의 장단점과⁸ 의 종합적인 검토는이 실험 도구는 특정 연구에 적합 여부를 확인 하 상담 수 있습니다. 간단히는 장점은 내 피 세포 기능의 주요 생리 적인 구성 요소 유지 됩니다 (예:, 캘리포니아^{2 +} 유입 및 intracellular 자료, hyperpolarization Nernst 잠재력까지 V_m 의 k⁺ 통해 SK_Ca/IK_Ca 활성화 및 내 피 세포 결합을 통해 간격 접속점) 혈관 주위 신경 입력, 부드러운 근육 전압-문이 채널 기능 및 수축, 같은 요인을 혼동 없이 혈액, 그리고 호르몬 영향⁸의 순환. 대조적으로, 일반적으로 사용 되는 세포 문화 접근 소개 형태학¹⁸ 및 이온 채널 식¹⁹ 크게 생리 적인 관측 비보 전 결정에 대 한 비교를 난독 처리할 수 있습니다 방식에서에 중요 한 변경 또는 vivo에서. 이 모델은 그대로 혈관 세그먼트 격리의 4 h 이내 테스트 최적으로 혈액의 흐름, 부드러운 근육과 실험 일정에 제한 된 유연성 등 규제에 대 한 다른 필수 구성 요소와 통합의 부족 등 동물.

Socha 및 시걸¹² 및 중간^6,,1516, 최근 실험 개발 저술로 이전 비디오 프로토콜에서 건물 이로써 설명에서 신선한 피 내 막의 절연 후부 대뇌 동맥 그리고 내 피 [캘리포니아^{2 +}]_i 와 V_m Fura-2 광도 및 세포내 날카로운 전극, 각각 사용 하 여 동시 측정. 또한,이 실험 생리 적인 조건 (pH 7.4, 37 ° C) 동안 소금 솔루션 및 약리 에이전트의 연속 superfusion를 수반 한다. 우리 후부 대뇌 동맥, 구조적 무결성 (셀 간격 접속점 통해 결합)와 충분 한 크기 (폭 50 µ m, 길이 ≥300 µ m) 내부 및 세포 신호 따라 중에 대 한 의무가 격리 endothelium 생성 선택 내 피 세포입니다. 또한, 설치류 후부 대뇌 동맥의 연구는 실질적으로 문학에서 나타내고 근본적인 내 피 신호 메커니즘, 혈관 개발/노화, 그리고 병 리^20, 의 시험을 포함 ^{21 , 22}.이 실험의 대뇌 내 피 기능 (기능 장애) 높은 처리량 분석을 얻을 것으로 예상 된다 애플리케이션과 통해 혈액 흐름의 이해에서 중요 한 발전 그로 인하여 허용 한다 노화 및 신경 질환의 개발

프로토콜

다음과 같은 실험을 수행 하기 전에 모든 동물 보호 사용 및 확인 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되 고 국가 연구 위원회의 "가이드에 수행 관리 및 활용에 대 한 실험실 동물' (8^번째 판, 2011)와 도착 지침. Loma Linda 대학의 IACUC 남성과 여성의 C57BL/6 마우스에 대 한이 원고에 대 한 사용 되는 모든 프로토콜을 승인 했습니다 (나이 범위: 3 ~ 30 개월).

1. 장비 및 재료

참고: 프로토콜에 필요한 자료의 세부 정보 테이블의 재료, 시 약설명서 또는 해당 공급 업체와 관련 된 웹사이트에서 찾을 수 있습니다.

