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방법 논문

조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 차동 품질의 정자 컬렉션

20.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58833

⸱

2018년 11월 29일

 ,  , 
1Department of Poultry Science, University of Georgia

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 논문에서 우리 밀도 그라데이션 원심 분리 기술 및 정자 생리학 연구에 응용 프로그램의 성능에 설명 하고자 합니다.

초록

유성 생식, 남성 배우자 또는 정자 세포의 수정에 대해 여성 배우자와 퓨즈. 그러나, 많은 수의 능력을 기름과 정자 세포 수정 되도록 여성 생식 체와 상호 작용 해야 합니다. 따라서, 개별 정자 세포의 기름 능력은 성공적인 재생산에 대 한 중요 합니다. 조밀도 기온 변화도 원심 분리 수집 보조 생식 기술에 사용 될 양질의 정자를 재현할 수, 빠르고, 효율적, 효과적이 고 매우 융통성 있는 방법으로 몇 십년 동안 활용 되었습니다. 그들의 품질에 의해 닭의 3 가지 인구를 분리 하는 불연속 Percoll 밀도 그라데이션 원심 (PDGC) 기술 활용에 초점을 우리는 여기에 설명 된 프로토콜. 우리는 낮은, 중간 및 높은-품질 정자를 수집할 수 있었다. 우리는 또한 그들의 생존, 이동성 및 관통 성을 평가 하 여 정자의 결정 불 임 가능성을 수반 재현 가능한 프로토콜 설명 합니다. 컬렉션의 PDGC 기술을 사용 하 여 그들의 품질에 의해 정확 하 게 도움이 될 것 이다 고 철저 하 게 차동 임신 가능성과 정자를 특성화 하십시오.

서론

척추 동물, 남성 gametes 받아야 강렬한 선택적 압력; 따라서 남자의 생식 적합성은 달성 성공적인 수정에 대 한. 어떤 주어진 척 추가 있는 종의 남성 수정 요구를 충족 하기 위해 정자 세포와 충분 한 품질의 대량에서 생산을 수 있어야 합니다. 정자 세포, 정자 머리와 편, 본문에 가장 편광된 세포 이다. 그들은 또한 정자의 품질에 매우 이질적인 (살고 죽은, 형태학 상으로 정상적인 비정상적인, 그리고 움직이기 힘 드는, 낮은 모바일 및 모바일)는 수 컷의 생식 효율성에 다양 한 변화를 통해 드러났습니다. 더는, 높은-품질, 성공적으로 ovum를 기름 지 게 하는 데 필요한 matings의 적은 수의 비율 그러나, 비 옥을 달성, 형태학 상으로 정상적인 정자 세포에 의존 그들의 flagella 수정 뿐만 아니라 zona pellucida1 관통로 사이트에 도달 하 여 생성 하는 추진력이 세력 (ZP; 포유류의 경우) 또는 내부 perivitelline 2 레이어 (IPVL; 조류와 파충류) 자연 교배 또는 인공 수정 (AI)에 따라 알의. 정자를 결정 질 보조 생식 기술3 (예술)에 사용 하기 위해 필요 하며 다양 한 번 식 남성 인공 지능에 사용 될 프로그램4. 다른 한편으로, 예술의 성공 정자 품질의 정확한 평가에 전적으로 의존합니다. 실험실 테스트의 여러 정자의 기능적 특성을 결정 하기 위해 개발 되었습니다. 가장 중요 한 매개 변수는 정자 형태, 생존, 이동성, capacitation (조류 정자 capacitation5필요 하지 않습니다), acrosome 반응 (AR; exocytosis 및 정자 머리의 acrosome에서 분해 효소의 방출), 정자 ZP 또는 IPVL, 및 수정6,7,,89,10,11침투 혼자 산의 조치는 정자 인구11의 기름 능력의 정확한 평가 제공 하지 않습니다. 계란의 풍부로 이어지는 여러 이벤트의 개별 spermatocytes7의 성능에 대 한 적절 한 표현을 하실 수 있습니다.

