방법 논문

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

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⸱

DOI:

10.3791/58896

⸱

2019년 2월 21일

 ,  , 
1School of Biomedical Sciences & the Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Department of Chemistry and Nano-Science Center, University of Copenhagen

이 논문에서

요약

여기, 우리는 예를 들어 시 토 크롬 보3 를 사용 하 여 단일 리의 지질 막에 걸쳐 양성자 전 좌의 분자 메커니즘을 연구 하는 프로토콜 제시. 전기 화학 및 형광 현미경 검사 법, 단일 소포, 포함 하는 단일 또는 여러 효소의 루멘에서 pH 변화를 결합 수 있습니다 감지 되며 개별적으로 분석.

초록

전자의 양성자 펌프 효소 ATP 생산에 사용 되는 양성자 동기 힘을 만드는 막에 걸쳐 체인 몇 redox 반응 양성자 전 좌를 전송 합니다. 막 단백질의 amphiphilic 자연 그들의 처리에 특히 주의 필요 그리고 양성자 전 좌 처럼 막 전송 프로세스를 공부를 할 때 자연 지질 환경으로 재구성 불가결 하지 않습니다. 여기, 우리는 예를 들어 대장균 에서 시 토 크롬 보3 복용 막 산화 환 원 효소의 양성자 펌핑 메커니즘의 조사를 위해 사용 된 방법 선발. 전기 화학 및 형광 현미경 검사 법의 조합 quinone 수영장과 모니터 pH 변화는 루멘의 산화 상태를 제어 하는 데 사용 됩니다. 형광 현미경의 해상도 인해 수백 리 측정할 수 있습니다 동시에 동안 효소 콘텐츠 단일 효소 또는 liposome 당 전송 축소 될 수 있습니다. 각각 단일 효소 분석 전체 인구의 동작에 의해 그렇지 않으면 숨겨져 있을 수 있습니다 효소 기능 역학에서 패턴을 밝힐 수 있다. 우리는 자동된 이미지 분석을 위한 스크립트의 설명을 포함합니다.

서론

효소 메커니즘 및 활동에 대 한 정보는 앙상블 또는 macroscale 수준에 분자의 수백만에 수천에서 효소 인구와 측정 통계 평균을 나타내는 일반적으로 얻어진 다. 그러나 그것은 알려져 있다,, 효소 같은 복잡 한 고분자가 그들의 행동에 설명 할지도 모른다 및 앙상블 수준에서 관찰 하는 분자 메커니즘을 반드시 모든 분자에 대 한 유효 하지 않습니다. 개별 분자 가늠 자에 그런 편차는 광범위 하 게 지난 2 년간1동안 신흥 메서드의 다양 한 단일 효소의 연구에 의해 확인 되었습니다. 특히, 형광 탐지 개별 효소 활동의 효소 활동2,3 의 조사 또는 소위 메모리 효과 (낮은의 기간에 의해 성공 했다 높은 효소 활동의 기간을 발견 사용 되었습니다. 활동 및 반대로)4,5.

많은 단일 효소 연구 필요 효소 표면 또는 공간적으로 연속 관측 시야에서 충분히 긴 유지 하는 또 다른 방법은 고정에 움직일 수 있다. 리로 효소 캡슐 표면 효소 또는 단백질 단백질 상호 작용6,7인해 어떤 부정적인 영향을 방지 하면서 효소 immobilization 수 있도록 표시 되었습니다. 또한, 리 그들의 자연적인 지질 bilayer 환경8,,910단일 막 단백질을 공부 하는 독특한 가능성을 제공.

클래스의 막 단백질, 운반, 세포 막, 단백질은 지질 bilayers (예, 리)11로 재구성 하는 경우에 공부 될 수 있다 행동에 걸쳐 물질의 방향 전 연습 12,13. 예를 들어 양성자 전 좌, 간결한 및 핵 전자 수송 체인의 여러 효소에 의해 전시 ATP 합성에 사용 되는 양성자 동기 힘을 생성 하 여 세포 호흡에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이 경우에,이 과정의 상세한 메커니즘 종종 애매 남아 있지만 활동을 양수 하는 양성자 전자 전송에 결합 이다.