1. 흐름 챔버
   1. 양극 처리 한 알루미늄 플랫폼에 유리 coverslip 바닥 superfusion 챔버를 고정. 소형 알루미늄 단계에 챔버와 플랫폼을 확보.
   2. 알루미늄 고정 피 펫을 들고 무대에는 micromanipulator 플랫폼의 각 끝에 설정 합니다.
      참고: 실용적인 옵션으로이 양도 무대 장치를 사용 하 여 실험의 성능에 내 피 튜브의 격리에서 전환을 촉진 하기 위하여 보안 흐름 챔버 장치.
2. 현미경
   1. 스테레오 현미경 사용 (5 x 50 x 배율 범위를) 매크로 및 마이크로 해 부 절차에 대 한 섬유 광섬유 광원을 갖추고 있습니다.
   2. 내 피 튜브의 준비에 대 한 위상 대비 또는 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 호환 목표 (10 배, 20 x 40 x)와 알루미늄 단계는 거꾸로 한 현미경을 사용 합니다.
   3. 부분적으로 소화 혈관에서 내 피 튜브를 분리 하는 microsyringe 펌프 컨트롤러를 내 피 튜브 준비 장치에 인접 한 장소.
   4. 실험 기구에 대 한 표준 목표 (4 x 10 x) 장비는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 형광 목표 (20 x와 40 x, 숫자 조리개 0.75) 및 진동 절연 테이블에 수동 알루미늄 단계.
3. 세포내 녹음 장비
   1. 격리 된 내 피 튜브에 내 피 세포의 V_m 를 기록 하는 전위 계 호환 headstage에 연결 합니다. 필요한 경우, 함수 발생기 또는 자극 전류 주입을 필요로 하는 실험에 대 한 전위 계를 연결 합니다.
   2. 데이터 수집 시스템, 가청 기준선 모니터, 오실로스코프를 앰프 출력을 연결 합니다. 실험 하는 동안 흐름 챔버 출구 근처 참조 전극 (Ag/AgCl 펠 릿)를 보호 합니다.
   3. 형광 시스템 인터페이스, 높은 강도 아크 램프와 전원 공급 장치, hyperswitch, 광 전 증폭 관 관 (PMT)의 통합된 구성 요소와 포토 메트릭 시스템을 사용 하 여 및 [캘리포니아^{2 +}]_나 내 피 세포에서 측정 하는 카메라.
   4. 인라인 히터를 갖춘 온도 조절기를 사용 하 여 인상 하 고 실험을 통해 생리 적인 온도 (37 ° C)를 유지.
   5. 인라인 흐름 제어 밸브와 밸브 컨트롤러에 연결 된 6-저수지 플랫폼을 사용 하 여 내 피 튜브 챔버에 보안을 각각 솔루션의 배달 제어.
4. Micropipettes와 날카로운 전극
   참고: 분쇄 및 절연된 내 피 튜브의 기계적인 안정화 펫을 제조 하는 펫 및 위반에 대 한 마이크로 포지 당기 전자 끌어당기는 사람을 사용 하 고 연마 화재.
   1. 부분적으로 소화 동맥 세그먼트에서 adventitia, 부드러운 근육과 내 피 튜브를 분리, 분쇄 펫 (각각 80-120 µ m의 내부 팁 직경), 붕 규 산 유리 모 세관 튜브를 사용 하 여 준비 하 고 화재 폴란드어는 팁.
   2. Superfusion 챔버의 하단에 대 한 내 피 튜브를 보안 하려면 고정 펫 무딘, 둥근 엔드 (열-광택, 100-150 µ m;의 OD 얇은 벽 붕 규 산 유리 관에서 준비).
   3. 내 피 세포의 V_m 를 기록 하려면 준비 ~ 150 ± 30의 팁 저항을 가진 날카로운 전극에서 전자를 끌어당기는 사람을 사용 하 여 유리 모 세관 튜브 m ω.

