Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정

요약

여기, 선물이 murine thymus, 림프절, 비장 추가 연구를 cytometry를 사용 하 여 이러한 셀을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하는 프로토콜. 또한,이 프로토콜 cytometry 사용 규제 T 세포의 하위 집합을 결정 하는 데 사용 되었다.

초록

규제 T 세포 (Treg) 세포 등 면역 세포의 다양 한 숫자와 우리의 면역 체계에 의하여 이루어져 있다. Treg 세포는 두 개의 하위 집합, thymic 파생된 Treg (tTreg) 세포와 주변 유도 Treg (pTreg) 셀으로 나눌 수 있습니다. 그들은 우리의 신체의 다른 장기에 존재 하 고 헬 리오스 Neuropilin 1 등 특정 마커에 의해 구별 될 수 있다. TTreg 세포는 pTreg 셀 보다 기능적으로 더 진압으로 보고 되었습니다. 따라서, 그것은 다른 유형의 세포 인구를 조사할 때 tTreg와 pTreg 세포의 비율을 결정 하는 것이 중요입니다. 여기, 우리 수집 thymic 땀 샘, 췌 장 배출 림프절과 spleens cytometry를 사용 하 여 pTreg 세포에서 tTreg 셀을 구별 normoglycemic 비 뚱뚱한 당뇨병 쥐에서. 우리는 수동으로 단일 셀 정지가이 기관에서 준비. 형광 색소 활용 된 표면 CD4, CD8, CD25, 그리고 Neuropilin 1 항 체는 세포 얼룩 사용 되었다. 그들은 하룻밤 냉장고에 보관 했다. 다음 날, 세포 형광 색소 활용 된 세포내 Foxp3와 헬 리오스 항 체와 얼룩이 있었다. 이러한 마커는 Treg 세포의 두 하위 집합 하 사용 되었다. 이 프로토콜에서는 murine thymus, 림프절, 비장을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하 고 이후의 흐름 cytometric 분석을 위해 그들을 사용 하는 간단 하지만 실용적인 방법을 보여 줍니다.

서론

규정 (Treg) T 세포는 면역 시스템의 항상 성에 대 한 중요 합니다. Treg 세포 표면 항 원 c d 4의 식와 CD25, 및 녹음 방송 요인 forkhead 상자 P3 (Foxp3)^1,2,3에 의해 정의 됩니다. 사 카 구치 외. 먼저 CD25 constitutively 쥐⁴, 인간 Treg 세포의 식별에 대 한 선구적인 관찰을 제공 하는 T 억제기 세포에 표현 된 보여주었다. Treg 세포 apoptosis, cytokine 소비 및 세포 독성의 표현을 통해 억제를 유도 하는 granzymes의 분 비를 통해 cytolysis를 포함 하 여 메커니즘의 다양 한 통해 진압 능력을 발휘 하 여 면역 관용에 중심 역할을 담당 T-림프 구 항 4⁵. 또한, 그들은 변형 성장 인자 베타 (TGF-β), 인터 루 킨-10 (IL-10) 및 IL-35⁵등 억제 cytokines를 분 비 수 있습니다. Treg 세포 자연스럽 게 파생 될 수 있다, thymus에서 thymic 파생된 Treg (tTreg....

프로토콜

웁살라 대학에서 로컬 동물 윤리 위원회 동물 실험 승인.

1. 동물에서 장기 수확

1. 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 희생.
2. Thymic 샘 놓고 20 mL 섬광 튜브 또는 15 mL 원뿔 튜브 Hanks´의 5 mL로 가득 spleens 균형 소금물 (HBSS). 1.5 mL 마이크로 튜브 RPMI 1640의 1 mL로 가득에서 장소 PDLNs. 전체 thymus, 비장, 그리고 모든 PDLNs를 사용 합니다.
   참고: 기관 절차에 걸쳐 얼음에 보관 해야 하 고 탐정 thymic 면역 세포 높은 온도에서 신속 하 게 저하 될 수 있습니다 이후 thymic 조직을 처리 하는 경우에 특히 단일 셀 정지를 준비 하는 동안 빠른 수 하려고 한다.

