절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

요약

여기, 전자¹³ 마우스 배아 절 예 하에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 새로운 microsurgical 기술을 소개합니다.

초록

신경 줄기 세포 (NSCs) multipotent 이며 중앙 신경 시스템 (CNS)의 세 가지 주요 셀 형식을 야기할 수 있습니다. 생체 외에서 문화 및 확장 NSCs의 신경의 기능을 연구 하는 신경에 대 한 셀 및 그들의 상호 작용을 함께 glial 세포의 적당 한 소스를 제공 합니다. 성인 또는 배아 포유류 두뇌에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 몇 가지 보고 된 기술이 있다. NSCs 배아 CNS의 다른 지구에서 격리를 microsurgical 동안, 라이브 및 확장 가능한 줄기 세포의 가장 높은 비율을 얻기 위해 뇌 세포에 피해를 줄이기 위해 매우 중요 하다. 쥐 태아의 뇌에서이 세포의 고립 동안 스트레스 감소를 위한 가능한 방법은 수술 시간의 감소입니다. 여기, 우리 E¹³ 마우스 배아 절 예 하에서 이러한 셀의 빠른 격리 개발된 기술을 보여 줍니다. 수술 절차 포함 절단 정면 온 두개골, 수확 절 예 하 고립 된 두뇌의 기정에서에서 두뇌를 추출 구부러진된 바늘 팁, 태아의 자 궁에서 E¹³ 마우스 배아를 수확 단일 셀 서 스 펜 션을 얻기 위해 NSC 매체에 수확된 조직 그리고 마지막으로 neurospheres를 생성 하기 위해 현 탁 액 문화에서 도금 셀의 분리.

서론

신경 줄기 세포 (NSCs) 성인과 태아 두뇌의 다른 지역에 있으며 그들은 신경 그리고 glial 세포¹의 다른 종류를 생성 하는 경향이 있다. ² 성인 포유류 두뇌 subventricular 영역 및 태아 두뇌에 예 절 하는 NSC 풍부한 지역³. 개발 두뇌 절 예 하는 대뇌 피 질의 수 및 특히 GABAergic 수³의 대부분을 제공합니다. 또한 더 적은 침략 적 방법이 있다 미 발달 줄기 세포 (ESCs)에서 신경 줄기 세포 생성에 대 한 또는 동물에 대 한 수요 감소 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 사용. ESCs 또는 Ipsc NSCs를 생성 하는 것이 가능한^4,5는 사실에도 불구 하 고 그것은 몇 가지 장단점이 성인 또는 태아 뇌^{6,7, 신경 줄기 세포의 분리에 비해 8}. ESCs와 신경 고기 향해 Ipsc의 분화 유도 대 한 프로토콜은 항....

프로토콜

모든 수술과 동물에 대 한 절차로 양 연구소, 테헤란, 이란 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 버퍼 (HEPES-MEM), 세포 배양 및 세포 배양 배지를 세척 하는 수술 기구 준비

1. 압력가 마로 소독 그들 일상적인 소독 지침에 기반 하 여 수술 도구 (가 위, 메스 블레이드 핸들 및 집게)을 소독.
2. HEPES 메모리 버퍼의 적절 한 볼륨을 준비 (약 100 mL 각 임신 쥐에 대 한 충분 하다). HEPES 메모리 버퍼에 항생제 (10% 페니실린/스)의 높은 농도 추가 합니다. 항생제의이 농도 미생물 오염의 위험을 줄이기 위해 필요 합니다.
   1. HEPES 메모리 버퍼를 준비 하려면 메모리 (최소 필수 매체), 100 mL를 HEPES 분말의 0.5958 g을 추가 하 고 잘 섞으십시오. 7.3-7.4에 pH를 조정 하 고 매체 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링.
3. NSC 중간 포함 neurobasal 매체 (NB) 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 보충 1 %100 x N2 보충 또는 1 %B27 보충 (비타민 A) 없이 1 U/mL 헤 파 린, 1%, L-글루타민, 1% 비 필수 아미노산 (NEAA), 1% 페니실린/스....

