방법 논문

악용 Myoblast 분화와 융합 하는 동안 트랙 핵에 라이브 영상

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DOI:

10.3791/58888

⸱

2019년 4월 13일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chromatin Dynamics Unit, Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) San Raffaele Scientific Institute, 2Vita-Salute San Raffaele University, 3Department of Electronics, Information and Bioengineering, Politecnico di Milano

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

골격 근육 분화 특히 핵 위치에 의존 하는 매우 역동적인 과정 이다. 여기, 우리가 myoblast 차별화 및 myotube 형성 동안 라이브 셀 이미징에 의해 핵 움직임을 추적 하 고 자동 추적에서 정보를 추출 하 여 핵 역학의 정량적 특성 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

초록

세포 내에서 핵 위치 하는 것은 여러 세포 프로세스 개발 및 재생에 중요 합니다. 핵 위치의 가장 흥미로운 예제 골격 근육 분화 동안 발생합니다. 근육 섬유 (myofibers)는 multinucleated 세포 증식과 분화를 받 다 근육 줄기 세포 (위성 세포)에서 파생 된 근육 선구자 세포 (myoblasts)의 융합에 의해 형성. Myofibers 내에서 정확한 핵 위치 하는 것이 적절 한 근육 재생 및 기능에 대 한 필요 합니다. Myoblast 차별화와 myofiber 형성 평가 하는 일반적인 절차는 고정된 세포 면역 형광 검사, 시간이 지남에 핵 운동 및 셀 동작의 연구를 방해에 의해 분석에 의존 합니다. 여기, 라이브 셀 이미징에 의해 myoblast 차별화와 myofiber 형성의 분석 하는 방법을 설명합니다. 차별화 및 퓨전 중 핵 역동성 및 myoblast 행동 (즉, 궤적)의 높은 처리량 양적 특성을 얻기 위해 자동화 된 핵 추적에 대 한 소프트웨어를 제공 하 고.

서론

골격 근육 몸 질량1의 35%-40%에 달하는 인체에서 가장 큰 조직 이다. 인공위성 세포는 근육 줄기 세포, 해부학 적 특징 확산 myoblasts (조직적 조상 세포)을 일으키 다, (플라즈마 막 아래 근육 섬유의 기저 lamina에 juxtaposed), 그들의 위치는 결국 차별화 및 기존 myofibers에 통합 그리고/또한 형태 새로운 myofibers2,,34퓨즈. 그들의 발견 및 그들의 생물학 연구에서 근육 발달 및 재생에 중요 한 통찰력을 주도하 고 있다.

격리 하 고 myotubes로 myoblasts 분화 프로토콜 많은 년 전에 개발 되었습니다 하 고 골격 근육 감 별 법5,,67공부에 아직도 널리 이용 된다. 그러나, 이러한 방법의 대부분 고정된 셀의 분석에 의존 하 고, 따라서 완전히 myoblast 퓨전 myofiber 성숙 등 매우 역동적인 과정을 탐구 하는 과학자를 허용 하지 않는 정적 프로시저를 나타냅니다. 가장 눈에 띄는 예는 단단히 통제, 처음에 myofiber의 중심 핵과 이며, 다음, myofiber 성숙8,9후 주변에 있는 핵 위치입니다. 라이브 영상 추가 같은 독특한 현상에 대 한 통찰력을 얻을 수 가장 적합 한 기술입니다.

여기, 우리 과학자 myoblast 차별화 및 myotube 형성 시간 경과 현미경으로 기록 하 고 myoblast 핵의 자동 추적에서 정량 분석을 수행할 수 있도록 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 차별화와 퓨전 중 핵 역동성과 myoblast 행동의 높은 처리량 양적 특성을 제공합니다. 프로토콜은 나누어 4 개의 다른 부분, 즉 (1) 컬렉션 (2) 마우스의 hindlimbs에서 근육의 기계 및 효소 소화, (3) myoblast 확산 및 감 별 법, (4)으로 구성 된 기본 myoblasts의 격리 핵 myoblast 차별화의 첫 번째 16 h 내 추적 영상 라이브.

다음 절차에서는 myoblasts H2B GFP 마우스에서 격리 되며 doxycycline H2B GFP 표현, 앞에서 설명한10유도 1 µ g/mL로 치료. 또는, 핵에서 형광 단백질을 표현 하는 다른 유전자 변형 생쥐에서 myoblasts 격리 하거나 transfect 세포 Pimentel 외에 의해 설명 된 대로, 핵에서 형광 단백질을 표현 하기 위해 야생-타입 마우스에서 분리 가능 하다. 9.