최근, 우리 전기 화학의 대장균 (시 토 크롬 보3) 터미널 ubiquinol 산화 효소의 단일 효소의 활동을 양수 하는 양성자를 공부와 몇 형광 검출 가능성 입증 리14재구성 된다. 이것은 E 에서 준비 하는 리의 루멘으로는 pH에 민감한 막 불 침투성 형광 염료의 캡슐화에 의해 달성 대장균 극 지 지질 (그림 1A) 단백질 양은 대부분 리 (에 따르면 포아송 분포) 없거나 하나만 재구성된 효소 분자에 포함 되도록 최적화 되었다. 시 토 크롬 보3 의 두 기판 ubiquinone 솔루션에서 리 고 (주변) 산소를 형성 하는 지질 믹스에 추가 하 여 제공 되었다. 에 리는 띄엄띄엄 6-mercaptohexanol의 자기 조립된 단층으로 덮여 반투명 최상의 부드러운 골드 전극에 흡착 됩니다. 마지막으로, 전극은 간단한 spectroelectrochemical 셀 (그림 1B)의 하단에 장착 됩니다. Quinone 풀 산화 상태의 전기 제어 수를 유연 하 게 트리거 또는 pH에 민감한 염료에 의해 양성자 전 좌 결과로 리의 루멘 내 pH 변화를 모니터링 하는 데 사용은 어떤 순간에 효소 반응을 중지 하는 효소입니다. 두 번째, 지질 바인딩된 형광 염료, 크기와 개별 리의 볼륨의 형광 강도 확인할 수 있습니다 사용 하 고 따라서 효소 양성자 펌프 활동의 정량화. 이 기술을 사용 하 여, 우리는 특히 시 토 크롬 보3 분자는 양성자 동기 힘을 급속 하 게 사라지는 자연 누수 상태를 들어갈 수을 발견. 이 문서의 목표는 자세히 단일 liposome 측정의 기법을 소개 하는 것입니다.

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프로토콜

1. 지질/정리-10/FDLL 믹스의 준비

참고: E. 대장균 지질 리 준비를 위해 사용 해야 한다 aliquoted ubiquinone 10 (효소 기판)와 긴 파장 형광 염료 표시 된 지질 (리 크기 결정)에 대 한 이전에 철저 하 게 혼합 된 재구성입니다.

  1. 유리 주사기를 사용 하 여, 지질 극의 클로 프롬의 전송 200 µ L에서에서 추출 대장균 (25 mg/mL) 5 mg aliquots 수 있도록 유리 튜브로.
  2. 1 mg/mL ubiquinone 10의 50 µ L 추가 (정리-10; 클로 프롬) 정리-10의 최종 비율 있도록 지질을: 지질 1: 100 (1 %w / w).
  3. 지질/정리-10에는 긴 파장 형광 염료 표시 된 지질 (FDLL) 1 mg/mL (0.4 %w / w)의 20 µ L를 추가 합니다.
  4. 짧은 vortexing, 클로 프롬 해결책 균질 하 고 부드러운 질소 또는 아르곤 흐름에서 클로 프롬의 대부분을 증발. 적어도 1 시간에 대 한 진공에서 더 증발에 의해 전적으로 클로 프롬 흔적을 제거 합니다.
    참고: 지질 aliquots 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 불활성 분위기에서 몇 달 동안.

2. 시 토 크롬 보3 의 재구성

주: 시 토 크롬 보3 대장균에서 정화에 대 한 Rumbley 외에서 프로토콜을 따릅니다. 15 기본적으로 접혀 효소 샘플의 순도 보장 하기 위해, 크기 배제 크로마토그래피 후 추가 Rumbley 그 외 여러분 에 의해 설명 된 선호도 정화 단계 15