정자 기능을 측정 하기 위한 개발 방법론은 주로 종의. 예를 들어 조류 정자 생존, 이동성 및 IPVL의 침투에 정자 품질8,,1112를 평가 하는 데 사용 하는 가장 일반적인 매개 변수. 라이브 정자는 정액에 수 정액에 죽은 정자의 많은 수의 존재는 정자의 품질에 영향을 정자의 생존을 위해 중요 한 역할을 한다. 이 정액에 반응 산소 종의 생산을 강화 하 고 라이브 정자13에 산화 손상을 초래. 정자 이동성, 체온, 저항에 대 한 조류의 flagellar 움직임에 대 한 용량 수정8에서 직접적인 역할을 알려져 있습니다. 그것은 그 임신과 긍정적으로 상관 성과, 그러므로, 다 산8의 기본 결정 잘 설립. 그러나, 모바일 정자는 AR을 IPVL11을 침투 하는 기능에도 필요 합니다. IPVL 침투 분석 실험 수정11과정 참여 하는 모든 정자에 대 한 고려.

아트의 응용 프로그램에서 사정 일반적으로 높은-품질 정자의 농도 극대화 하 고 낮은 품질 정자의 농도 최소화 하기 위해 처리 됩니다. 수령 후 정액의, 높은-품질 정자의 비율 일반적으로 업계 및 연구 관행에 사용 되는 정자 분리 절차를 통해 농축 수 있습니다. 이 절차의 많은 개발 되었습니다, 각각 장점 및 한계, 하지만 모두 높은 기름 능력을 가진 정자만을 수집 하는 정자의 이질적인 본질을 활용. 이러한 절차 등 정자 마이그레이션 방법, 준수 열과 밀도 그라데이션 원심 (DGC)14,15,,1617,18,19 , 20. 사용 가능한 기술 중 DGC 아주 간단 하, 반복, 비용 효율적인 고 수정14 의 기회 확대의 목표와 함께 예술에 사용 하기 위해 높은 품질의 최대 금액을 분리에 효율적인 발견 되었습니다 , 15. 더하여, DGC는 정자 세포 막에 해 롭 다. 대조적으로, 정자 마이그레이션 방법 수집만 점차적으로 모바일 정자18,19, 하지만 수집 된 정자의 수량은 매우 낮은 비효율적인 정자18, 의 큰 볼륨을 수집에 그것을 만드는 20. 준수 열 여과 정액17;에서 높은 모바일 정자 필터링에 매우 효율적입니다 그러나, 그것은 정자 세포 막20,21에 해가 될 경향이 있다.

DGC 기술에 밀도 그라디언트를 생성 하기 위한 가장 일반적으로 사용 되는 기판은 Percoll, polyvinylpryrolidone에 코팅 하는 콜 로이드 실리 카 입자를 이루어져 있는. Percoll 조밀도 기온 변화도 원심 분리 (PDGC) 연속 또는 불연속 수 하지만 불연속 그라데이션은 높은 모바일 정자13,,1620의 고수익 격리에 대 한 가장 일반적으로 사용 된다. 불연속 그라데이션에서 낮은 밀도 미디어 그라디언트는 원뿔 튜브의 하단에 상단에서 밀도 증가 만드는 높은 밀도 미디어 위에 수레. 이 서로 다른 밀도의 두 매체 간의 인터페이스에서 경계를 만듭니다. PDGC의 효율성은 두 가지 요소에서 파생 된: 개별 정자 세포의 2) 경향이 높은 구조적 무결성과 정자 세포의 증가 밀도가지고 1) 추진력이 능력. 더 높은 기동성을 가진 정자 더 낮은 밀도 미디어에서 교차 하 고 더 높은 밀도 미디어에 침투 수 있습니다. 낮은 이동성 정자 서로 다른 밀도의 미디어 간의 인터페이스에 의해 만들어진 경계에서 덫을 놓아 될 가능성이 더 높습니다. 높은 구조적 무결성 및 이동성 정자 세포 죽은, 비정상적인 또는 낮은 모바일 정자 세포 보다 더 높은 밀도가지고 경향이 있다. PDGC에서 원심력을 적용 하면이 그들의 각각 장소에서 서로 다른 밀도와 정자의 이동 용이.