2입니다. 솔루션 및 약물의 준비

1. 생리 적 소금물 (PSS)
   1. 약 준비와 함께 한 실험에 대 한 PSS를 사용 하 여 1 L의 최소 준비: 140 mM NaCl, KCl, 2mm CaCl₂, 5mm 1 mM MgCl₂, 10 m m N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic 산 (HEPES), 그리고 10 mM 포도 당.
   2. 해 부에 대 한 필요한 솔루션을 준비, 대뇌 동맥의 절연 및 내 피 튜브의 준비 준비 PSS CaCl₂ (제로 캘리포니아^{2 +} PSS) 부족.
   3. 초순 이온된 H₂O에서에서 모든 솔루션을 준비 하 고, pH 7.4 조정 하 고 필터 (0.22 μ m 기 공 크기)를 통해 그들을 소독 한 솔루션 osmolality 290와 300 mOsm 사이 인지 확인 하십시오.
      참고: 솔루션 4 ° C에서 약 2 주 동안 저장할 수 있습니다.
2. 10% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)
   1. 10 %BSA 준비 하려면 10 mL 0 캘리포니아^{2 +} PSS의 비 커에 동결 건조 된 분말의 1 g을 분해.
   2. 파라핀 영화 비 커를 커버 하 고 통과, 해산 BSA에 대 한 느린 교 반으로 몇 시간의 기간을 허용.
   3. 10 mL 주사기 플러스 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 최종 솔루션을 필터링 하 고 1 mL aliquots-20 ° c.에 저장할 수
3. 해 부 솔루션
   1. 해 부 솔루션 50 mL를 준비 하려면 BSA (10%)의 500 µ L 0 캘리포니아의^{2 +} PSS 49.5 mL를 추가 합니다.
   2. 즉시 준비 후에,이 해 부 솔루션 동맥 해 부에 대 한 페 트리 접시에 전송 합니다.
4. 분리 솔루션
   1. 분리 솔루션 50 mL를 준비 하려면 5 µ L CaCl₂ (1 개 M)의 추가 0 캘리포니아의^{2 +} PSS 49.5 ml BSA (10%)의 500 µ L. 실 온 (RT)에 앉아 솔루션을 수 있습니다.
5. 효소
   1. 동맥 세그먼트의 부분 소화, 소화 솔루션 0.31 mg/mL papain, 0.5 mg/mL dithioerythritol, 0.75 mg/mL 콜라 (유형 H 조화)과 0.13 mg/mL elastase의 1 mL를 준비 합니다.
      참고: 효소 활동 다를 수 있습니다; 그러나, 우리의 성공적인 프로토콜에 대 한 상업적으로 제공 된 효소 활동 사용 되었습니다 다음과 같습니다: papain ≥10 단위/mg; mg/콜라 ≥1 단위, N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala 또는 FALGPA 기판 매출;에 대 한 그리고 elastase ≥ 5 단위/밀리 그램.
6. Fura-2 및 약리 에이전트의 준비
   1. Fura-2의 사진 농도 (1 mM) 준비 DMSO에 오전 염료. 로드에 대 한 PSS의 495 µ L에 주식의 5 µ L을 추가 하 여 작업 농도 (10 µ M)를 준비 합니다.
   2. 적절 한 PSS에 약리학 대리인 (예를 들어, ATP)의 농도의 50 mL를 준비 합니다.
7. 솔루션을 실시
   1. 실시 준비 솔루션, 2 M KCl, KCl 이온 H₂O (7.455 g 50 mL H₂O KCl)을 용 해 하 여.
   2. 날카로운 전극 백필 이전 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
8. Propidium 요오드 화물 (0.1%)
   1. 10ml 2 M KCl의 요오드 화 동결 건조 된 propidium의 10 mg을 디졸브.
   2. 잘 혼합 하 고 실시간 저장

3. 해 부 및 대뇌 동맥의 절연

참고: 모든 해 부 절차 스테레오 현미경 및 조명 섬유 광섬유 광원에 의해 제공을 통해 표본 확대 (최대 50 x) 필요 합니다. 두뇌 및 동맥의 격리에 대 한 해 부 절차를 수행 하려면 날카롭게 해 부 악기를 사용 합니다. 서 분리 하 고 동맥을 청소 도구 날카롭게 뾰족한 집게 등 욕실이 스타일 해 부가 위 (3 9.5 m m 블레이드).