  1. 그래서4, pH 7.4, 지질/정리-10/FDLL 건조의 한 약 수를 (5 mg, 단계 1.4)를 혼합 하 고 지질 영화 완전히 resuspended는 초음파 목욕 치료의 2 분 뒤까지 소용돌이와 혼합 40 m m MOPS-코/60 m m K2의 312.5 µ L를 추가 합니다.
  2. 25 m m 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic 산 (HPTS)는 리 안에 캡슐화 되어야 하는 pH에 민감한 형광 염료의 125 µ L를 추가 합니다.
  3. 250 m m n octyl β-D-glucopyranoside (OGP) 계면 활성 제의 137.5 µ L을 추가 하 고 소용돌이 사용 하 여 혼합 모든 지질에 계면 활성 제 micelles solubilized는 되도록 10 분 동안 초음파 물 목욕에서 sonicate. 1.5 mL 플라스틱 관으로 분산 전송.
    참고: 지질 흐린 정지 계면 활성 제와 가용 화 후 투명 해야한다.
  4. 시 토 크롬 보3 의 필요한 금액을 추가 (아래 참고 참조) 초순 50 µ L (시 토 크롬 보3 솔루션 플러스 물)의 총 볼륨을 추가 하 고. 롤러 믹서에 10 분 동안 4 ° C에서 품 어.
    참고: 단일 효소 조건에 대 한 일반적인 금액은 0.1-0.2% (w/w 단백질 지질, 즉. 단백질의 5-10 µ g), 비록 목표만 전기 활동 (아래 참조)를 관찰 하는 경우 1-2% (단백질의 50-100 µ g)까지 증가 될 수 있다. 부정적인 제어로 리 시 토 크롬 보3 없이 준비 될 수 있습니다.
  5. 그리고 4 개의 1.5 mL 튜브 캡으로 2 x 50 mg 및 폴리스 티 렌 microbeads의 2 x 100 mg 무게 건조 방지 하기 위해 파라핀 영화와 닫습니다.
    참고: 사용 하기 전에, 폴리스 티 렌 microbeads 메탄올으로 세척 한다, 물 및 제조업체의 설명서에 따라 물에 저장.
    참고: 물/microbead 혼합물을 사용 하는 경우 폴리스 티 렌 microbeads 편리 하 게 전송할 수 있습니다 넓은 팁 micropipette와 모자에. 물 다음 얇은 팁는 micropipette를 사용 하 여 microbeads에서 제거할 수 있습니다.
  6. 분산 된 1.5 mL 플라스틱 튜브에 폴리스 티 렌 microbeads와 모자를 추가 하 고 몇 초에 대 한 짧은 회전을 수행 하 여 재구성 혼합물 (단계 2.4)로 폴리스 티 렌 microbeads의 1일50 mg 을 추가 합니다. 30 분에 대 한 계면 활성 제를 흡착 하는 폴리스 티 렌 microbeads에 대 한 롤러 믹서에 4 ° C에서 품 어.
    1. 폴리스 티 렌 microbeads 및 외피의 추가 반복 하 여 다음과 같습니다: microbeads 외피;의 60 분 의 50 밀리 그램 을 추가 microbeads 보육;의 60 분 의 100 mg 을 추가합니다 그리고 microbeads 외피의 120 분 의 100 mg 을 추가.
      참고: 위에 정착된 microbeads 솔루션 단계 2.6 반투명으로 바뀝니다 proteoliposomes 형성 된다.
  7. 얇은 팁는 micropipette를 사용 하 여 폴리스 티 렌 microbeads에서 proteoliposome 솔루션을 구분 합니다. 그래서 20 m m MOPS-코/30 m m K2의 90 mL에 분산을 희석4, pH 7.4 (MOPS 버퍼)와 Ti45 ultracentrifuge 튜브에 전송.
  8. Ultracentrifuge 유형 45 Ti를 사용 하 여 분산 125000 x g (r최대)에 proteoliposomes 펠 릿을 1 h에서 회전자.
    참고: 비록 큰 버퍼에 희석은 마지막에 캡슐화 되지 않은 HPTS의 농도 줄이는 데 도움이 됩니다 작은 원심 분리기 튜브를 사용할 수 있습니다.
  9. 상쾌한, 그래서4, pH 7.4 (펠 릿 resuspending) 없이 버퍼 20mm MOPS-코/30 m m K2와 펠 릿을 씻어. 헹 구는 버퍼를 삭제 후 다시 일시 중지는 proteoliposomes MOPS 버퍼의 500 µ L에 얇은 팁 micropipette와 앞뒤로 pipetting으로. 다음 1.5 mL 플라스틱 튜브를 전송 합니다.
  10. 12000 x g 파편을 제거에 5 분 동안 정지 원심 새로운 유리병으로 상쾌한 (재구성 된 proteoliposomes)를 전송 합니다.
  11. 밤새 4 ° C에서 재구성된 proteoliposomes 분산 저장 하 고 2 일 이내에 사용 합니다.

