루시퍼 옐로우 - 인간 혈액-뇌 장벽의 세포 모델에서 강력한 파라셀룰러 투과성 마커

요약

우리는 루시퍼 옐로우 (LY)가 hCMEC/D3 세포 단층의 명백한 paracellular 투과성을 결정하는 강력한 마커, 인간 혈액 뇌 장벽의 체외 모델임을 입증하기 위해 형광 분석방법을 제시합니다. 우리는 배양 된 hCMEC / D3 세포에서 동시 단일 층 형성의 역학을 결정하기 위해이 분석기를 사용했습니다.

초록

혈액-뇌 장벽 BBB 는 비필수 이온및 독성 물질의 교환을 방지하기 위해 전신 순환과 뇌 사이의 장벽을 형성하는 내피 세포로 구성됩니다. 단단한 접합부(TJ)는 단층의 파라셀룰러 공간을 효과적으로 밀봉하여 손상되지 않은 장벽을 생성합니다. 본 연구는 명백한 투과성 계수(P 앱)를 결정하는 데 사용될 수 있는 LY기반 형광 분석(P app)을 설명하고, 그 결과로 인한 단층 형성의 역학을 결정하는 데 사용될 수 있다. hCMEC/D3 단층의 장벽 무결성. 우리는 또한 형질감염된 세포에 있는 TJ 기능 무결성을 결정하기 위하여 이 분석의 추가 유용성을 보여줍니다. LY P_앱 분석에서 우리의 데이터는 트랜스웰 설정에서 시드된 hCMEC/D3 세포가 LY 파라셀룰러 수송을 효과적으로 제한한다는 것을 보여준다 7 일 포스트 배양. 제시된 분석의 추가 유틸리티로서, 우리는 또한 DNA 나노 입자 형질감염이 hCMEC/D3 단층에서 LY 파라세포 수송을 변경하지 않는다는 것을 입증한다.

서론

혈액-뇌 장벽 (BBB) 뇌 조직에 플라즈마 구성 요소의 유입을 제한 하는 보호 장벽 이며 pericytes 같은 지원 세포와 함께 뇌 내 피 세포로 구성. BBB의 주요 역할은 말초 혈액과 중추 신경계(CNS) 사이의 공간을 밀봉하여 신경 미세 환경의 지혈을 유지하는 장벽역할을^한다1,^2. 뇌 모세관 내피 세포효과적으로 세포 간 단단한 접합부 (TJs)의 형성을통해 paracellular 통로를 밀봉 1. 이 보호 장벽은 포도당과 선택한 영양소가 뇌에 들어가는 것을 허용하며 대부분의 이온, 독성 물질 및 약물이 이 단단한 장벽을 통과하는 것을 방지합니다. BBB의 보호 역할 외에도, BBB의 자연 장벽 기능은 CNS를 대상으로 하는 약물 전달 시스템 개발에 심각한 도전을 제기합니다.

BBB의 체외 세포 배양 모델은 생물학을 연구하고 TJ 장벽 무결성에 대한 약물 치료의 효과를 이해하는 데 유용한 도구입니다. 우리는 인간 뇌 내피 의 허용 모델이기 때문에 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포주 (hCMEC / D3)를 시험관 내 모델로 사용³ 인간 BBB의 많은 기능을 재현. hCMEC/D3is 는 시험관 내 BBB 모델링에 가장 일반적으로사용되는 세포주 중 하나 이며, 5, 5,^6,7,^8,9. 피질 전기 저항의 비교적 낮은 값에도 불구하고 (TEER), 장벽 압박감의 측정, 이 세포주는 뇌 내피 세포의 형태학적 및 기능적 특성의 대부분을 유지, 심지어의 부재에서 단일 배양으로 교양 세포^6,7. hCMEC/D3 세포주 들은 불안정한 표현형^6,7,9에 대한 분화를 거치지 않고 대략 통로 35까지 활성 수송기 및 수용체를 포함한 다중 BBB 마커를 발현합니다. ^,10,11. 체외 BBB 모델로 hCMEC/D3 세포주의 가장 눈에 띄는 특징은 TJs^5,9,^11,12를형성하는 능력입니다. 줄기 세포 유래 BBB 모델은 hCMEC/D3 세포주와 비교하여 많은 연구에서 더 높은 투과성을 보였고 일부 BBB 마커를 발현하지만, 그들은 아직 가장 일반적인 BBB 세포 모델^13으로진화하지 못하고 있다는 점에 유의해야 한다. 중요하게도, 줄기세포 유래 BBB 모델은 세포가 안정적인 BBB 표현형을 유지할 수 있도록 하는 최대 통로 수에 대하여 특징지어지도록 남아^{있다 14.}

