쥐 골 골에서의 파 골 세포 전 구체의 분리, 정제 및 분화

요약

파 골 세포는 조 혈 간세포의 대 식 세포 혈통에서 유래한 조직 특유의 대 식 세포 폴 리 에틸렌 이다. 이 프로토콜은 기존의 방법에서 발견 되는 사고의 위험을 줄이면서 많은 양의 파 골 세포를 얻을 수 있도록 골 수 셀을 분리 하는 방법을 설명 합니다.

초록

파 골 세포는 거 대 하 고, 다 핵 이며, 단 핵 구 또는 대 식 세포 전 구체의 융합에 의해 형성 되는 모노 이트-대 식 세포의 혈통을 뼈-의존 한다. 과도 한 뼈 재흡수는 골 수 질환을 선도 하는 가장 중요 한 세포 메커니즘 중 하나입니다, 골다공증을 포함 하 여, 치 주 염, 그리고 주위 인공 골 분해. 파 골 세포의 주요 생리 적 기능은 하이드 록 시 아파 타이트 미네랄 성분과 뼈의 유기 매트릭스를 모두 흡수 하 여 뼈 표면에 특징적인 재흡수 모양을 생성 하는 것입니다. 본문에 다른 세포에 비해 상대적으로 적은 파 골 균이 있다, 특히 성인 뼈에. 최근 연구는 더 짧은 시간에 더 성숙한 파 골 세포를 얻는 방법에 초점을 맞추고 있다,이는 항상 문제가 있었다. 분리 및 배양 기술의 몇몇 개선은 더 성숙한 파 골 세포를 얻기 위하여 실험실에서 개발 되었습니다. 여기에서는 특수 하 고 간단한 장치를 사용 하 여 기존 절차에 비해 적은 시간에 골 수를 분리 하는 방법을 소개 합니다. 밀도 구배 원심 분리를 사용 하 여, 우리는 고전적인 방법으로 확인 되는 쥐 골 수에서 완전히 분화 된 파 골 세포의 다량을 얻습니다.

서론

뼈 항상성은 뼈에 의해 조절 되는 복잡 한 생리 적 과정 이다-파 골 세포와 골 형성 조 골 술¹. 골 아 세포 및 파 골 세포를 통해 매개 된 조 골 및 파 골의 활성 사이의 균형은 각각 뼈 건강 및 항상성 유지에 매우 중요 하며, 뼈 항상성에서의 섭 동이 뼈 질환으로 이어질 수 있기 때문에 비정상적인 뼈 성장 또는 뼈 밀도의 손실. 독특한 뼈-재흡수 세포로 서, 파 골 균은 골다공증, 치 주 염 및 인공 골 분해^2,3을 포함 한 비정상적인 뼈 파괴와 관련 된 질병에 중요 합니다.

파 골 세포 배양의 개발은 주로 두 단계로 나뉜다. 보이 드 외⁴ 와 챔버 스 외⁵ 는 1980 년대 첫 번째 스테이지로 구성 된 방법. 그 (것) 들은 급속 한 개장 기간 인 신생 동물의 뼈에서 상대적으로 풍부한 파 골 세포를 얻었습니다. 파 골 세포는 특별 한 배지에서 뼈를 조각 내 고 교 반하여 방출 됩니다. 그러나,이 방법에 의해 얻어진 세포는 양과 순도가 낮다. 두 번째 단계는 골 수가⁶

프로토콜

여기에 설명 된 동물을 포함 하는 모든 방법은 중국 의학의 난징 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 됩니다.

1. 설정

1. 여러 방향으로 절단 1Ml의 피 펫 팁 (1cm)과 여러 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브를 준비 합니다. 20 분 동안 103 kPa 및 121 ° c에서 파이 펫 팁과 마이크로 원심 분리기 튜브를 넣고 멸 균 되었는지 확인 합니다.
2. 격리 절차 동안 고립 된 조직을 보존 하기 위해 얼음과 여러 살 균 요리 상자를 준비 하십시오.