3입니다. 반투명 금 전극의 제조

참고: 부드러운 골드 표면 원자적 부드러운 실리콘 웨이퍼에서 99.99% 골드의 30 nm 두께 층의 서식 파일 제거 방법에 의해 얻어진 다. 금 층의 작은 두께 반투명 한 형광 관찰을 허용 해야 합니다 이후 중요 하다. 골드 증발 (물리적 증기 증 착, PVD)의 세부 정보는 다른 곳에16 찾을 수 수 하 고 여기에 덮여 있다만 템플릿-스트립. 또는, 매우 부드러운 골드 칩 구입하실 수 있습니다 다른 곳 ( 재료의 표참조).

  1. 표면에 증발 골드 bi 구성 요소 낮은 형광 에폭시를 사용 하 여 최대 9 유리 커버 전표 (두께 0.17 m m)를 붙입니다. 80 ° C 4 h에서 접착제를 치료.
  2. 자기 조립된 단층 (4 단계)와 수정, 전 그냥 칼 날 유리 커버 전표 실리콘 웨이퍼에서 분리 합니다. 커버 슬립의 얇음 때문에 균열 또는 휴식 유리 슬라이드 커버 전표를 분리할 때 주의.

4. 자기 조립된 단층 (SAM)와 금 표면 수정

  1. 5 mL 1 m m 6-mercaptohexanol (6MH)의 물 솔루션의 준비.
  2. 6MH 솔루션으로 갓 분리 골드 코팅 커버 전표 (3.1 단계)를 찍어와 밤새 20-25 ° C에 두고 (> 16 h) SAM을 형성 하기 위하여.
    참고: Thiol 솔루션 골드 코팅 커버 슬립 잠복기 때 닫힌된 용기를 사용 해야 합니다 그래서 불쾌 한 냄새가 있다.
  3. 다음 날, 6MH 솔루션에서 골드 코팅 커버 슬립을 제거, 물 또는 메탄올 그리고 소 프로 파 놀 간단히 씻고. 부드러운 가스 흐름에서 건조.

5. 전기 Proteoliposomes 활동의 테스트

참고: 효소의 화학 활동에 밀접 하 게 포장된 리 레이어 (5 단계) 확인 먼저 하 고 낮은 기 보장 범위 리 (6 단계)의 루멘에서 pH 변화를 측정 하 단일 소포 실험에 사용 됩니다.

  1. 골드 코팅 커버 슬립 spectro 전기 화학 셀에 조립 ( 그림 1참조). 확인 연락처 고무 o 링에 의해 정의 된 영역 외부 플랫 와이어와 금.
  2. 전해질 버퍼 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 셀 참조와 보조 전극 배치.
    참고: 더 토론 섹션에서 논의 염화 없이 참조 전극 Au (I) 전기 화학 중 Cl의 형성을 방지 하기 위해 선호 됩니다. 여기, Hg/Hg2등4 (토. K2이렇게4) 참조 전극 사용 고 전위는 표준 수소 전극 (그녀)에 대 Hg/Hg20.658 V vs 그녀를 사용 하 여 등등4 (토. K2이렇게4).
  3. 샘의 품질을 평가 하기 위해 오픈 셀 잠재적인 (OCP) 잠재력에 전기 임피던스 분광학 (0.1 Hz-100 kHz)를 실행 합니다. 입원을 임피던스 값을 변환 하 고 2πω ω는 주파수가 콜 콜 음모를 나누어 (다음 참조 임피던스 해석 및 변환에 대 한 내용은16,,1718 참조 스펙트럼)입니다.
    참고: 6MH의 콤팩트 하 고 조밀한 SAMs 세미 원 콜-콜 플롯에 게 가까이 하 고 2.5-3.0 µ F/c m2 (그림 2A) 커패시턴스 값의 범위에서를 제공 해야 합니다. 세미 원 모양 또는 범위 밖 커패시턴스 값에서 상당한 편차를 가져온 경우 전극을 변경 합니다.
  4. 스캔 속도 100 및 10 mV/s 잠재적인 지역-0.3-빈 순환 voltammograms (CVs) 실행 0.8 V. 일반적인 이력서 (그림 2B, 파선)에 표시 됩니다.
    참고:이 입증 해야 거의 순수 용량 성 행동과 주변 산소 조건 에서도 중요 한 faradaic 전류의 부재 여기서 합니다.
  5. 전기 화학 셀 proteoliposomes (0.5 mg/mL 최종 지질 농도, 1-2% (w/w) 시 토 크롬 보3 지질의 비율)을 추가 하 고는 피 펫과 약간 혼합. Proteoliposomes 전극 표면에의 흡착은 완료 (30-60 분 상 온에서) 때까지 기다립니다.
    참고: 10 mV/s에서 순환 voltammograms (CVs) proteoliposomes 흡착 과정을 수행 하는 동안 실행할 수 있습니다. 흡착 연속 CVs 중지 변경 완료 됩니다. CV 기법에 대 한 정보는 다음 교과서에서 찾을 수 있습니다. 19 , 20
  6. 버퍼 솔루션 10 번 이상 변경 하 여 셀을 씻고 있지만 전극 표면이 완전히 건조 떠나 마십시오.
  7. OCP (그림 2A, 파란 선) 골드 전극에 SAM 그대로 확인 하에서 전기 화학적 임피던스 분광학을 실행 하 고 CVs와 스캔 속도 10 및 100 mV/s 시 토 크롬에 의해 촉매 ubiquinol 산화 (와 산소 감소)를 관찰 하 보 3 0 V vs 그녀에 대 한 전기 quinone 감소의 발병 가능성에서) (그림 2B).