1. 마우스 뇌의 격리
   1. Anesthetize는 C57BL/6 마우스 (3-30 개월 이전, 남성 또는 여성)를 통해 흡입 isoflurane (2-3 분 동안 3%), 다음 완전 한 유도 마 취의 직후 동물 목을 벨. 페 트리 접시에 머리를 배치 (직경 10 ㎝, 깊이 1.5 c m) 제로 감기 (4 ° C)를 포함 된 Ca^{2 +} PSS는 stereomicroscope에서.
   2. 현미경을 통해 봅니다, 두개골을 통해 피부와 머리카락을 제거 하 고 감기와 과도 한 혈액 제거 제로 캘리포니아^{2 +} PSS. 절 개는 팁만 표준 해 부가 위 (예를 들어,: 24 m m 블레이드)의 시작 후 두 뼈 및 두개골의 코 뼈를 통해 확장을 사용 하 여 확인 합니다.
   3. 절 개는 그대로 원형 윌리스와 함께 뇌를 분리 거친 밀고 집게, 그리고 별도 결합 조직을 사용 하 여 함께 신중 하 게 두개골을 엽니다.
      참고: 또는, Littauer 뼈 절단 집게를 두개골을 열고 뇌를 노출 사용할 수 있습니다.
   4. 부드럽게 감기와 격리 된 두뇌 세척 제로 캘리포니아^{2 +} 혈액을 제거 하는 비 커에 PSS. 뇌 복 부 측을 대뇌 동맥 (그림 1A)의 절연을 위한 차가운 해 부 솔루션을 포함 하는 챔버에 향하도록 놓습니다.
2. 대뇌 동맥의 절연
   참고: 후부 대뇌 동맥이이 프로토콜에 대 한 대표적인 뇌혈관 내 피 연구 모델로 선정 되었습니다.
   1. 스테인레스 스틸 핀을 사용 하 여 차가운 해 부 솔루션에서 격리 된 두뇌 확보 (직경 0.2 m m, 길이 ~ 11-12 m m) 숯 주입 실리콘 폴리머 코팅 유리 페 트리 접시의 하단 (깊이 50 cm)를 삽입할 수.
   2. 해 부 동안 PSS의 냉장된 온도 유지, 지속적으로 1:1 물-에틸렌 글리콜 혼합물을 순환 냉각 시스템에 의해 냉각 해 부 챔버를 사용 합니다. 또는 해 부 신선한 얼음에 수행할 수 있습니다.
   3. 수술 후부 통신 후부 대뇌 동맥 (0.5 cm 세그먼트에 ~0.3, 아니 축 긴장)와 서 악기 욕실이 스타일 위와 날카롭게 뾰족한 집게 (그림 1B 사용 하 여 두개골 기저 부 동맥을 분리 ). 스테인레스 스틸 핀을 사용 하 여 (직경 0.1 m m, 길이 13 ~-14 m m)를 보안 둘 다 고립 된 페 트리 접시 (그림 1C)에 해 부 솔루션에 후부 대뇌 동맥.
   4. 결합 조직 날카롭게 뾰족한 집게 (그림 1D)를 사용 하 여 제거 하 여 격리 된 후부 대뇌 동맥을 신중 하 게 청소. 세그먼트로 그대로 동맥을 잘라 (길이 1-2 m m) (그림 1D; 인세트) 효소 소화.

4입니다. 내 피 튜브 및 Superfusion의 준비

참고: 내 피 튜브는 앞에서 설명한¹², 대뇌 동맥⁶수정 준비가 되어 있습니다.