2. 배양 배지의 제조

1. 완전 한 배양 배지를 준비 한다. 페니실린/streptomycin 1%의 최종 용액과 10%의 소 태아 혈 청 (FBS)을 포함 하는 최소 필수 매체 알파 (α-MEM)를 사용 하십시오.
2. 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 2.1 단계에서 미디어를 필터링 합니다.
3. 골 골 유도 배지를 준비 한다. 용액 50 ml의 경우 µ의 mcsf를 1만 ng/m l (재료 표)의 농도로 추가 하 여 전체 배양 액의 49.875 mL에 125 넣고 (단계 2.2에서) 25 ng/ml-CSF의 최종 용액을 만듭....

결과

이 프로토콜의 목적은 다 수의 파 골 세포 전 구체를 편리 하 게 분리 및 정제 하 고 파 골 세포를 성공적으로 유도 하는 것 이었다. M-CSF와 RANKL으로 보충 하 여 5 ~ 6 일에 거 대 한 파 골 세포를 볼 수 있었습니다. 파 골 세포의 형성은 트랩 염색에 의해 성공적으로 규명 되었다 (도 1a). 크고 보라색 세포는 여러 핵 (일반적으로 ≥ 3 개의 핵)을 가진 함정 양성 세포로 간주 되었습니다. 이 방법을 통해, 24 웰 플레이트 (도 1b)에서 파 골 세포 당 최대 30 개의 핵을 함유 하는 800 파 골 세포를 얻는 것이 전형적 이었다. 기존의 방법과 비교 하 여, 개선 된 방법은 전체 분리 진행에 약 20 분을 저장 하였다 (도 1c).

토론

시험관 내에서 파 골 세포를 얻고 연구 하는 능력은 뼈를 흡수 하는 질병의 메커니즘을 이해 하 고 새로운 치료제를 개발 하는 데 도움이 될 수 있는 골 대사를 연구 하고자 하는 모든 연구자에 게 중요 하 고 근본적인 기술입니다. 본 연구는 이전 방법에 기초 하 여 일부 수정과 프로토콜을 설명 했다.

골 수를 얻기 위해 피 펫 팁과 마이크로 원심 분리기 튜브를 사용 함으로써, 그것은 크게 전통적인 방법에 비해 골 수와 실험실 인력의 작업 부하를 얻는 작업 시간을 감소. 그동안,이 방법은 골 수가 손실 또는 바늘 스틱 부상의 위험을 방지. 이전 연구에서, 골 것 유래 세포는^12,13의 분리 직후에 도금 되었다. 밀도 구배 원심 분리는 정산 계수의 차이에 따라 골 수 단 핵 구를 선택 하 여 사용 하였다. 밀도 구배 원심 분리의 과정에서, 세포 분리 매체의 첨가는 경계를 명확 하 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) 키트	Sigma-Aldrich	387A
자동 경조직 슬라이서	Lecia	RM2265
소 대퇴골			자체 구매
세포 인큐베이터	Heraus	BB16 / BB5060
소 태아 혈청	Sarana	s-fbs-au-015
염소 안티 토끼 IgG H& L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077
하드 티슈 그라인더	Lecia	SP-2600
Histopaque Kit	TianJing Haoyang	TBD2013DR	규화 원심 튜브 amd 세포 분리 솔루션
Hochest33342	Sigma-Aldrich	B2261
반전 위상차 현미경	Olympus	CKX31
도립 형광 현미경	Lecia	DMI-3000
MEM, 글루타민 없음	Gibco	11090-081
페니실린-스트렙토마이신, 액체	Gibco	15140122
토끼 안티 칼시토닌 수용체	Bioss	bs-0124R
재조합 쥐 M-CSF	PeproTech	400-28
재조합 쥐 sRANK 리간드	PeproTech	400-30
적혈구 용해 완충액	압신	absin abs47014932
주사 전자 현미경 FEI		Quanta 200
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	89649