바이러스 성 감염 및 초파리 Melanogaster 상호 작용 호스트-바이러스의 분석의 설립

요약

이 프로토콜에는 vivo에서 바이러스 감염 초파리 melanogaster 나노 주입 방법 기본적인 기법을 사용 하 여 바이러스-호스트 상호 작용을 분석 하에 설정 하는 방법을 설명 합니다.

초록

바이러스 확산 전염병 질병의 주요 원인입니다. 따라서, 바이러스와 호스트 간의 상호 작용을 이해 바이러스 감염의 치료 및 예방의 우리의 지식 확장에 매우 중요 하다. 과일 파리 초파리 melanogaster 입증 하나 항 바이러스 요인에 대해 강력한 유전자 도구 및 높은 보존된 타고 난 면역 바이러스-호스트 상호 작용을 조사 하는 가장 효율적이 고 생산적인 모델 생물 신호 경로. 여기에 설명 된 절차는 바이러스 성 감염을 확립 하 고 성인 파리에서 조직의 항 바이러스 응답을 유도 하 나노 사출 메서드를 보여 줍니다. 이 방법에서는 바이러스 주입 복용량의 정확한 제어 실험 재현성을 높은 수 있습니다. 이 연구에서 설명 하는 프로토콜 파리와 바이러스, 주입 방법, 생존 율 분석, 바이러스 부하 측정 및 항 바이러스 경로 평가의 준비를 포함 한다. 파리의 배경에 의해 바이러스 성 감염의 영향 효과 여기에 언급 했다. 이 감염 방법은 실행 하기 쉬운 그리고 양적 반복; 그것은 바이러스-호스트 상호 작용에 관련 된 호스트/바이러스 성 요인에 대 한 화면을 신호 하는 타고 난 면역 및 바이러스 감염에 대 한 응답에 다른 생물학 통로 사이 누화를 부하에 적용할 수 있습니다.

서론

바이러스 성 감염, 특히 arboviruses는 는 Chikungunya 바이러스¹, 등으로 신흥 뎅기열 바이러스, 황열병 바이러스² , Zika바이러스³, 왔다 공중 보건에 큰 위협 전염병 발생 하 여 ⁴. 따라서, 바이러스-호스트 상호 작용의 더 나은 이해 것이 전염병 제어 및 인 간에 있는 바이러스 성 질병의 치료에 대 한 점점 더 중요 해지고 있다. 이 목표에 대 한 더 적절 하 고 효율적인 모델 바이러스 감염을 기본 메커니즘을 조사를 설립 해야 합니다.

과일 파리, Drosophilamelanogaster (D. melanogaster), 바이러스-호스트 상호 작용^5,6 를 조사 하는 강력한 시스템을 제공 하 고 인간의 바이러스 성 질병⁷ 공부에 가장 효율적인 모델 중 하나를 것을 입증 했다 ^{, 8 ,....}

프로토콜

참고: 시작 하기 전에 실험, 셀 라인 및 사용 하는 비행 주식 해야 하지 오염 특히 DCV, FHV, 초파리 X 바이러스 (DXV), 및 조류 신장 염 바이러스 (ANV) 바이러스에 대 한 다른 병원 균에 의해. 이상적으로, RNA 시퀀싱 또는 간단 하 게 PCR 기반 식별 오염^10,45를 감지 하는 데 사용 됩니다. 오염 발생, 세포 선 및 비행 주식 사용할 수 없을 때까지 더 이상⁴⁶완전히 소독.

1. 바이러스와 비행 준비

1. 바이러스 전파 및 컬렉션
   참고: 초파리 S2 * 셀 DCV 전파 및 적정을 위해 사용 됩니다. S2 * 셀 라인 늦은 단계 D. melanogaster 태아의 기본 문화에서 파생 됩니다. 이 셀 라인 잘 했습니다⁴⁷위에서 설명한.
   1. 1 x 10⁷ 가능한 셀/mL의 조밀도에 10 cm 세포 문화 접시에, 반 부착 단층으로 S2 * 셀 추가 CO₂, 없이 25 ° C에서 슈나이더의 초파리 매체에 성....

