이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

높은 처리량 Nitrobenzoxadiazole 표시 된 콜레스테롤 경과 분석 결과

8.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58891

⸱

2019년 1월 7일

 ,  , 
1Group of Genomics and Pharmacogenomics in HIV, Laboratory of Retrovirology and Viral Immunopathogenesis, IDIBAPS, Hospital Clínic de Barcelona

이 논문에서

요약

혈 청 또는 대 식 세포 세포 모델에서 플라즈마를 생체 외에서 콜레스테롤 경과 용량 측정은 동맥 경화에 대 한 biomarker로 유망한 도구입니다. 현재 연구에서 우리 최적화 및 형광 NBD 콜레스테롤 경과 방법을 표준화 하 고 96 잘 접시를 사용 하 여 높은 처리량 분석을 개발.

초록

동맥 경화는 심장 혈관 질병 (CVD)에 리드. 그것은 여전히 분명 콜레스테롤-HDL (cHDL) 농도 롬 개발에 인과 역할을 담당 하는 여부입니다. 그러나, atheroma 플 라크 형성의 초기 단계에서 중요 한 요소는 콜레스테롤 경과 용량 HDL (동의 대 식 세포에서 콜레스테롤을 HDL 입자의 능력)을 거품 세포 형성을 피하기 위하여. 이것은 endothelium 및 반전 콜레스테롤 수송 (RCT)를 통해 콜레스테롤 제거의 부분에 콜레스테롤의 축적을 방지에 중요 한 단계 이다. 혈 청 또는 대 식 세포 세포 모델에서 플라즈마 콜레스테롤 경과 용량 동맥 경화에 대 한 biomarker로 사용 될 수 있는 유망한 도구입니다. 전통적으로, [3H]-콜레스테롤은 콜레스테롤 경과 분석 실험에 사용 되었습니다. 이 연구에서 우리 THP 1 파생 된 세포에 콜레스테롤 통풍 관 및 경과 과정을 추적 하는 세포 분석 결과에서 형광 표시-콜레스테롤 (NBD-콜레스테롤)을 사용 하 여 안전 하 고 빠른 전략을 개발 목표로 합니다. 마지막으로, 우리 최적화 및 NBD 콜레스테롤 경과 방법을 표준화 하 고 96 잘 접시를 사용 하 여 높은 처리량 분석을 개발.

서론

세계 보건 기구에 따르면는 현재 교장의 죽음은 전세계 원인은 허 혈 성 심장 질환과 뇌졸중 (15.2 백만 죽음의 총에 대 한 회계)1. 둘 다 심장 혈관 질병 (CVD) 동맥 경화 및 혈관2,3atheroma 플 라크의 파열에 의해 선행 될 수 있습니다.

동맥 경화는 혈관 벽 염증 성 질환 대 식 세포, T 세포, 돛대 세포 그리고 수지상 세포는 내 피를 침투와 결국 동맥 경 화성 플 라크를 형성 하는 혈액에서 축적 이다. 동맥 경 화성 플 라크는 지질 코어 및 콜레스테롤 결정, 경 동맥 intima 미디어 두께4,5의 고해상도 B 모드 초음파 측정에 의해 입증 제시. 세포, 지질 수락자 입자 쪽으로 콜레스테롤 경과 ABCA1, ATP 의무적인 카세트 G 인도의 회원 1 ATP 묶는 카세트 (ABC) 수용 체의 수단 (ABCG1), 및 SR-BI 폐품 수용 체에 의해 수행 됩니다. 콜레스테롤 유입 및 세포에 경과의 불균형 동맥 경화 개시6핵심 과정으로 간주 됩니다. 콜레스테롤 경과 플라즈마 주변 조직에서 콜레스테롤 제거에 중요 한 단계 및 반전 콜레스테롤 수송 (RCT) 라는 프로세스에서 간으로 간주 됩니다. 콜레스테롤은 세포 apolipoprotein A1에 주로 (ApoA1) 고밀도 지단백 (HDL) 입자의 표면에서 발견에서 전송 됩니다. HDLs는 다음 배설 및 재 사용률7,,89간 콜레스테롤 수송.