세 가지 주요 방법은 일반적으로 TER의 측정, 자당, 이눌린, 루시퍼 옐로우와같은 작은 친수성 추적자 분자의 명백한 투과성 계수(P app)의 측정을 포함하여 TJ 장벽 무결성을 결정하는 데 일반적으로 사용되며, 클라딘-5, ZO-1, 옥클루딘 등과 같은 TJs의 공지된 분자 마커의면역 염색 등 5. TEER는 다공성 멤브레인 기판^에서배양된 세포 단층 전반에 걸쳐 전기 저항을 측정하는 비교적 간단하고 정량적인 방법 5. 그러나 TEER 값은 배양 배지의 조성 및 측정 기기의 유형과 같은 실험 변수에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이러한 요인의 가능성이 조합은 2-21일 동안 배양된 hCMEC/D3 세포주에서 2~1150Ω cm2에 이르는 TEER 값의 광범위한 분포를 13일 동안 이끈다. 면역염색은 항체를 사용하여 표적 단백질에 라벨을 붙임으로써 TJ 단백질의 존재를 결정하는 시각적 방법이다. 그러나, 면역 염색은 실험적인 유물 귀착될 수 있는 세포를 고치고 침투할 필요를 포함하여 일련의 실험 단계를 관련시키고 형광 신호는 시간이 지남에 따라 퇴색할 수 있습니다. 위의 요인으로 인해 데이터 품질에 영향을 미치는 주관적인 오류가 발생할 수 있습니다.

이 작업의 주요 초점은 LY 기반 명백한 투과성 분석이 배양 된 hCMEC / D3 세포에서 동시 단일 층 형성의 역학을 결정하는 것입니다. 공동 배양 시스템, 미세 유체 시스템과 같은 다른 고급 시험관 내 BBB 시스템은 생리적으로 더 관련성이 높지만 장벽 기능^15,16,17,hCMEC/D3 transwell 설정은 TJ 형성의 역학을 추정하고 신속하게 장벽 기능에 다른 약물 제형의 효과를 스크리킹하는 간단하고 신뢰할 수있는 모델입니다. 일반적으로 P_앱 값은 hCMEC/D3 단층의 다양한 친수성 용정에 대해 일관됩니다. 예를 들어, 다양한 저분자 질량 용출체(예: 자당, 만니톨, LY 등)에 대한 보고된 P_앱 값은 상이한 시험관 내 BBB 모델에서 10-4 cm/min 5,^18,19의 순서로 ^{, 20}. 우리의 실험 설정에서, 뇌 내피 세포는 생체 내 장벽을 모방하는 세포 부착 및 단층 형성을위한 콜라겐 코팅 미세 다공성 멤브레인에 시드된다. 정점 측에 첨가된 LY는 세포간 단단한 접합을 통과하고 basolateral 측에 축적될 것으로 예상된다. basolater측에서 LY의 더 큰 농도는 미성숙하고 완전하지 않은 기능 장벽을 나타내고 낮은 농도는 성숙한 장벽의 결과로 기능성 TJ의 존재로 인해 제한된 수송을 반영합니다.

LY는 뚜렷한 여기/방출 피크를 가진 친수성 염료이고 자당, 만니톨 또는 이눌린과 같은 추적자 분자를 방사성 표지하는 필요를 방지합니다. 따라서, LY의 형광 값은 BBB 단층전반에 걸쳐 의 파라셀룰러 투과성을 직접 계산하는데 사용될 수 있다. 또한, 형광과 같은 작은 스토크스 교대로 고통받는 생물 의학 분야에서 사용되는 많은 상용염료와 비교하여, LY의 스토크스 시프트는 충분한 스펙트럼 분리를 가진 약 108 nm이며, 따라서 LY 형광 데이터를 강력한 판독을 통해 파라셀룰러 투과성을 결정합니다. 우리는 접합 마커 단백질, ZO-1의 발현의 변화를 보여주기 위해 직교 기술로 서양 블로팅을 사용했습니다. 서양 블로팅을 통해 검출된 ZO-1 발현은 LY P_앱 데이터를 보충하는 데 사용되며, 이러한 데이터는 LY P_앱 값의 관찰된 변화가 점진적인 증가와 함께 단층의 형성을 반영한다는 것을 시사한다. 타이트 한 접합 마커, ZO-1의 표현.

앞서 지적했듯이, 이 작업의 중심은 기능적 단단한 접합부가 있는 결합단층의 형성을 모니터링하는 간단한 기법으로서 LY 분석법을 입증하는 것이다. 그러나, 개발된 분석법의 추가적인 유용성을 입증하기 위해, 우리는 DNA 나노입자 형질감염된 hCMEC/D3 단층에서 LY P_앱을 측정했다. 핵산은 중합체의 양전하 그룹과 음전하인 인산의 중화기 그룹(22) 사이의 정전기 적 상호 작용을 통해 직경 100-200nm의 다연화 나노 입자로 응축 될^{수있다. 23}. 우리는 이 복합체를 우리의 일에서 DNA 나노 입자 (DNA NPs)로 지칭합니다. 우리의 의도는 세포를 트랜스펙트하고 원하는 단백질을 표현하는 것이지만, 우리는 hCMEC/D3 단층의 장벽 특성이 손상되지 않도록 해야 합니다. 우리의 데이터는 표준 4 시간 luciferase 유전자 형질감염 정권이 TJ 장벽 무결성에 있는 변경을 결정하기 위하여 LY P_app 분석의 유용성을 입증하는 LY 투과성을 측정가능하게 바꾸지 않는다는 것을 건의합니다.