결과

마이크로 해 부, 셀 고립과 Neurosphere 문화. 여기, 우리는 마우스 E¹³ 뇌 미세 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 신속 하 고 효율적인 방법을 제시. 이 문서는 정면 온에 잘 파열을 통해 E¹³ 마우스 배아 두개골에서 전체 뇌를 제거 하는 것을 보여줍니다. 이 방법으로 뇌 영 덜 손상 그리고 두뇌의 다른 부분에서 세포를 분리 가능 합니다. 수확된 셀 NSC 매체 bFGF와 EGF, 존재에 neurospheres를 생성할 수 있으며 그들은 직경에서 150-200 µ m 크기 문화 (그림 1A)에서 7 일 후. Neurospheres는 사용 하 여 0.05 %trypsin / EDTA 그들 Laminin/폴 리-L-Ornithine-코팅 요리에 그들의 문화와 단일 세포 그들은 나뭇가지 처럼 neurite 연장 하 고 7-10 일 후 신경 형.......

토론

신경 줄기 세포의 적합 한 소스를 사용 하 여 하는 것은 신경에 대 한 매우 중요 합니다. 신경 줄기 세포는 태아 두뇌의 다른 지역에서 수확 될 수 그리고 그들은 신경 그리고 glial 세포의 특정 유형을 생성할 수 있습니다. 성숙한 신경 그리고 glial 세포를 생성 하도록 유도 하는 신경 줄기 세포의 분화의 유도 대 한 몇 가지 방법이 있다. 수많은 보고서를 나타내는 특정 문화권 조건과 영양 요소 연대에서 그들은 신경¹⁴, oligodendrocytes^15,16 및 이다¹⁷체 외에을 생성할 수 있다. 문학에서 데이터에 따라, 예 절 하 억제 및 흥분 성의 뉴런 GABAergic¹⁸ 와 dopaminergic¹⁹ 종류 등의 다른 형식을 생.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15 mL 튜브	Falcon	352097
50 mL 튜브	Falcon	352235
Adson 펜치, 12 cm, 직선	WPI	14226
B27	Gibco	17504-44
bFGF	Sigma	F0291
소 혈청 알부민 (BSA)	Sigma	A2153
접시 10cm	Falcon	353003
드레싱 펜치, 12.5 cm, 직선	WPI	15908
Dumont 핀셋, 11 cm, 직선	WPI	500342
EGF	Sigma	E9644
에탄올	Merck	100983
글루타메이트	시그마	G3291
Glutamax	Gibco	35050061
염소 안티 토끼 FITC 결합 2차 항체	Sigma	AP307F
염소 세럼	Sigma	G9023
Heparin	Sigma	h3149
HEPES	Sigma	83264
HEPES	Sigma	90909C
인슐린사이린지와 25-27 게이지 바늘	SUPA 의료	A1SNL127
라미닌	시그마	L2020
MEM	Sigma	M2279
N2 보충제	Gibco	17502048
NB 매체	Gibco	21103-31
비필수 아미노산(NEAA)	Ca
PBS	Gibco	20012050
페니실린/스트렙토마이신	Gibco	5140122
폴리-L-오르니틴	시그마	P4957
토끼 안티 마우스 베타 튜불린-III 항체	시그마	T2200
토끼 안티 마우스 GFAP 항체	시그마	G4546
토끼 안티 마우스 네스틴 항체	시그마	N5413
메스 핸들 # 3	WPI	500236
가위 곡선	WPI	14396
날카로운 직선 가위	WPI	14192
대두 트립신 억제제	Roche	10109886001
조직 배양 플라스크, T25	BD	353014
조직 배양 플라스크, T75	BD	353024
트윈 20	시그마	P1379
Vannas 가위,  8cm, 스트레이트	WPI	14003
β-메르캅토에탄올	시그마	M6250

및 Mg 없는 Gibco 11140050