일반적인 연습, PDGC 수행 된 후 원뿔 튜브의 하단에 잠재적인 높은 비 옥을 가진 정자의 부드러운 펠 릿을 수집 하 고 나머지 삭제 됩니다. 그러나,이 기법은 충분히 장점을 품질 차이에 따라 여러 그룹으로 정자 세포를 분리 하는 기능입니다. 연구 목적에 대 한 PDGC 기법을 활용 하 여 품질의 정도 의해 정자의 분리 생리, metabolomic 및 proteomic 다름에 관련 된 정자 품질 연구에 대 한 수 있습니다. 여기, 우리는 성과 정자-IPVL에 대 한 생존 능력에 대 한 중요 한 얼룩 이전 설립된 오신-nigrosin, Accudenz 분석 결과 사용 하 여이 기술을 사용 하 수 있습니다 품질, 이러한 차이 보여 뿐 아니라 품질, 정자를 분리 하는 방법을 자세히을 목표로합니다 관통에 대 한의 상호 작용 시험

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 조지아 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 전통적인 원심 분리를 사용 하 여 세척

  1. 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS)를 준비 합니다. 8.0 g의 NaCl, KCl, 1.44 g Na2HPO4 의 KH2포4 800 mL의 증류수 (dH2O)의 0.24 g의 0.2 g을 추가 합니다. 0.1 N HCl을 사용 하 여 7.4에 pH를 조정 하 고 1 l dH2o.를 사용 하 여 솔루션을가지고
  2. 운동 성 버퍼를 준비 합니다. 6.5 g의 NaCl, 포도 당, 0.444 g CaCl2 와 n-트리 스-[hydroxymethyl] 11.5 g의 4.5 g 추가 메 틸-2-아미노-ethanesulfonic 산 (TES) dH2오의 800 mL 1 M NaOH를 사용 하 여 7.4에 pH를 조정 하 고 1 l dH2o.를 사용 하 여 솔루션을가지고
  3. 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 관으로 정액의 0.5 mL를 플라스틱. PBS의 1.0 mL를 추가 하 고 부드럽게 혼합.
  4. 실 온 (RT)에서 10 분 동안 1500 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제. PBS 가진 정자 펠 릿 resuspend 최대 1.5 mL.
  5. 실시간 Resuspend 정자 운동 성과 펠 렛에 10 분 동안 1500 x g에서 원심 분리기 0.5 mL를 버퍼링 합니다.

2. 수행 PDGC 기술

참고: 실 온에서 PDGC의 전체 프로세스를 수행 합니다.