6. 효소 양성자 형광 현미경 검사 법에 의해 펌핑의 탐지

  1. 골드 전극 단계 5.5 (즉, 5 µ g/mL)에 비해 적은 proteoliposomes x 100을 사용 하 여 있지만 5 단계에서 수정 합니다. 단일 효소 연구, 감소 시 토 크롬 보3 지질 비율 0.1-0.2% (w/w).
    참고: 리 됩니다 띄엄띄엄 단일 기 형광 현미경 검사 법에 의해 모니터링 활성화 전극 표면에 흡착 됩니다. 이러한 단일 효소 조건에서 효소 전극 표면에 움직일 수 양의 촉매 전류의 관찰에 대 한 충분 하지 않습니다.
  2. 전기 화학 셀 침수 기름 한 방울과 함께 거꾸로 형광 현미경의 오일 목표 (60 X)에 놓습니다. 전극 표면에 초점을 FDLL 형광에 대 한 적절 한 필터를 사용 하 여. 단일 리 현미경/목표의 회절 한계에 밝은 반점으로 나타납니다. FDLL 형광의 이미지를 가져가 라.
  3. HPTS 형광 필터 세트 HPTS 형광은 명확 하 게 표시 하 고 배경에서 구별할 수 확인 하려면 현미경에의 한 전환 (선택한 노출 시간에 단계 6.4 참조). 그렇지 않으면 경우 빛의 강도 증가.
  4. 두 HPTS 필터 세트를 대체 하 여 초과 이미지 수집을 수행 하기 위해 현미경 소프트웨어 프로그램 (메뉴 응용 프로그램 | ND 취득 Define/Run). 최소한 이미지 인수 사이의 지연 시간을 설정 합니다. 이 실험에서 사용 하 여 1 s 노출 (때문에 터렛 운동) 0.3 s 지연.
    참고: 이러한 두 개의 채널에 형광 강렬 비율 나중 변환 됩니다 각 시간 지점에서 리 내부 pH에. 인수 기간; 예상된 pH 변화 속도 따라 다를 수 있습니다. 5 분은이 문서에서 사용 됩니다.
  5. 이미지 수집 동안 잠재력을 변경 하는 potentiostat의 설정을 조정 합니다. 예,이 실험에서 사용 하 여 다음과 같은 순서: 0-60 s: 잠재력 적용 (즉, OCP); 60-180 s-0.2 V (vs 그녀);: 180-300 s: 0.4 V (vs 그녀) 이 경우, 두 번째 단계에만 적용 된 잠재력 (-0.2 V vs 그녀)는 효율적으로 quinone 풀을 줄이기 위해 충분 한.
  6. 실행 동시에 타임된 이미지 수집 (현미경) 및 잠재적인 시퀀스 (potentiostat) 동시에 두 측정을 수동으로 시작 합니다.
    참고: 실험 반복할 수 있습니다 동일한 전극에 몇 시간 다른 영역 표면에서 현미경 단계 이동 하 여. 인수 사이의 지연 표면에 리의 완전 한 pH 평형 막으려고 5-10 분 이상 이어야 한다. 다른 기간 및 잠재적인 패턴 중 제한 때문에 HPTS의 photobleaching는 시간 이미징, 필요에 따라 적용할 수 있습니다.