결과

이 섹션의 결과 후에 D. melanogaster의 DCV 감염 얻을 수 있습니다. 그림 1 초파리에 있는 바이러스 성 감염의 플로우 차트를 보여 줍니다. 파리 intra-thoracically, 주입 하 고 샘플 바이러스 TCID₅₀ 와 게놈 RNA 수준 (그림 1)의 측정을 위해 수집 됩니다. 바이러스 감염 세포 세포의 용 해를 일으킬 수 있다 고 CPE 3 일 게시물 감염 (그림 2A)에서 관찰 된다. 바이러스 부하 CPE 시험에 의해 측정은 그에 맞춰 측정 정량 (그림 2B). 그림 3에서 보듯이 Wolbachia 초파리DCV 감염 억제. wol 16s rRNA 및 wsp 뇌관 Wolbachia 존재 (그림 3A.......

토론

이 문서에서는, 선물이 상세한 절차 성인 초파리 melanogaster 에 바이러스 감염 시스템을 설정 하는 방법에 나노 분사를 사용 하 여. 프로토콜에 적절 한 플라이 라인 및 바이러스 주식, 감염, 전염 성 지표의 평가 기술과 항 바이러스 응답의 측정의 준비 포함 됩니다. DCV는 바이러스 성 병원 체의 예제로 사용 하 고, 바이러스의 다른 종류의 수만 성공적으로 적용 되었을 연구에 대 한 초파리 시스템에. 또한, 바이러스 또는 호스트의 규제 요인의 수백 파리에서 대규모 심사 통해 확인 되었습니다. 따라서,이 방법은 매우 적응력이 이며 DCV에 제한 하지 않습니다 /초파리 상호 작용.

성공적으로 전파 하 고 높은 titer DCV 수확, 몇 가지 해야 합니다 주의. 셀 이어야 한다 건강, 적당 한 밀도에 교양 시간에 수확. 셀 문화 볼륨 감소 해도 바이러스 titer 크게 영향을 하지 않습니다. 일반적으로, 10⁷ 셀 DCV.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22um 필터	Millipore	SLGP033RS
1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브	브랜드	352070
1.5 ml RNase free 마이크로 원심분리기 튜브	Axygen	MCT-150-C
10cm 세포 배양 접시	Sigma	CLS430167	세포 배양
100 교체 튜브	Drummond Scientific	3-000-203-G/X
15ml 튜브	Corning	352096
ABI 7500 qPCR 시스템	ABI	7500	qPCR
세포 배양기	, Sanyo	MIR-553
Centriguge	Eppendof	5810R
Centriguge	Eppendof	5424R
, 클로로포름	시그마	151858	RNA 추출
DEPC, 물	Sigma	95284-100ML	RNA 추출
초파리 인큐베이터	Percival	I-41NL	사육 초파리
FBS	Invitrogen	12657-029	세포 배양
평면 바닥 96웰 플레이트	Sigma	CLS3922	세포 배양
광 현미경	Olympus	DP73
이소프로필 알코올	시그마	I9516	RNA 추출
용해 완충액 (RNA 추출)	Thermo Fisher		15596026 TRIzol 시약
용해 완충액 (액체 시료 RNA 추출)	Thermo Fisher	10296028	TRIzol LS 시약
현미경	Olympus	CKX41
Nanoject II 자동 나노리터 주입기	Drummond Scientific	3-000-204	Nanoject II 가변 부피(2.3 - 69nL) 유리 모세혈관이 있는 자동 주입기(110V)
광학 접착 필름	ABI	4360954	qPCR
페니실린-스트렙토마이신, 액체	인비트로젠	15140-122	세포 배양
qPCR 플레이트	ABI	A32811	qPCR
Schneider' s 곤충 매체	Sigma	S9895	세포 배양
통계 소프트웨어	GraphPad Prism 7
TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix	TransScript	AT301	RNA 추출
Vortex	IKA	VORTEX 3	RNA 추출

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