패치-Clampers에 대 한 연락처 거품 Bilayers 지질 Bilayer 실험

요약

여기, 선물이 연락처 거품 bilayer 메서드를 사용 하 여 지질 bilayers의 대형을 위한 프로토콜. 물 거품 물-오일 인터페이스에는 단층은 형성 하는 그것에 의하여, 유기 용 매에 불어 진다. 두 펫은 bilayer를 형성 하기 위하여 거품을 도킹 하려면 조작 됩니다.

초록

지질 bilayers 수 있도록 다양 한 멤브레인에서 채널 막 상호 작용의 시험 지질 구성 하는 이온 채널의 기능 연구에 대 한 독특한 실험 플랫폼을 제공 합니다. 그 중 물방울 인터페이스 bilayer; 인기를 얻고 있다 그러나, 큰 막 크기 낮은 전기 잡음의 녹음 방해. 우리는 평면 지질 bilayer의 이점을 결합 하는 연락처 거품 bilayer (CBB) 메서드 및 패치 클램프 방법, 지질 구성 변경 하 고 각각 bilayer 기계를 조작 하는 등 설립. 기존의 패치 클램프 실험에 대 한 설치 프로그램을 사용 하 여, CBB 기반 실험 수 쉽게 수행. 간단히, 유리 피 펫에서 전해질 솔루션 단계로 유기 용 매 (hexadecane), 날 려 및 피 펫 압력은 안정 되어 있는 거품 크기를 유지 하 고 있다. 거품은 거품에 리에서 제공 되는 지질 단층 (순수 지질 또는 혼합된 지질), 자발적으로 늘어서 있다. 다음, 두 개의 단층 늘어선 거품 (~ 50 µ m 직경에서) 유리 펫의 팁에서 bilayer 형성에 대 한 도킹 됩니다. 거품으로 채널 재구성 리의 소개 채널 신호 대 잡음 비율 단일 채널 현재 녹음 패치 클램프 기록의 비교를 허용 하는 bilayer의 이끌어 낸다. Cbb는 비대칭 지질 성분과 쉽게 형성 된다. CBB는 이전 거품 밖으로 하 고 새로운 것 들을 형성 하 여 반복적으로 갱신 됩니다. 다양 한 화학 및 물리적 섭 (예를 들어, 막 관류와 bilayer 긴장) Cbb 여기에 부과 될 수 있습니다, 그리고 선물이 CBB 형성에 대 한 기본 절차.

서론

이온 채널, 세포 막 하지만 되지 않습니다 단순히 지원 자료 파트너 이온 플럭스를 생성 하기 위한. 기능적으로, 막은 이온 채널 포함, 전기 절연체 이며 모든 세포 막 휴식 막 잠재력으로 헤어 하지 않습니다. 전통적으로, 임의의 막 잠재적인 채널을 통해 전기 전류를 측정 하는 외부 회로에서 부과 되었다. 다른 막 잠재력에 이온 플럭스의 양적 평가이 그들의 이온 선택 투과 등 제어 기능^1,2채널, 분자 속성을 밝혔다. 이온 채널의 기능 연구에 대 한 막 플랫폼 세포 막 또는 지질 bilayer 막입니다. 역사적으로, 단일 채널 전기 현재 녹음 지질 bilayers^3,4에 초연 했다 그리고 패치 클램프 방법 (그림 1A 와 같이 세포 막에 대 한 관련 기술 개발 )^,56. 그 이후,이 두 가지 기술을 다른 목적 (그림 1)