  1. 두 개의 별도 튜브에 1.08 g/mL와 1.07 g/mL Percoll 솔루션의 3.0 mL를 확인 합니다.
    1. 깨끗 한 테스트 튜브에서 1.13 g/mL의 1.712 mL 추가 1.5 M NaCl 솔루션의 0.3 mL에 원래 Percoll. DH2O 0.988 mL를 추가 하 고 혼합 밀도 솔루션 1.08 g/mL의 3.0 mL 수 있도록 부드러운 반전 함으로써.
    2. 깨끗 한 테스트 튜브에서 1.13 g/mL의 1.482 mL 추가 1.5 M NaCl 솔루션의 0.3 mL에 원래 Percoll. DH2O 1.218 mL를 추가 하 고 혼합 밀도 솔루션 3.0 mL 1.07 g/mL의 수 있도록 부드러운 반전 함으로써.
  2. 깨끗 한 테스트 튜브, PBS의 2.0 mL와 정액 샘플 1: 2의 1.0 mL를 희석. 부드럽게 pipetting으로 혼합.
  3. 피펫으로 멸 균 15 mL 원뿔 튜브에 1.07 g/mL 밀도 솔루션의 3.0 mL. 조심 스럽게 피펫으로 1.07 g/mL 밀도 솔루션 아래 1.08 g/mL 밀도 솔루션의 3.0 mL. 두 개의 레이어를 혼합 하지 마십시오 확인 하십시오. (9)에 파스퇴르 피 펫 긴 형태의이 단계를 쉽게 만들 수 있습니다.
  4. 피펫으로 희석된 정액 샘플의 3.0 mL는 PDG을 솟 다. 정액 샘플은 PDG 혼합 하지 되도록 부드럽게 45 ° 각도로 PDG를 포함 하는 원뿔 튜브 기울기. 피펫으로 튜브의 벽을 따라 샘플 튜브는 PDG를 통해 흐름을 허용.
  5. 일치 하는 중첩 샘플 PDG의 질량을 빈 튜브를 준비 합니다. 20 분 조심 균형 그리고 원심 분리기는 벤치에서 튜브를 전송 하는 동안 불연속 그라디언트를 유지 하기 위해 두 튜브 1500 x g에서 원심.
    참고: 원심 분리의 끝에는 브레이크를 사용 하지 마십시오.
  6. 결과 관찰 합니다. 그림 1에서 보듯이 3 가지 정액 레이어는 튜브에 형성을 확인 합니다.
  7. 고립 된 정액 레이어는 피 펫과 발음 정액의 상위 레이어를 먼저 수집, 중간 둘째, 레이어 그리고 마지막으로 튜브의 하단에 하드 펠 릿. 깨끗 하 고 멸 균 폴 리 프로필 렌을 각각 전송microcentrifuge 튜브.
  8. 1.5 ml PBS 가진 각 샘플을 희석. 10 분 동안 1500 x g에서 원심.
  9. 상쾌한을 붓는 다. 부드러운 pipetting으로 정자 운동 성 버퍼와 펠 릿을 다시 구성.
    참고: 대체 밀도 조사 요구에 맞게 사용할 수 있습니다. V0 가 재고 조밀도 솔루션의 볼륨은 다음 수식을 사용 하는 재료의 사용, v 솔루션, p의 최종 볼륨 원하는 최종 밀도 솔루션의 밀도 이며 p0 은 재고 조밀도의 밀도 확인 해결 방법:
    속도 보정 방정식, \(v_0 = v \times \frac{p - 1.0058}{p_0 - 1}\), 과학 공식.
    생리 식 염 수의 NaCl 농도 맞게 1.5 M NaCl의 0.3 mL 밀도 솔루션의 준비에 항상 사용 합니다.