전통적으로, 트리 티 움 (3H) 라디오 이라는 콜레스테롤 콜레스테롤 경과10에 사용 되었습니다. Radioisotopes의 방출 신호는 매우 민감한10; 그러나, 라디오 이라는 콜레스테롤 긴 프로토콜, 이온화 방사선에 노출의 위험과 방사성 방출의 안전한 취급을 위해 특별 한 방사능 시설 및 장비에 대 한 필요성 등 분명 한 장애를 선물 한다. 그와 반대로, 형광은 형광 신호 검색과 fluorophores 사용할 수의 광범위 한, 그것의 안전11에 그것의 단순 진단 기법에 성공적으로 통합 되었습니다. 여러 형광 표시 스 테 롤 콜레스테롤 물질 대사 (본질적인 형광)와 dehydroergosterol, dansyl 콜레스테롤, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) 연구에 사용 되었습니다-콜레스테롤, 및 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol (NBD-콜레스테롤)입니다. 특히, NBD 콜레스테롤 인간 세포12효율적인 통풍 관을 선물 한다. 두 개의 다른 NBD 표시-콜레스테롤 현재 사용할 수 있습니다: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) 및 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; 그림 1)입니다. 25-NBD-콜레스테롤은 세포 막 역학 연구13,14에서 주로 사용 하는 동안 22 NBD moiety 함께 셔 서 콜레스테롤 콜레스테롤 경과 연구에 맞게 최고의 수 있습니다.

일반적으로 생체 외에서 콜레스테롤 경과 분석 실험에서 사용 하는 셀 라인 인간의 백혈병 파생 THP-1 셀, murine Raw 264.7 세포15또는 J774.1 같은 monocyte 모양의 세포 이다. 이러한 셀의 모든 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)를 사용 하 여 체 외에서 세포로 분화 될 수 있다 하지만 THP 1 파생 된 대 식 세포 (dmTHP-1) 최고의 반영 하 고 인간의 세포16모방.

현재 연구에서 우리는 최적화 하 고 22 NBD 콜레스테롤 [3H] 하는 대신 사용 하 여 dmTHP-1, 혈 청 샘플의 콜레스테롤 경과 용량을 결정 하는 형광 높은 처리량 방법을 표준화-콜레스테롤. 또한, 우리는 표준 방사성 아날로그와 최적화 된 형광 기법을 비교합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

이 연구에 대 한 윤리 위원회 승인 (다 Ètic d'Investigació Clínica, 병원 클리닉, 바르셀로나, 승인 번호 HCB/2014/0756) 및 서 면, 정보 동의 모든 과목에서 얻은 했다.

1. NBD-콜레스테롤 준비

  1. NBD-콜레스테롤 (MW 494.63; 참조 테이블의 재료) 순수 에탄올에 주식 (2mm)를 분해. 10 mg 유리병 2 m m 재고를 에탄올의 10.1 mL 볼륨에 전체 유리병 내용 분해.
  2. 5 μ M의 최종 농도 도달 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 5% 페니실린/스 (R10 매체) 보충 RPMI 1640 년에서 재고에서 NBD 콜레스테롤 희석 (예:, 5 μ M 최종 농도에서 NBD 콜레스테롤의 10 mL를 얻을)에 의해 25 μ r 10 매체에 NBD 콜레스테롤 재고 (2 mM)의 희석 이 볼륨은 96 잘 접시에 대 한 충분 합니다.

