조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 차동 품질의 정자 컬렉션

Summary

이 논문에서 우리 밀도 그라데이션 원심 분리 기술 및 정자 생리학 연구에 응용 프로그램의 성능에 설명 하고자 합니다.

Abstract

유성 생식, 남성 배우자 또는 정자 세포의 수정에 대해 여성 배우자와 퓨즈. 그러나, 많은 수의 능력을 기름과 정자 세포 수정 되도록 여성 생식 체와 상호 작용 해야 합니다. 따라서, 개별 정자 세포의 기름 능력은 성공적인 재생산에 대 한 중요 합니다. 조밀도 기온 변화도 원심 분리 수집 보조 생식 기술에 사용 될 양질의 정자를 재현할 수, 빠르고, 효율적, 효과적이 고 매우 융통성 있는 방법으로 몇 십년 동안 활용 되었습니다. 그들의 품질에 의해 닭의 3 가지 인구를 분리 하는 불연속 Percoll 밀도 그라데이션 원심 (PDGC) 기술 활용에 초점을 우리는 여기에 설명 된 프로토콜. 우리는 낮은, 중간 및 높은-품질 정자를 수집할 수 있었다. 우리는 또한 그들의 생존, 이동성 및 관통 성을 평가 하 여 정자의 결정 불 임 가능성을 수반 재현 가능한 프로토콜 설명 합니다. 컬렉션의 PDGC 기술을 사용 하 여 그들의 품질에 의해 정확 하 게 도움이 될 것 이다 고 철저 하 게 차동 임신 가능성과 정자를 특성화 하십시오.

Introduction

척추 동물, 남성 gametes 받아야 강렬한 선택적 압력; 따라서 남자의 생식 적합성은 달성 성공적인 수정에 대 한. 어떤 주어진 척 추가 있는 종의 남성 수정 요구를 충족 하기 위해 정자 세포와 충분 한 품질의 대량에서 생산을 수 있어야 합니다. 정자 세포, 정자 머리와 편, 본문에 가장 편광된 세포 이다. 그들은 또한 정자의 품질에 매우 이질적인 (살고 죽은, 형태학 상으로 정상적인 비정상적인, 그리고 움직이기 힘 드는, 낮은 모바일 및 모바일)는 수 컷의 생식 효율성에 다양 한 변화를 통해 드러났습니다. 더는, 높은-품질, 성공적으로 ovum를 기름 지 게 하는 데 필요한 matings의 적은 수의 비율 그러나, 비 옥을 달성, 형태학 상으로 정상적인 정자 세포에 의존 그들의 flagella 수정 뿐만 아니라 zona pellucida¹ 관통로 사이트에 도달 하 여 생성 하는 추진력이 세력 (ZP; 포유류의 경우) 또는 내부 perivitelline ² 레이어 (IPVL; 조류와 파충류) 자연 교배 또는 인공 수정 (AI)에 따라 알의. 정자를 결정 질 보조 생식 기술³ (예술)에 사용 하기 위해 필요 하며 다양 한 번 식 남성 인공 지능에 사용 될 프로그램....

Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 조지아 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 전통적인 원심 분리를 사용 하 여 세척

1. 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS)를 준비 합니다. 8.0 g의 NaCl, KCl, 1.44 g Na₂HPO₄ 의 KH₂포₄ 800 mL의 증류수 (dH₂O)의 0.24 g의 0.2 g을 추가 합니다. 0.1 N HCl을 사용 하 여 7.4에 pH를 조정 하 고 1 l dH₂o.를 사용 하 여 솔루션을가지고
2. 운동 성 버퍼를 준비 합니다. 6.5 g의 NaCl, 포도 당, 0.444 g CaCl₂ 와 n-트리 스-[hydroxymethyl] 11.5 g의 4.5 g 추가 메 틸-2-아미노-ethanesulfonic 산 (TES) dH₂오의 800 mL 1 M NaOH를 사용 하 여 7.4에 pH를 조정 하 고 1 l dH₂o.를 사용 하 여 솔루션을가지고
3. 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 관으로 정액의 0.5 mL를 플라스틱. PBS의 1.0 mL를 추....

Results

PDGC 기술 모든 매개 변수를 통해 품질의 정도 의해 정자의 3 개의 층의 뚜렷한 구분에서 결과. 정자는 높은 밀도 솔루션, 높은 낮은 밀도 솔루션 및 낮은 밀도 솔루션 위에 낮은 품질 레이어 사이의 중간 품질 계층 아래의 높은-품질 계층으로 분리합니다. 품질에 이러한 차이 생존 (그림 4), 이동성 (그림 5) 관통 (그림 6)의 명확한 차이 의해 입증 됩니다. 정자는 PDG의 높은-품질 계층에서 격리 증가 전통적으로 씻어 샘플의 상대적인 모든 세 개의 매개 변수 전시. 모든 테스트 매개 변수를 통해 그 레이어 PDGC에 의해 분리 시 중간 및 낮은 품질 표시 온건 하 고, 각각,로 감소 합니다.

Discussion

다 산 동물 생산의 수익성 결정 뿐만 아니라 또한의 존재에 대 한 자연 선택의 수단으로 서 역할. 정자 세포의 궁극적인 기능은 ovum를 기름 지 게 하는 것 이다. 여성의 수 란 관 알^23,24의 수정 있도록 그 적자 정자만을 선택 합니다. 생체 외에서 연구도 질적 정자 특성과 수정 성공^4,11,,2324사이 가까운 상호 관계를 계시 했다. 감소 된 비 옥 정자^4,,1125의 품질이와 연결 됩니다. 이와 같이, 그것.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accudenz	Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA	AN7050
Percoll	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	P7828
쉬프 s 시약	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	3952016
TES	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	T1375
Eosin Y	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	E4009
Nigrosin	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	198285
ST 40R 원심분리기	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	75004524
DU 530 Life Sciences UV/Vis 분광 광도계	Beckman Coulter, Brea, CA, USA		카탈로그를 찾을 수 없습니다
Olympus IX 71 도립 형광 및 위상차 현미경	Olympus America Inc., PA, USA		카탈로그를 찾을 수 없습니다.