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프로토콜

동물 주제와 관련 된 모든 절차는 산 라파엘 레 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.

1입니다. 마우스 hindlimb 근육의 해 부

  1. 압력가 마로 소독 하 여 핀셋과가 위 (직선 및 곡선)을 소독.
  2. 준비 하 고 실험을 시작 하기 전에 모든 미디어 (매체 차단, 소화 매체, 매체, 확산 및 매체 차별화) (0.22 μ m)을 필터링 ( 재료의 표참조).
  3. 35 mm 페 트리 접시 근육 컬렉션에 대 한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 5 mL를 넣어.
  4. 자 궁 경부 전위 또는 CO2 를 사용 하 여 마우스를 희생 하 고 에탄올으로 피부를 소독. 근육의 분리를 촉진 하기 위하여가 위, 핀셋를 사용 하 여 hindlimbs 및 위 사지에서 피부를 제거 합니다.
    참고: 근육 신생아 또는 성인 쥐에서 분리 수 있습니다. 신생아 쥐 성인 쥐에 비해 위성 세포의 증가 수가 있다. 그러나, 단일 성인 마우스에서 격리 될 수 있는 위성 세포의 총 수는 아래에서 설명 하는 실험을 수행 하기 위해 충분 합니다.
  5. Tibialis, soleus, 신 근 digitorum longus (EDL), gastrocnemius, 허벅지 근육, 및 삼 두 근, 분리 하 고 PBS를 포함 하는 배양 접시에 넣어. 얼음에 접시를 남겨 주세요. 힘 줄과 지방 소독된가 위, 핀셋으로 조심 스럽게 제거.

2입니다. 기본 myoblasts의 격리

참고: 메 마른 조건에서 세포 배양에 대 한 모든 절차 완료 됩니다.

  1. PBS에서 근육을 제거 합니다. 고 균일 한 질량을 얻을 때까지 무 균 곡선된가 위를 사용 하 여, 근육을 말하다. 근육 조각 50 mL 튜브에 넣어.
  2. 근육 조각 소화 매체의 10 mL를 추가 하 고 근육 효소 소화를 물 욕조에 강한 동요 (250 분-1)에서 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
  3. 10 mL Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 글루타민, 1% 페니실린/스, 그리고 1 %gentamicin (차단 매체) 소화 중지를 추가 합니다.
  4. 5 분 동안 40 x g 에서 centrifuge 고 50 mL 튜브에 상쾌한을 수집 합니다. 얼음에 펠 릿을 저장 합니다.
    참고: 원심, 후는 상쾌한 되어 일부 위성 세포, 혈액 세포, 내 피 세포 및 섬유 아 세포, 소화 되지 않은 근육과 결합 조직의 펠 릿 포함 됩니다. 격리 된 셀의 수를 늘리려면, 펠 릿 아래 설명 된 대로 소화의 추가 단계를 받게 해야 합니다.
  5. 원심 650 x g 5 분 삭제에서 상쾌한은 상쾌한 고 10% 포함 된 DMEM의 1 mL에 펠 릿을 resuspend FBS. 얼음에 resuspended 펠 릿을 유지.
  6. 2.2-2.5 단계 2.4에서에서 얻은 2 x 펠 릿의 나머지 부분에 대 한 단계를 반복 하 고 첫 번째 resuspended 펠 릿 얼음에 보존 이후 resuspended 펠 릿 추가.
  7. 70 µ m 필터를 통해 그리고 40 µ m 필터를 통해 resuspended 펠 릿을 전달 합니다. 650 x g 5 분에서 10 %FBS, 및 원심 분리기 DMEM의 15 mL를 추가 합니다.
  8. 붉은 혈액 세포를 고갈에 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼의 3 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 실 온에서 5 분 동안 그것을 품 어. 붉은 혈액 세포의 세포를 중단 하 고 5 분 제거는 상쾌한 650 x g 에서 원심 10 %DMEM 5 ml에서는 펠 릿 resuspend PBS의 40 mL를 추가 FBS.
  9. Preplating 단계로 셀 150 m m 코팅된 페 트리 접시에 확산 매체의 20 mL에 접시. (37 ° C, 5% CO2) 셀 문화 인큐베이터에서 보육의 1 시간 후 매체를 수집 합니다.
    참고: 섬유 아 세포, 플레이트에 다음 삭제 됩니다, 위성 세포 현 탁 액에서 남아 있는 동안.
  10. 2.9 3 x, preplating의 마지막 단계에서 단계를 반복, 정지에서 위성 셀을 포함 하는 매체를 수집.
  11. 5 분 동안 650 x g 에서 원심 분리기.
  12. 셀 centrifuging는 동안 코트 콜라겐 (10 mL의 0.1 m M 초 산의 0.1% 솔루션)과 2 개의 150 mm 접시. 이렇게 하려면 콜라겐 접시에, 5 분 동안 품 어 놓고 그것을 제거. 접시 30 분 동안 건조 하자.
  13. 2.11 단계에서 얻은 상쾌한 삭제 하 고 확산 매체 (자료 테이블)의 40 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 접시 두 콜라겐 코팅 150 mm 접시 (접시 당 20 mL)에 셀 하 고 1 µ g/mL doxycycline H2B GFP 식 유도 하의 함께 2-3 일에 대 한 확산 매체에 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) 셀 유지.
    참고:이 단계는 myoblasts 추가 분석에 대 한 셀의 높은 번호를 얻을 수의 확산을 수 있습니다. 셀 밀도 myotubes로 myoblasts의 자발적인 차별화를 피하기 위해 매우 낮은 유지 됩니다.