7입니다. 형광 이미지 분석

참고: 일반적인 실험 즉, 두 개의 채널의 각 시간 단계 (예를 들어, 2.6 s) 이미지의 집합을 생성 (기간 * 2 / 2.6) 이미지. 이러한 이미지는 단일 효소 실험 하는 동안 기록 된 설정의 예로 연구 데이터 리즈 저장소21를 통해 액세스할 수 있습니다. 피지 (ImageJ) 및 높은 수준의 수학적 분석 프로그래밍 언어 소프트웨어 (이제부터 소프트웨어를 스크립팅으로 자세한 테이블의 자료 를 참조 함)를 사용 하 여 여러 단계는 이미지 처리에 의하여 이루어져 있었다.

  1. 피지를 사용 하 여 시간 경과 파일을 별도 이미지를 정렬 하 고 별도 채널 및 시간대 저장.
    1. 피지 내에서 제공 하는 Bioformats 가져오기를 사용 하 여 오픈 시간 경과 파일 (매크로 명령: 실행 ("바이오 형식 가져오기")).
    2. 플러그인 StackReg를 사용 하 여 정렬 단계 움직임을 담당 하는 첫 번째 각 프레임 또는 열 드리프트를 수집 하는 동안 발생 (매크로 명령: 실행 ("StackReg", "변환 번역 =")).
    3. 단일 폴더에 TIFF 형식에서 각 시간 단계 및 각 채널에 대 한 별도 압축 되지 않은 이미지 파일을 저장 합니다.
    4. 시간 경과 파일 메타 데이터에서 각 프레임에 대 한 정확한 타임 스탬프를 추출 하 고 이미지와 같은 폴더에 CSV 파일으로 저장. 또는, 수집 소프트웨어를 사용 하 여 타임 스탬프를 추출 하 고 수동으로 스프레드 시트 소프트웨어를 사용 하 여 CSV 파일에 저장 합니다.
      참고: 이미지와 타임 스탬프 폴더 이제 스크립트 소프트웨어에 의해 분석 될 준비가 되어 있습니다. 7.1.1 단계입니다. -7.1.4. 피지 스크립트를 사용 하 여 automatized 수 있습니다 (제공 되는 시간 경과 파일의 일괄 처리에 대 한 파이썬에서 작성 된 스크립트 사용 하 여 "Ctrl-Shift-N" (Windows), 다음 파일 | 오픈 스크립트를 로드).
  2. 스크립트 소프트웨어를 사용 하 여 이미지의 automatized 처리. 소프트웨어에 제공 된 코드를 로드 하 고 끝에 실행을 클릭 합니다. 메시지가 나타나면 단계 7.1에서에서 이미지가 포함 된 폴더를 선택 합니다.
    참고: 분석을 위한 스크립트 mlx 형식 라이브 스크립트, 식별 하 단일 리 차원 가우스 함수에 맞게, 필터링 하 고, 시간 적 각 관점에 pH 값을 측정의 광범위 한 의견으로 제공 됩니다. 다음 하위 단계는 스크립트에 의해 자동으로 실행 됩니다.
    1. 하나의 실험에 대 한 모든 시간 프레임 이미지를 메모리에 로드 합니다.
    2. 단일 채널 (선택 높은 형광 강도 채널)에 대 한 모든 이미지를 평균 하 고 평균된 이미지를 사용 하 여 단일 리 일치 수도 있습니다 모든 최대값을 식별.
    3. 맞는 평균 이미지 2D-가우스를 확인 된 최대 기능을 하 고는 결과 저장 맞는 각 liposome에 대 한 매개 변수 (예: 장착된 liposome 그림 4A 참조).
    4. 크기, 순환 성, 강도 등 예상된 단일 리 기준에 따라 최대값 필터링. 낮은 신호를 소음으로 인해 제대로 장착 되어 리 거부, 밀접 하 게 liposome 이웃 또는 너무 이미지 가장자리 있습니다.
    5. 외부 파일에서 타임 스탬프를 로드 하 고 별도로 각 시간 프레임 이미지 차원 가우스 함수에 필터링 된 각 liposome을 맞는.
      참고: 병렬 프로그래밍, 멀티 코어 CPU를 사용 하 여 크게 향상 시킬 수 계산 속도이 단계에서.
    6. 필터링 단계 7.2.4 적용 하지만 각 시간 프레임에서 유사한 기준에 따라 다시 리.
    7. 각 시간 단계에서 볼륨 2 채널에 장착 되어 2 차원 가우스 함수로의 비로는 liposome의 형광 강도 비율을 정의 합니다. 두 개의 HPTS 채널에서 결정 및 보정 곡선 (8 단계)를 사용 하 여 농도의 비율에서 pH 값을 계산 합니다. 리에 대 한 결과 pH-시간 곡선을 플롯 하 고 그들의 pH 잠재력 적용 될 때 변경 합니다.