1. 목표 (10 배, 20 x 40 x), 카메라, 및 챔버와 micromanipulators는 알루미늄 단계 현미경을 사용 하 여 분쇄 장치를 준비 합니다. 무대와 견본 (그림 2A)에 인접 한 펌프 컨트롤러는 microsyringe를 보안 합니다.
2. 완전히 백필은 분쇄 미네랄 오일 플라스틱 하 고 마이크로 주사기 피스톤을 통해 그것을 확보. 그런 다음에 피펫으로 분리 솔루션 철회 마이크로 주사기 펌프 컨트롤러를 사용 하 (~ 130 nl) 위에 피 펫에서 공기 방울의 부재를 보장 하면서 미네랄 오일.
3. 0.31 mg/mL papain, 0.5 mg/mL dithioerythritol, 0.75 mg/mL 콜라, 그리고 0.13 mg/mL elastase 10 mL 유리 튜브 (그림 2B)에 분리 솔루션의 1 mL에 그대로 동맥 세그먼트를 놓습니다. 부분적인 소화에 대 한 10-12 분 34 ° C에서 품 어.
4. 따라 소화, 효소 솔루션을 ~ 5 mL 신선한 분리 솔루션의 바꿉니다. 실시간에서 분리 솔루션이 포함 된 챔버에 한 세그먼트를 전송 1 mL 피 펫을 사용 하 여,
5. 피펫으로 챔버에서 분리 솔루션에 배치 하 고는 소화의 1 개의 끝에 가까운 위치. 펌프 용 컨트롤러에 부드러운 분쇄 (그림 2C, 삽입) 2 ~ 5 nL/s의 범위 내에서 속도 설정 합니다.
6. 100 x 200 x 확대를 통해 보기, 철회 하 고 부드러운 근육 세포는 내 피 튜브를 생산 하는 동안 해리를 동맥 세그먼트를 추출. 필요한 경우, 신중 하 게 사용 하 여 뾰족한 집게 내 피 튜브에서 별도 해리 adventitia 및 내부 탄력 있는 lamina. 모든 부드러운 근육 세포는 해리만 내 피 세포는 그대로 "튜브" (그림 2C)로 유지 확인 합니다.
7. Micromanipulators를 사용 하 여, 펫 (그림 2D)를 고정 하는 붕 규 산 유리를 사용 하 여 superfusion 챔버의 유리 커버 슬립에 내 피 튜브의 각 끝을 보안 합니다.
8. 워시 아웃 adventitia 및 평활 근 세포 챔버 및 바꾸기 2 mm CaCl₂ PSS 분리 솔루션에서 해리 했다. Superfusion 및 실험 장비의 현미경에 보안된 내 피 튜브와 모바일 플랫폼을 전송 합니다.
9. PSS 및 각각 마약 솔루션의 지속적인 납품을 위한 6 깨끗 한 50 mL 저수지 (그림 3A)를 사용 하 여 적절 한 실험 기간 동안. 인라인 흐름 제어 밸브를 사용 하 여 수동으로 설정 하려면 전체 유량 층 류와 진공 흡입을 피드 하는 흐름을 일치 하는 동안. 배경 데이터와 염료 로드를 기록 하기 전에 챔버 (그림 3B) ≥ 5 분 내 피 튜브의 superfusion에 대 한 PSS 제공 합니다.

5. 염료 부하, 워시 아웃 및 온도 설정

1. [캘리포니아^{2 +}]_나측정 광도 측정 시스템의 모든 구성 요소를 켭니다. 실험 장비 (그림 3C)에 현미경을 사용 하 여 광도 측정 시스템 소프트웨어 제품군을 사용 하 여 광도 창 셀에 400 배 확대와에서 내 피 튜브 볼.
2. 내 피 튜브의 직경을 측정 하 고 340 및 380 nm (≥10 Hz) 대체 여기 동안 510 nm 방출에 배경 autofluorescence 값을 기록 합니다.
3. [캘리포니아^{2 +}]_나 응답을 측정 하기 위해 부하 Fura-2 내 피 튜브 RT에 (10 µ M 최종 농도)를 염색 오전 및 ~ 30-40를 허용 빛의 부재에 분.
4. Superfusion ~ 30-40에 대 한 신선한 PSS와 내 피 튜브의 다시 시작 워시 아웃 분 염료를 초과 하 고 세포내 Fura-2 드 esterify 야. 워시 아웃 기간 동안 RT에서 점차적으로 온도 37 ° c에서 인라인 히터로 온도 컨트롤러 (그림 3A)를 사용 하 여 다음 실험에 걸쳐 37 ° C에서 유지 합니다.
   참고: 권장된 증분 전환 RT 37 ° C에 ≥5 분 평형 시간 각 단계에서 3 단계를 (예: 5 ° C)을 수반 한다.