2. 단일 셀 별개로 Thymus, 비장

1. 철저 하 게 짠 다 thymus, 비장 면역 세포를 분리 하는 핀셋 한 켤레. 나머지 thymic 및 비장 캡슐을 삭제 합니다.
2. 세포 현 탁 액 15 mL 원뿔 튜브와 펠 릿을 형성 하기 위하여 4 ° C에서 5 분에 대 한 433 x g 에서 원심 분리기를 전송 합니다. 폐기는 상쾌한.

결과

Nrp1 및 tTreg 및 pTreg 세포에 헬 리오스의 식을 조사, 우리 thymic 동맥, PDLNs 및 normoglycemic 끄 덕 임 쥐의 spleens에서에서 단일 셀을 준비 하 고 흐름 cytometric 위한 Treg 세포 마커 CD4, CD25, Foxp3, 헬 리오스와 Nrp1으로 그들을 물 분석입니다. 결과 전략 (그림 1) 게이팅 담당자와 같이 분석 되었다. 우리는 CD4 중 헬 리오스⁺ 세포의 비율을 발견⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺ Treg 세포는 Nrp1 이상⁺ 모든 3 개의 기관 (그림 2A)에서 세포. Thymus Treg 세포의 80% 이상이 표현 헬 리오스, PDLN 및 비장 (

토론

이 연구에서 우리는 thymic 동맥, PDLNs 및 끄 덕 임 쥐의 spleens에서 단일 셀을 절연 하 고 헬 리오스와 CD4에 Nrp1의 식을 조사⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺ Treg 세포 cytometry 사용 하 여. 현재 연구는 타입-1 당뇨병의 murine 모델은 끄 덕 임 쥐가 사용 되었다. 이전 연구에서 우리는 헬 리오스 또는 Nrp1 tTreg pTreg 세포에서 세포를 구별을 위한 더 나은 표식 인지를 조사 하는 야생 타입 마우스 CD-1 긴장과 C57BL/6 마우스를 이용 했다. 그 연구에 우리 순진한 마우스⁹Treg 세포의 하위 집합을 결정 하기 위해 비슷한 프로토콜 사용. 우리 헬 리오스가이 맥락에서 더 나은 마커 발견. 따라서, 여기에 우리가이 모델에 우리의 이전 발견을 확인 하 여 결과¹⁰우리의 이전 결과 일치 했다 발견 normogly.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NOD 마우스			사내 빵가루 입히기
HBSS	Statens veterinä rmedicinska anstalt	991750
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
NH4Cl	EMD Millipore	1011450500
eBioscience Foxp3 / 전사 인자 염색 버퍼 세트	ThermoFisher	00-5523-00	고정/투과화 농축액, 고정/투과화 희석제 및 투과화 완충액 (10x) 포함
eBioscience 플로우 사이토메트리 염색 버퍼	ThermoFisher	00-4222-26
CD4 단클론 항체 (RM4-5), FITC, eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
CD25 단클론 항체 (PC61.5), PE, eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen  APC-H7 쥐 안티 마우스 CD8a	BD Biosciences	560182
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated 항체	R& D Systems	FAB5994A
FOXP3 단클론 항체 (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Pacific Blue anti-mouse/human Helios 항체	BioLegend	137220
Falcon 5 mL Round Bottom 폴리스티렌 시험관, Cell Strainer Snap Cap	CORNING	352235	A 35 µ 이중 위치 스냅 캡에 m 나일론 메쉬가 통합되어
튜브 15 mL, 120 mm x17 mm, PP	Sarstedt	62.554.002
마이크로 튜브 1.5 mL	Sarstedt	72.690.001
일회용 섬광 바이알	WHEATON
유세포 분석	BD
유세포 분석 소프트웨어	Inivai Technologies	Flowlogic

있습니다