3. Myoblast 확산 및 감 별 법 분석

참고: myoblast 밀도 높은 경우, 일부 셀 시작 신장, 그리고, 그것은 셀을 분할 하는 데 필요한. 일반적으로, 그것은 그들의 표현 형에 영향을 주지 않고 셀 2 x-3 x를 분할 수 있습니다.

  1. 매체를 폐기, PBS의 5 mL로 세포 세척, trypsin (1x)의 2 개 mL를 추가 5 분 검사 현미경에 대 한 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 품 어 고, 둥근 세포를 분리 하는 경우 추가 10 %DMEM 5 mL는 트립 신을 비활성화 하는 FBS. 셀의 개수 (보통 약 1 x 106 셀/마우스를 얻을 수 이다).
    참고: 5 분에 대 한 트립 신 가진 외피는 보통 proliferating myoblasts 분리 하는 충분 한.
  2. 아래에서 설명 하는 분석 중 셀 제목.
    1. 확산 분석 실험
      1. 50, 000 셀/잘 1 mL/콜라겐 코팅 12-잘 접시에 확산 매체의 접시와 도금된 셀 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 품 어. 해결 하 고 24, 48 또는 72 h에 셀.
        참고: 매체 양분 소모를 피하기 위해 모든 48 h 바뀝니다.
    2. 차별화 분석 결과
      1. 차별 매체 포함 하 지하실 멤브레인 매트릭스 (1: 100)의 350 µ L와 12-잘 접시 코트. 30 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어 고 매체를 제거 합니다.
      2. 200, 000 셀/매트릭스 코팅 접시에 차별화 매체에 잘 플레이트. 셀 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2, 5% O2)에 품 어 그들은 접시를 준수 될 때까지 (2 h는 일반적으로 충분히 준수 하 고 분화를 시작 하는 셀에 대 한).
      3. 차별화, 평가 하려면 앞에서 설명한11myosin 무 겁 사슬 및 핵 얼룩 수행 합니다. 아래 설명 된 대로 또는 라이브 이미징 분석을 수행 합니다.