6. [캘리포니아^{2 +}]_i 와 V_m 동시 측정

1. 다른 모든 장비 및 V_m 를 측정 하기 위한 전위 계 소프트웨어 제품군 ( 그림 3, 그림 4참조). 그에 따라 데이터 수집 속도 조정 (≥10 Hz).
2. 날카로운 전극 및 2 M KCl 백필을 당겨. 세포의 연구에 대 한 커플링 염료 전송, 백필 통해는 microelectrodes 0.1 %propidium 요오드 화물 2 M KCl에에서 녹아 있는 함께.
3. 실버 와이어는 micromanipulator 확보 하는 전위 계 머리 단계에 연결 된 피 펫 홀더에 염화 코팅에 전극을 보호 합니다. micromanipulator를 사용 하 여 간단히 4 x 목표 통해 보는 동안 챔버에 흐르는 PSS에 전극의 팁의 위치.
4. 휴식 V_m 0 설정 일치 접지 목욕으로 잠재적인 합니다. 그냥 내 피 튜브의 셀 위에 전극의 끝을 놓습니다. 원하는 경우 가청 기준선 모니터 electrometers에 연결을 사용 하 여 잠재적인 녹음 사운드 피치 연관.
5. 40 x 목표를 사용 하 여 x 400 배율 증가 하 고 필요에 따라 전극의 팁 위치. 50 ~ ~ 80 내 피 세포에 초점을 광도 측정 소프트웨어를 사용 하 여 광도 창을 조정 합니다.
6. 부드럽게 전극은 micromanipulator를 사용 하 여 내 피 튜브의 셀 중 하나에 놓고 안정 휴식 V_m 에 대 일 분을 기다립니다. 마찬가지로, 첫 번째 전극으로 찔 려 첫 번째 셀에서 다른 셀 (거리 ≥100 µ m)에서 두 번째 전극을 삽입 합니다.
7. V_m 를 휴식 하는 것입니다 그것의 예상 값에 안정 되 면 (-40-30 mV)⁶, 빛의 부재에 형광 인터페이스에 PMT 설정 하 고 또는 세포내 [캘리포니아^{2 +}]_내가 흥미로운 Fura-2의 수집을 시작 (10 Hz)에 510에서 형광 방출 수집 하는 동안 340 및 380 nm nm.
   참고: 세포 전기 커플링, 현재 테스트 (± 0.5-3 나, ~ 20의 펄스 기간) "사이트 1", 전위 계 를 통해 하나를 배달 될 수 있다 그리고 V_m 의 변경으로 다른 전위 계를 기록 될 수 있습니다 "사이트 2" (거리 ≥100 µ m).
8. V_m 및 [캘리포니아^{2 +}]_나 의 동시 측정, 설정 한 후 약물의 적용 전에 일정 층 유량에 PSS 함께 내 피 튜브의 superfusion에 대 한 ~ 5 분 수 있습니다.
9. 일정 유량과 superfusion 챔버를 PSS에 준비 약물 (예를 들어, ATP)를 적용 합니다. 후 ~ 3 분 (또는 약의 활동에 대 한 적절 한 기간), PSS V_m 까지 세척과 F₃₄₀/F₃₈₀ 비율 그들의 초기 조건에 반환합니다. 솔루션의 각 전환 중 광도 전위 계 소프트웨어 스위트를 통해 일시적으로 동기화로 각각 녹화를 표시 합니다.
10. 실험 완료 되 면, 전극은 micromanipulator를 사용 하 여 셀에서 철회 고 V_m ~ 0 mV 목욕 전극에 의해 참조 된로. V_m 및 [캘리포니아^{2 +}]_나 의 각각 녹음을 중지 하 고 파일에 데이터 분석에 대 한 레코드를 저장.

7. 셀 커플링의 시각화

1. 셀 커플링을 통해 propidium 요오드 화물을 시각화 하려면 사용 40 x 또는 60 x 형광 목표는 상대적으로 높은 수 가늠 구멍 (예: 0.95) 및 솔리드 스테이트 조명, 고해상도 카메라 (예: 16-rhodamine 필터 설정 메가 픽셀), 및 이미징 소프트웨어 제품군.