8. 수행 HPTS 형광의 보정 곡선

참고: 변환할 HPTS 형광 비율 intravesicular pH, 보정 곡선 해야 합니다 먼저 설립을 골드 투과율, 필터 품질, 등등과 같은 실험의 특정 한 조건 계정에 걸릴. 이 단계는만 번 수행 하 고 설치 및 측정 매개 변수 6 단계에서 동일 하 게 유지로 캘리브레이션 데이터를 사용할 수 있습니다.

  1. (시 토 크롬 보3 단계 5와 6.1에 설명 된 대로) 없이 띄엄띄엄 흡착된 리와 전극 준비.
  2. 농도 100 ng/mL를 만들려고 버퍼의 2 개 mL를 에탄올에 0.1 mg/mL gramicidin 솔루션의 2 µ L를 추가 합니다.
  3. 두 개의 HPTS 채널에 대 한 두 개의 형광 이미지를 캡처하십시오.
  4. 그래서 1 M HCl 또는 1 M H2의 작은 aliquots의 추가 의해 세포의 pH를 변경4. 표준 pH 미터는 버퍼의 pH를 측정 하 고 두 개의 HPTS 채널에 대 한 두 개의 형광 이미지를 캡처하십시오.
  5. PH 범위 6-9 단계 8.4 반복 합니다.
  6. 7.2에서 알고리즘을 사용 하 여, 적합, 필터 및 모든 pH에서 개별 리의 평균 HPTS 형광 비율. 인계 HPTS 비율 평균 모든 리.
  7. 다음 방정식을 결과 pH 비 의존에 맞는:
    figure-protocol-1어디 pK는는, R는a 와 Rb는 피팅 매개 변수.
  8. PK는는, R는은 Rb하 고 변환 단계 7.2.7에서에서 개별 리의 HPTS 비율을 사용 합니다. 에 pH 값입니다.

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결과

6MH의 샘과 금 수정 커버 슬립 (전극)의 품질 각 전기 화학 임피던스 분광학 실험 하기 전에 검사 됩니다. 그림 2A 리 흡착 전후 전기 화학 임피던스 분광학을 사용 하 여 측정 하는 대표적인 콜 콜 플롯을 표시 합니다. 샘의 품질 충분 한 경우에, 임피던스 분광학 세미 원 콜-콜 플롯 결과 거의 순수 용량 성 행동을 보여주어야 합니다. 콜 콜 플롯에 세미 원의 지름 2.5-3.0 µ F/c m2 범위에 있어야 하는 전극 표면의 더블 레이어 커패시턴스를 같습니다. 커패시턴스 변경 해야 크게 리 흡착 시 비록 커패시턴스에 약간의 증가 (높은 리 범위, 그림 2A, 하단) 관찰 될 수 있습니다 또는 낮은 임피던스에 약간의 변화를 관찰할 수 있다 주파수 (낮은 liposome 그림 2A, 보장 ...

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토론

설명 하는 방법을 리로 재구성 될 수 있다 호흡 막 단백질에 의해 양수 하는 양성자를 공부 하는 게 적당 하다 고 quinone 풀 전자를 교환할 수 있습니다. Liposome 루멘 (그림 1A)에 pH에 민감한 (비율 계량) 염료를 사용 하 여 단일 효소 수준에서 양성자 펌프 활동을 모니터링할 수 있습니다.