프로토콜

1. 리 준비

1. 원하는 농도 (예를 들어, 10 mg/mL)에 클로 프롬에 인지질 (예를 들어, 가루에 10 mg)을 분산.
2. 클로 프롬을 증발.
   1. 장소는 둥근 바닥 플라스 크 및 회전 하는 증발 기에는 N₂ 가스 실린더에 연결 ( 테이블의 자료를 참조) 설정에서 인지질 솔루션. 상 온에서 N₂ 흐름 아래 플라스 크를 돌려 얇은 인지질 영화 (~ 30 분) 후 나타납니다.
   2. 진공 펌프에 연결 된 desiccator에 열려있는 플라스 크를 놓습니다. 진공 펌프를 사용 하는 클로 프롬을 철저 하 게 제거 하는 몇 시간 동안 desiccator 내부 발음.
3. 플라스 크에는 전해질 솔루션의 적절 한 볼륨을 추가 하 고 인지질 정지 2 mg/mL를 인지질을 일시 중단.
4. 초 목욕 sonicator를 사용 하 여 여러 가지 수만 대 한 정지를 sonicate ( 재료의 표참조) 다층된 소포 (MLV) 정지를.
5. 이온 채널 단백질을 포함 하는 proteoliposomes의 준비에 대 한 추가 단백질 해결책 (solubilized; 적절 한 세....

결과

전형적인 CBB (그림 56) 50 µ m의 직경 졌고 hexadecane에 특정 막 커패시턴스 0.65 μ F/c m²했다. 거품 크기는 임의로 내부 거품 압력에 의해 제어 됩니다. 작은 거품은 저 잡음 기록에 필요한 팁 직경 대응 하 게 작은 되어야 합니다. 예를 들어 직경에서 50 µ m의 거품 크기, 팁 직경 30 µ m 이어야 합니다.

CBB는 형성 했다, 일단 채널 분자는 liposome 또는 수성 해결책에서 자연스럽 게 몇 수십 분의 경 간 내의 bilayer에 삽입 되었다. 채널 삽입 적용된 막 잠재적인 아래 현재 진폭 (그림 7)의 단계적 증가 의해 확인 되었다. 작은 막 지역 (< 10.......

토론

지질 bilayer 형성의 CBB 메서드 단층²⁰줄지어 물에 기름 방울의 원리를 기반으로 합니다. 기술적으로, Cbb 형성에 대 한 절차는 쉽게, 특히 패치 클램프 연구자, 유리 micropipettes 조작에 능숙 합니다. Microinjectors와 함께 두 개의 피 펫 조작자 사용할 수 있을 때 패치 클램프에 대 한 electrophysiological 설치 쉽게는 CBB에 사용 됩니다. 다른 한편으로는 CBB 기존의 첨 두 부하의 후임은, 때문에 많은 양의 물리 기술 이었던 누적된⁸,이 배경으로 표면 화학의 지식에 대 한³⁸ 유용 운영에 대 한 고 Cbb 조작 CBB 채널 막 interplays 화학 성분 및 물리적 상태⁶¹수정 능력으로 공부에 대 한 다양 한 플랫폼을 제공 합니다. 거품 안 대기 지질 단층 위상 및 전단지는 bilayer의 국경을 넘어.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아졸렉틴 (L-α -Phosphatidylcholine, Type IV-S)	Sigma-Aldrich	P3644
A / D 변환기	분자 Divices	Digidata1550A
Ag / AgCl 전극	Warner Instruments	64-1317
목욕 초음파 발생기	Branson	M1800H-J
카메라	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
유리 모세관	Harvard Apparatus	30-0062
Hepes	Dojindo	342-01375
구멍 슬라이드 유리	Matsunami 유리	S339929
도립 현미경	Olympus	IX73
절연 테이블	Herz	TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor	Narishige	IM-11-2
마이크로 매니퓰레이터	Narishige	EMM
Microforge	Narishige	MF-830
마이크로 피펫 홀더
n-Hexadecane	Nacalai	07819-32
패치 클램프 증폭기	HEKA	EPC800
피펫 풀러	셔터 기기 Co.	P-87
POPC(1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포콜린)	Avanti 극성 지질	850457
POPE(1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민	Avanti 극성 지	850757
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) )Avanti	극성 지질	840457
염화칼륨	Nacalai	28514-75
로터리 증발기	Iwaki	REN-1000
숙신산	Nacalai	32402-05
진공 펌프	Buchi	V-100

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