4. myoblast 차별화 및 핵 추적의 라이브 영상

  1. 라이브 셀 이미징에 대 한 섹션 3.2.2에서에서 얻은 5% CO2에서 37 ° C에서 세포를 유지 하는 인큐베이션 시스템을 갖춘 공초점 현미경 12-잘 접시에서 도금 셀을 넣어.
  2. 필드의 볼을 20 배 건조 목표 (0.7 없음)를 사용 하 여 셀, 충분히 myofiber 대형 모니터의 수백. H2B GFP 셀 낮은 강도 488 nm 아르곤 레이저는 몇 군데 될 수 있습니다.
    참고: 오픈 pinhole 이미지 깊이 (~ 10 µ m)에 셀 두께 포함 세포 실험을 통해 초점에 보관 되는 보장 합니다. Confocal 현미경을 사용 하 여 유리 하다는 이미지의 신호 대 잡음 비율 개선 이후 넓은 필드 현미경 사용 될 수도 있지만. Myofiber 대형 전송 채널을 통해 모니터링할 수 있습니다.
  3. 프레임 16 h에 대 한 모든 6 분 당 16 비트 및 1024 x 1024 픽셀의 이미지를 취득 합니다. 각 인수 위치에 대 한 multiframe.tif 파일을 생성 ( 보조 파일에서 예를 참조).
    참고: 현재 프로토콜에서 현미경 (자료 테이블)과 관련 된 상용 소프트웨어 사용 되었습니다; 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 다른 현미경을 사용 하 여 같은 목표를 달성 하기 위해.
  4. .Zip 파일을 보조로 제공 하는 소프트웨어를 다운로드 합니다.
    참고: 루틴은 MATLAB에서 실행 해야 하는 스크립트. 소프트웨어 게시 소프트웨어12 myotube 형성 중 핵의 추적에 대 한 최적화의 적응 이다. 이 소프트웨어 두 부분으로 나누어져 있습니다: 첫 번째 두 번째 "트랙" (궤도) 핵 운동의 생성 하는 동안, 그들을 분할 하 여 각 프레임에 핵을 식별. 핵 세분화 및 추적 및 시작 하는 단계별 가이드에 대 한 전체 코드는 보조 파일에 제공 됩니다.
  5. Zip 파일을 추출 하 고 사용에 개인용 컴퓨터 (PC)에서 원하는 경로에 저장 합니다. 모든 수행에 필요한 소프트웨어가 이미 설치 된 PC에 구절 아래. Note로 아래에 언급 된 세 폴더의.zip 파일 구성.
    참고: 분할 루틴 함수는 세분화에 대 한 실행 수를 포함 합니다. 추적 루틴, 대신, 추적에 필요한 기능을 포함 합니다. 예 세그먼테이션 추적 기본 스크립트 및 파일 시스템에 익숙해질을 제공 합니다. 소프트웨어 사용 세분화 되 고 핵의 추적 MATLAB, R2015a 또는 이후 버전에서 제대로 실행 됩니다.
  6. .Tif 파일에서 핵 세그먼트, 예를 들어 NameFile.tif파일을 이름을 지정 합니다.
    1. 예 세그먼테이션 추적 폴더를 열고 DoSegmentation.m를 클릭 합니다. 이 MATLAB에 명령 창이 열립니다.
    2. 예 세그먼테이션 추적 폴더의 모든 요소를 보고 왼쪽에 현재 폴더 창을 확인 합니다. DoSegmentation.m두 번 클릭.
      참고: 스크립트에서 할 수 있는 수정에 대 한 자세한 정보는 StepbyStep.txt 파일에서 찾을 수 있습니다. 그것은 변수 filenameinput 은 NameFile.tif 와 folderinput 는.tif 파일이 포함 된 폴더는 스크립트 수정 필수입니다.
    3. 스크립트 실행 (녹색에 클릭 하 여 실행 버튼). 핵의 분할 출력 그림에 구상 될 수 있다 하는 동안 세분화의 결과 file.mat (SegmentedNameFile.mat)로 저장 됩니다.
      참고: 필요한 경우 스크립트에 설명 된 세그먼트에 대 한 매개 변수를 수정할 수 있습니다. CheckSegmentation.m 스크립트를 사용 하 여 세분화의 품질을 확인할 수 있습니다 (StepbyStep.txt 파일을 참조). 세그먼트화의 품질은 저하 하는 경우,이에 따라 (단 몇 가지 핵 감지), 명확 하 게 DoSegmentation.m 스크립트에 표시 된 세분화의 매개 변수를 조정 하 고 절차를 반복 합니다.
  7. (즉, 각 시간에 핵의 궤적) 트랙을 생성 하려면 동일한 작업 폴더에 GenerateTracks.m 스크립트를 실행 세그먼트에서 얻은 핵 위치를 사용 하 여. 적절 한 분할 파일을 입력으로 추가 하십시오 (자세한 내용은 StepbyStep.txt 파일 참조) 전에 취득.
    참고: 사용자는 출력으로 x-좌표에 대 한 매트릭스와 생성 된 트랙의 y 좌표에 대 한 또 다른 매트릭스 파일 TrackedNameFile.mat를 얻을 것 이다.
  8. CheckTracking.m 를 사용 하 여 트랙의 품질을 평가 (자세한 내용은 StepbyStep.txt 파일을 참조). 이 마지막 대목의 출력 그림을 사용 하 여 시간에 각 핵 위치를 시각화 하는 데 도움이. 각 세그먼트 핵을 나타내는 녹색 십자가 대 한 왼쪽에 확인 하십시오. 하나의 특정 핵을 선택 아래 스크롤 막대를 사용 합니다. 선택 된 핵 원으로 표시 됩니다 참고 빨간색, 오른쪽에 선택된 된 셀의 궤적 지켜질 수 있다 시간에서 (사용 하 여 위쪽 스크롤 막대).