2. 세포 문화 및 시드 (주 2)

  1. 37 ° c, 5% CO2R10 매체에서 문화 THP-1 셀. 3 일 마다 106 셀/mL x 0.3을 조정 합니다.
  2. 시드 106 셀/잘 R10 매체 (잘 당 100 μ) x 0.2에서 평면, 분명 바닥 흰색 96 잘 접시에 셀입니다.
  3. 100 nM phorbol myristate 12 13-아세테이트와 셀 치료 (PMA; 10 μ M 재고에서) 37 ° C에서 배양 하는 48-72 h THP-1을 차별화 하는 데 5% CO2 dmTHP-1에 셀.
    참고: R10 매체의 500 μ에서 PMA 재고 (10 μ M)의 5 μ를 사용 하도록 추천 된다. 이 앞서, 준비는 10 μ M PMA 재고 동결 건조 된 1 g 유리병 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), aliquot, 및-20 ° c.에 재고의 10 mL에 용 해 하 여
  4. 또는 (제안) 결합 2.2 및 2.3을 위한 단계 더 균질. 15 mL 튜브에서 THP-1 셀의 10 mL를 준비 하 고, PMA 재고 (10 μ M)의 200 μ를 추가 하 고 부드럽게, 믹스 한 즉시 접시에 잘 당 100 μ 씨앗. 2.3 단계에서 설명한 대로 셀을 품 어.

3. Apolipoprotein B 고갈 세럼 (ABDS) 준비 (2 또는 3 일)

  1. 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 솔루션을 준비, 글리신 pH 7.4에서 200 mM의 농도를 (살 균 H2O)와 10 %PBS 희석. 페그를 던지다 8000의 10 g 40 mL 200 m m 글리신의 추가 20% (w/v). 균질을 적극적으로 솔루션을 믹스.
  2. 4 적용 20%의 혈 청/플라즈마 1.5 mL 튜브에 각 혈 청/혈장 샘플의 10 개 부분 당 목이 부분과 25 분17 얼음 혼합물을 두고 (예를 들어, 100 μ 플라스마 또는 혈 청, 추가 20 @ μ 던지다 솔루션).
  3. 13000 x g 4 ° c.에서 15 분에 못 apolipoprotein B 침전 물은 원심
  4. 침전을 삭제 합니다. 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송.
    참고: (신선한) 3 일에는 ABDS를 준비 하는 것이 좋습니다. 그것은 가능, 하루에 2는 ABDS를 준비 하 고 하룻밤 4 ° C에서 그것을 유지.

4. NBD-콜레스테롤 셀 로드 (주 2)

  1. DmTHP-1의 문화 매체를 삭제 하 고 셀 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1 두 번 씻어.
  2. 로드 5 μ M와 셀 NBD-콜레스테롤 (잘 당 100 μ) R10 매체에서 37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어 고.

5. 콜레스테롤 수락자 (주 3)를 가진 외피

  1. 매체를 삭제 하 고 PBS로 두 번 셀을 씻어.


  1. figure-protocol-1

  2. figure-protocol-2

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

콜레스테롤 경과 분석 결과의 목표는 주어진된 혈 청, 플라스마, 또는 HDL 입자를 포함 하는 상쾌한의 콜레스테롤 경과 용량 생체 외에서 결정 하는. 메서드는 표준 대 식 세포 세포 선의 문화에 셔 서 콜레스테롤을 로드 하 고 접촉을 유도 하는 세포와 FBS 무료 미디어로 희석 테스트 샘플로 이루어져 있다. 마지막으로, 미디어에 세포 lysate에 NBD에서 형광 레벨 측정 됩니다. 측정을 최적화 하려면 셀에서 미디어의 effluxed 콜레스테롤 에탄올을 포함 하는 용 매에의 한 볼륨 혼합입니다. 셀에 남아 있는 NBD 콜레스테롤은 에탄올 또는 측정 하기 전에 세제를 포함 하는 용 매로 resuspended. 마지막으로, effluxed/총 이라는 콜레스테롤의 비율에 따라 결정 됩니다. 기술을 설정 하려면, apolipoprotein B 고갈 혈 청 (ABDS) 건강 한 기증자의 수영장에서 사용 되었다.