결과

위에서 설명한 프로토콜의 도식 데모 연결 된 그림에 표시 됩니다. 두뇌는 젊은 성인 남성 C57BL/6N 마우스 (5 개월)에서 고립 된 그림 1A에 표시 됩니다. 후부 대뇌 동맥은 윌리스의 원, 결합 조직, 없이 제거 하 고 (그림 1B-D) 세그먼트로 잘라에서 신중 하 게 격리 됩니다. 부분적으로 소화 동맥 세그먼트에서 그대로 내 피 튜브 생산 이며 고정 펫을 사용 하 여 유리 커버 슬립에. 부드러운 기계 스트레치 선박 tortuosity 없이 선형 vivo에서 길이을 두 고정 펫을 사용 하 여 적용 됩니다. 이 원고 (그림 2A-D)에 더 명확히 되었습니다. 후부 대뇌 동맥에서 분리 된 내 피 튜브는 ~ 90-100 µ m 폭 및 ≥300 µ m ...

토론

최근 개발^6,15,,1617에 비추어 우리 지금 [캘리포니아^{2 +}]의 동시 측정을 위한 준비에 마우스 대뇌 동맥 내 피 분리 하는 방법을 보여 줍니다. _i 및 V_m EDH 일관 되 게 ~ 2 h 37 ° c.에 대 한 기본 비록 기술적으로 어려운 우리 셀-커플링 뿐 (참조⁶, 그림 1 참조)을 측정할 수 있습니다. 이러한 방식으로 우리 이산 하 고 실시 하는 이벤트를 동시에 신호를 측정할 수 있습니다. 마우스 동맥 피를 분리 하는 동안 직면 하는 일반적인 과제의 계정에 대 한 참조^11,12를 참조 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
포도	시그마 - 알드리치 (미국 미주리 주 세인트루이스)	G7021
NaCl	시그마	S7653
MgCl 2 < / sub>	Sigma	M2670
CaCl2 < / sub>	Sigma	223506
HEPES	시그마	H4034
KCl	시그마	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (미국 펜실베이니아 주 피츠버그)	A466250
콜라겐 분해 효소 (H 형 블렌드)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
플렉시글라스 수퍼퓨전 챔버	워너 인스트루먼트, 캠든, CT, USA	RC-27
유리 커버슬립 바닥 (2.4  &시간;   5.0  cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
아노다이즈드 알루미늄 플랫폼 (지름: 7.8  cm)	워너 인스트루먼트	PM6 또는 PH6
컴팩트 알루미늄 스테이지	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
마이크로매니퓰레이터	Siskiyou	MX10
실체현미경	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
광섬유 광원	Schott, 마인츠, 독일 & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon 반전 현미경	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
위상차 대물렌즈	니콘 인스트루먼트 Inc	( Ph1 DL입니다. 10X & 20X)
형광 대물렌즈	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) 및 40X (Plan Fluor)
Nikon 반전 현미경	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
마이크로 주사기 펌프 컨트롤러 (Micro4 )	World Precision Instruments(WPI), 미국 플로리다주 새러소타	SYS-MICRO4
진동 절연 테이블	기술 제조, 미국 매사추세츠주 피바디	nbsp; Micro-g
증폭기	분자 장치, 미국 캘리포니아주 서니베일	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
헤드스테이지	분자 장치	HS-2A 및 HS-9A
함수 발생기	EZ Digital, 대한민국	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, 미국 플로리다주 새러소타	BM-A-TM
디지털 스토리지 오실로스코프	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
형광 시스템 인터페이스, 아크 램프 + 전원 공급 장치, 하이퍼스위치, PMT	분자 장치, 미국 캘리포니아주 서니베일	IonOptix 시스템
온도 컨트롤러	워너 인스트루먼트	TC-344B 또는 C
인라인 히터	워너 인스트루먼트	SH- 27B
밸브 컨트롤러	워너 인스트루먼트	VC-6
인라인 플로우 컨트롤 밸브	워너 인스트루먼트	FR-50
전자 풀러	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 또는 P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA&	nbsp; MF-900
붕규산 유리관 (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
붕규산 유리관 (핀닝)	Warner Instruments	G150T-6
붕규산 유리관 (날카로운 전극)	Warner Instruments	GC100F-10
주사기 필터 (0.22 µ m)	ThermoFisher Scientific	722-2520
유리 페트리 접시 + 숯 실가드	생활 시스템 기기, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas 스타일 가위 (3 mm & 9.5  mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
가위 3 & 7 mm 블레이드	Fine Science Tools (또는 FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	듀몽 #5 & 뒤몽 #55