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결과

자동으로 myoblast 차별화 라이브 영상에서 중 핵 움직임을 따라, 핵 우선적으로 표시 되어야 합니다 놓여있는지. Intercalating DNA 분자를 사용 하는 가능한 이러한 분자 확산과 기본 myoblasts13의 방해 때문에 중요 하다. 예를 들어, 확산 및 감 별 법 또는 Hoechst (그림 1) 없이 교양 기본 myoblasts에서 분석 되었습니다 했습니다. 확산 (그림 1A, B)와 차별화 (그림 1C, 중간 패널) 강하게 myoblasts Hoechst 33342와 교양에 장애가 있는 분명 하다. 반대로, myoblasts H2B GFP 마우스에서 고립 되 고 doxycycline와 교양 녹색 형광과 핵을가지고 고 마찬가...

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토론

근육 섬유 (myofibers)는 multinucleated 세포 확산 그리고 감 별 법2,3,를 받아야 근육 줄기 세포 (위성 세포)에서 파생 된 근육 선구자 세포 (myoblasts)의 융합에 의해 형성 되는 4. Myoblast 차별화를 평가 하기 위해 일반적인 절차 myoblasts 매체를 차별화 하 고 MyHC, 차별화, 마커 및의 얼룩에 얼룩이 면역 형광 검사를 수행 하기 위해 다른 시간 지점에서 세포를 고정에서 경작의 구성 핵 DNA intercalating 분자 (예를 들어, Hoechst)5. 이 메서드는 myoblast 차별화 차별화 인덱스 (MyHC-긍정적인 세포/총 휴대폰 번호의 수) 또는 퓨전 인덱스 (적어도 두 핵/총 휴대폰 번호와 함께 myotubes 수) 등의 다른 매개 변수를 측정 하 여 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 AFM-텔 레 톤 E.V. (#21545)에 의해 고 스타지오네 산 라파엘 레 (OSR) 씨 그랜트 S.Z. (ZAMBRA5X1000)에 의해 지원 되었다. 파스퇴르의 이미지 분석 허브에서 박사 장 이브 Tinevez 공개적으로 그의 "간단한 추적기" MATLAB 루틴을 공유에 대 한 인정 이다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
닭 배아 추출물SeralabCE-650-J
콜라겐 분해 효소시그마C9263-1G콜라겐 125units/mg
SigmaC8919
dispaseGibco17105-0411.78 units/mg
독시시클린시그마D1515
DMEM시그마D5671
소 태아 혈청Life technologies10270106
겐타마이신SigmaG1397
말 혈청Invitrogen16050-098
Hoechstlife technologies33342
IMDMSigmaI3390
L-glutamineSigmaG7513
Matrigel코닝356231
페니실린-스트렙토마이신시그마P0781
적혈구 용해 배지Biolegend420301
Digestion medium
collagenase40 mg
dispase70 mg
PBS20ml
여과 0.22um
차단 매체
DMEM
소 태아 혈청10%
L-글루타민1%
페니실린-스트렙토마이신1%
겐타마이신1 ‰
여과 된 0.22um
< Strong >< U>Proliferation Medium < / U>< / Strong >
IMDM
소 태아 혈청20 %
L- 글루타민1 %
페니실린 - 스트렙토 마이신1 %
겐타마이신1 ‰
치첸 배아 추출물3%
여과 0.22um
분화 매체
IMDM
말 혈청2%
L-글루타민1%
페니실린-스트렙토마이신1%
겐타마이신1 &퍼밀;
치첸 배아 추출물1%
filtered 0.22um
송아지 피부의

참고문헌

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재인쇄 및 허가

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