방법은 전극 샘18수정 전자 교환 ubiquinone (또는 다른 퀴 논), 지질 bilayer에 통합의 능력에 의존 합니다. 샘, 수정 금 전극의 속성은 매우 구체적인. 리는 샘과 샘에 흡착 충분히 빠른 전기 화학 산화와 감소는 리에 quinone 수영장의 수 있도록 얇은 해야 필요가 있다. 중요 한 것은, 전극과 liposome 사이 상호 작용은 지질 막의 무결성을 손상 하지 않기 위하여 충분히 약한 있이 필요가 있다. 또한, 실험 시스템의 세부 사항에 따라 그것은 바람직한 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자 BBSRC (BB/P005454/1) 재정 지원에 대 한 인정합니다. NH는 VILLUM 재단 젊은 수 사관 프로그램에 의해 투자 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
6-메르캅토-1-헥산올(6MH)시그마45108897%
8-하이드록시피렌-1,3,6-트리술폰산(HPTS)BioChemika56360
알루미늄 홀더(전기화학 셀)맞춤형30x30x7 mm; 내경: 26 mm; 구멍 직경: 15 mm
보조 전극백금 와이어
클로로포름VWR 화학 물질83627
대장균 극성 지질Avanti100600C클로로포름 25mg/mL
에폭시EPO-TEK301-2FL저형광 에폭시
피지(ImageJ 1.52d)필수 플러그인: StackReg 및 TurboReg(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
필터 큐브("ATTO633")Chroma Technology Corporation예: 620/60 nm; 디엠 : 660 nm; Em: 700/75 nm
필터 큐브("HPTS1")Chroma Technology CorporationEx: 470/20 nm; 디엠 : 500 nm; Em: 535/48 nm
필터 큐브("HPTS2")Chroma Technology CorporationEx: 410/300 nm; 디엠 : 500 nm; Em: 535/48 nm
필터 큐브("텍사스 레드")Chroma Technology CorporationEx: 560/55 nm; 디엠 : 595 nm; Em: 645/75 nm
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL)ThermoFisher ScientificT1395MPTexasRed-DHPC가 이 작업에 사용되었습니다 (λ EXC 595 nm; &람다; em 615 nm)
형광 염료 표지 지질(FDLL)(대체)ATTO-TECAD 633-161ATTO633-DOPE를 대체재(λ EXC 630 nm; &람다; em 651 nm)
겔 여과 컬럼GE Healthcare28-9893-33HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, 추가 단백질 정제용
유리 커버슬립VWR International631-0172No 1.5
Glass syringeHamilton1725 RNR250 µ L
유리 바이알Scientific Glass Laboratories LtdT101/V11.75 mL 용량
GoldGoodFellow99.99%
GramacidinSigmaG5002
수은 황산염 기준 전극복사계(해시)E21M012
마이크로 원심분리기EppendorfMinispin NL040
현미경NikonEclipse Ti
현미경 카메라AndorZyla 5.5 sCMOS
현미경 램프NikonIntensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2Nikon현미경 수집 소프트웨어
n-Octyl β-D-glucopyranosideMelford LaboratoriesB2007
Nova 1.10MetrohmPotentiostat 제어 소프트웨어
ObjectiveNikonPlan Apo λ 60x/1.4 oil
OriginPro 2017OriginLab플로팅 소프트웨어
O-ring (Electrochemical cell)Orinoko내경: 16 mm; 단면: 1.5 mm
플라스틱 튜브Eppendorf3810X1.5 mL
폴리스티렌 마이크로비즈Bio-RAD152-3920Biobeads, 20-50 mesh
PotentiostatMetrohm AutolabPGSTAT 128N
PotentiostatCH InstrumentsCHI604C
스크립팅 소프트웨어MatlabR2017a필요한 도구 상자: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox'
실리콘 웨이퍼IDB Technologies LtdSi-C2 (N< 100>P)Ø 25 mm, 525 um 두께
테플론 셀 (전기화학 셀)맞춤 제작외경: 26 mm; 내경: 13.5 mm
템플-스트리핑 초평면 금 표면Platypus TechnologiesAU.1000.SWTSG대안적인 사용 준비가 완료된 초평면 금 표면 (필요에 따라 두께 100 nm 미만)
얇은 마이크로피펫 팁Sarstedt70.1190.100또는 유사한 gelloader 끝 200 µ L
유비퀴논-10시그마C-9538
초원심분리기Beckman-CoulterL-80XP(Ti 45 로터 포함
초음파 수조Fisher ScientificFB15063
의 )

참고문헌

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Cytochrome bo3pH HPTS

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