3. 정자의 품질을 결정

  1. 정자 농도 앞22에서 설명한 계산 합니다.
  2. 오신 nigrosin 중요 한 앞에서 설명한12 다음 수정으로 얼룩을 수행:
    1. 1 x 108 셀/mL의 농도에서 정자 솔루션의 100 µ L를 준비 합니다.
    2. 피펫으로 50 µ L 오신 nigrosin 얼룩의 동일한 볼륨을 포함 하는 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 관에서 정자 솔루션의. 실 온에서 5 분을 위한 혼합물을 품 어.
    3. 20 µ L 유리 슬라이드의 한쪽 끝에 묻은 정액 샘플의 드롭 고 혈액 사용에 유사한 방식으로 균일 하 게 얼룩 얼룩. 흔들린된 슬라이드 3-5 분 동안 실 온에서 건조
    4. 현미경 얼룩을 관찰 합니다. 라이브 정자 (얼룩) 및 (핑크 스테인드) 죽은 정자의 수를 계산 하 고 라이브 정자의 비율을 계산.
  3. Accudenz 분석 결과, 이전 치킨 정자, 정자 이동성8 다음 수정를 객관적으로 평가 대 한 유효성 검사를 수행.
    1. 그림 2에서 볼 수 있듯이 6%의 1.0 mL를 피펫으로 폴리스 티 렌 큐 벳에 솔루션 분석 결과. 41 ° c.에 품 어
      참고: 41 ° C는 암 탉의 내부 온도 일치 하는 데 사용 됩니다. 부 화 온도 조사 되 고 종족의 여성 생식 관의 일치 해야 합니다.
    2. 5 x 108 셀/mL의 농도에서 정액 샘플의 100 µ L로 preheated 분석 결과 솔루션을 오버레이.
    3. 장소 베트를 포함 하는 분 광 광도 계에 정자 샘플을 중첩. 550에서 흡 광도 값 기록 nm.
  4. 앞에서 설명한11 다음 수정으로 IPVL 침투 시험을 수행.
    1. 그대로 IPVL의 비 새싹 디스크 영역의 조각 (0.5 cm x 0.5 cm)를 잘라.
    2. 4 x 106 셀/mL을 정자 농도 조정
    3. 그림 3에서 볼 수 있듯이 37 ° C에서 15 분 동안 유리 제 작은 유리병에서 IPVL와 운동 성 버퍼에 정자를 품 어.
    4. 3%에서 IPVL 부분을 담가 NaCl IPVL과 정자 사이 상호 작용을 중지.
    5. IPVL 조각 현미경 슬라이드와 20에 대 한 10% 포 르 말린으로 고정을 다음 10 분 동안 Schiff의 시 약으로 얼룩에 탑재 s.
    6. 성공적인 정자에 대 한 현미경 IPVL 침투 구멍을 관찰 하 고 40 배 확대에 0.25 m m2 당 모든 보이는 구멍의 수를 계산.

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결과

PDGC 기술 모든 매개 변수를 통해 품질의 정도 의해 정자의 3 개의 층의 뚜렷한 구분에서 결과. 정자는 높은 밀도 솔루션, 높은 낮은 밀도 솔루션 및 낮은 밀도 솔루션 위에 낮은 품질 레이어 사이의 중간 품질 계층 아래의 높은-품질 계층으로 분리합니다. 품질에 이러한 차이 생존 (그림 4), 이동성 (그림 5) 관통 (그림 6)의 명확한 차이 의해 입증 됩니다. 정자는 PDG의 높은-품질 계층에서 격리 증가 전통적으로 씻어 샘플의 상대적인 모든 세 개의 매개 변수 전시. 모든 테스트 매개 변수를 통해 그 레이어 PDGC에 의해 분리 시 중간 및 낮은 품질 표시 온건 하 고, 각각,로 감소 합니다.

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토론

다 산 동물 생산의 수익성 결정 뿐만 아니라 또한의 존재에 대 한 자연 선택의 수단으로 서 역할. 정자 세포의 궁극적인 기능은 ovum를 기름 지 게 하는 것 이다. 여성의 수 란 관 알23,24의 수정 있도록 그 적자 정자만을 선택 합니다. 생체 외에서 연구도 질적 정자 특성과 수정 성공4,11,,2324사이 가까운 상호 관계를 계시 했다. 감소 된 비 옥 정자4,,1125의 품질이와 연결 됩니다. 이와 같이, 그것...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AccudenzAccurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USAAN7050
Percoll Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USAP7828
쉬프 s 시약Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA3952016
TESSigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USAT1375
Eosin YSigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USAE4009
NigrosinSigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA198285
ST 40R 원심분리기 Thermo Scientific, Waltham, MA, USA75004524
DU 530 Life Sciences UV/Vis 분광 광도계Beckman Coulter, Brea, CA, USA카탈로그를 찾을 수 없습니다
Olympus IX 71 도립 형광 및 위상차 현미경Olympus America Inc., PA, USA카탈로그를 찾을 수 없습니다.

참고문헌

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