매체와 에탄올에 NBD 콜레스테롤에 대 한 최고의 희석 조건 조사 되었다. ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

형광 표시 콜레스테롤은 분석 하 고 속성 및 자연 콜레스테롤 체 외의 물질 대사를 조사 하는 유망한 전략 이다. 그것의 주요 이점은 그것은 세포에 의해 채택 될 수 있다, 세포내 수 막 유통 연구, 콜레스테롤 경과 분석 실험 등이 프로토콜 (그림 7)에 적용할 수 있습니다. 일부 형광 표시 스 테 롤 콜레스테롤 추적 BODIPY-콜레스테롤, dansyl 콜레스테롤, dehydroegrosterol, 및 22 및 25-NBD-콜레스테롤12를 포함 하 여 생체 외에서 수 있습니다. 특히, 22-NBD-콜레스테롤은 콜레스테롤 역학을 공부 하는 다른 세포 유형으로 고 라디오 라는 콜레스테롤18의 대용으로 적합 합니다. 합의 방법 콜레스테롤 경과 분석 결과에서 형광 신호 평가에 있다. 노래 외14 수확 매체와 세포 lysates 별도로; FI...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자 권리 특허 출원 (EPO, 18382337.6-1118, 17 5 월 2018)의 발명가 선언 하고자 "콜레스테롤 경과 확인 하기 위한 방법"이이 방법에 따라.

감사의 글

이 작품은 부분적으로 지원 된 연구 기관 드 건배 카를로스 III에 마드리드, 스페인;에서 FIS (PS12/00866) 부여 Fondo Europeo 파라 엘 개발 지역 (페더); 레드 드 Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) 및 검색 프로그램 / Generalitat 드 Catalunya. 저자는 Retrovirology 인 d'Investigacions Biomèdiques 8 월 Pi 나 Sunyer (IDIBAPS)의 바이러스 Immunopathology 실험실을 감사합니다. 우리 감사 합니다 T. Escribà, C. Rovira, 및 C. Hurtado 그들의 지원 및 지식 및 기술 이전 사무실에서 S. Cufí에 대 한 발명을 보호에 대 한 그녀의.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
96웰 수집 플레이트Corning IncCostar 3912흰색 96웰 플레이트(불투명 투명 바닥 포함
96웰 배양 플레이트Corning IncCostar 3610흰색 96웰 플레이트(편평하고 투명한 바닥 포함
<)>em콜레스테롤 유출 분석 키트(세포 기반)Abcamab196985상업용 고처리량 세포 기반 분석 키트를 결정하는 것을 목표로 합니다. 콜레스테롤 유출
무색 RPMI 1640Sigma-AldrichR7509RPMI 1640 (페놀 레드 없음
Gen5 데이터 분석 소프트웨어포함) BioTek버전 2.0
글리신Sigma-AldrichG8790-100G글리신, 비 동물 사용
발광계BiotekSYNERGY HT다중 검출 마이크로 플레이트 리더
용해 용액 1사내50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl 및 H2O
용해 용액 2사내순수 에탄올 및 세포 용해 용액 1:1 (v:v)
NBD-콜레스테롤Thermo-FisherN114822-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol
PBSSigma-AldrichP3813인산염 완충  식염수
, PEG 8000시그마-알드리치202452-250G폴리에틸렌 글리콜
PMA,시그마-알드리치79346포르볼, 12-메리스테이트 B-아세테이트.
R10원내RPMI 1640에는 10%의 소 태아 혈청과 5%의 페니실린/스트렙토마이신이 함유되어 있습니다.
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758RPMI 1640 1.5g/L 중탄산나트륨 및 4.5g/L 포도당 THP-1 세포를 함유하는 2mM L-글루타민이 있는 RPMI 1640
Sigma-Aldrich백혈병에서 유래한#TIB-202
Sigma-AldrichP1754
) , , , , , , ATCC, 1세 아기 Tween 80의 단핵구 유사 라인

참고문헌

  1. The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
  2. Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
  3. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
  4. Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345(2015).
  5. Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
  6. Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
  7. Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
  8. Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
  9. Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
  10. Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
  11. Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
  12. Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
  13. Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
  14. Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
  15. Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
  16. Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
  17. Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
  18. Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
  19. Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
  20. Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
  21. Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
  22. Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
  23. Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
  24. Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
  25. Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

NBDTHP 196HDL
높은 처리량 Nitrobenzoxadiazole 표시 된 콜레스테롤 경과 분석 결과
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.