프로토콜

1. 일반 hCMEC/D3 세포 배양

1. 냉동 세포의 소생술
   참고: 모든 세포 배양 유지 및 실험은 멸균 된 생물 안전 성 후드 내부에서 수행되었습니다. 배양 배지, 보충제 및 시약은 미생물 오염을 방지하기 위해 0.22 μm 멤브레인 필터를 사용하여 여과를 통해 멸균 제품으로 구입하거나 살균하였다.
   1. 조직 배양 플라스크 (75 cm² 성장 영역; 이제부터 T75로 언급)에 콜라겐 용액 (0.15mg / mL)의 8.5 mL를 추가하고 인큐베이터 (37 °C, 5 % CO 2)에 1 시간 동안 배치합니다.
   2. 콜라겐 용액을 제거하고 멸균 된 인산완식염수 (PBS)로 플라스크를 부드럽게 씻으십시오. 플라스크에 15 mL의 완전한 성장 배지를 넣고 CO2 인큐베이터에 15 분 동안 둡니다.
      참고: 전체 배지(최종 농도)에는 태아 소 혈청(5%), 페니실린-스트렙토마이신(1%), 하이드로코르티손(1.4 μM), 산 아스코르브(5 μg/mL), 화학적으로 정의된 지질이 함유된 내피 세포 성장 기저 배지 2(500 mL)가 포함되어 있습니다. 농축액 (1/100), HEPES (10 mM) 및 기본 섬유아세포 성장 인자 (1 ng / mL).
   3. 액체 질소 탱크에서 냉동 hCMEC / D3 세포의 저온을 이동하고 37 °C 수조 (< 1 분)에서 유리병을 빠르게 해동합니다.
   4. 얼음의 작은 조각만 보이게되면, 신속하게 흡인하고 미리 온난 한 매체를 포함하는 플라스크에 세포를 전송합니다. 플라스크를 부드럽게 흔들어 세포와 성장 배지를 혼합할 수 있도록 합니다.
   5. 플라스크를 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 놓고 2시간 후 가벼운 현미경으로 세포를 관찰하여 세포가 부착되었는지 확인한다.
   6. 일단 세포가 플라스크의 바닥에 부착되면, 오래된 성장 배지를 제거하고 10 mL의 신선한 미리 온난화 된 성장 배지를 추가하여 구성장 배지^(24)에서디메틸설플록사이드를 대체한다.
   7. 24 시간 후, 스핀들 모양의 세포를 관찰하고 미리 온난 신선한 성장 매체로 오래된 성장 매체를 대체하기 위해 가벼운 현미경으로 확인하십시오.
2. 세포 배양 유지
   1. 100% 합류까지 격일로 성장 매체를 보충하십시오. 이전 성장 배지를 제거하기 전에 현미경으로 세포를 확인하고 또한 신선한 성장 배지를 첨가한 후에. 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내서 hCMEC/D3 세포가 정상 대조 현미경으로 검사하여 건강하게 보이도록 합니다.
      참고 : 세포의 대부분은 플라스크의 바닥에 부착되어야하며, 스핀들 모양의 형태를 가지고 있으며 종종 멤브레인 주위의 빛이 굴절되는 것도 볼 수 있습니다. 성장 매체는 투명 (비 흐린) 및 분홍색 - 주황색이어야한다.
   2. 플라스크에서 오래된 성장 배지를 제거하고 미리 데운 신선한 배지 10 mL를 플라스크에 옮니다.
      참고: 배지는 세포 부착에 영향을 미치지 않도록 플라스크의 위쪽에 직접 추가하지 않아야 합니다.
   3. 플라스크를 다시 수평 위치로 돌려 여러 번 부드럽게 흔들고 현미경으로 hCMEC /D3 세포를 확인한 후 플라스크를 인큐베이터 (37 °C, 5 % CO 2)로 되돌립니다.
   4. 세포를 취급하기 전과 후에 정기적으로 배양하는 동안과 실험 중에 반전된 빛 현미경으로 세포를 관찰합니다. 실험실 노트북에서 세포 수 또는 형태학의 눈에 띄는 변화를 기록합니다.
3. 셀 패시징
   1. 인큐베이터에서 1시간 동안 8.5 mL의 콜라겐 용액으로 새로운 T75 플라스크를 배양합니다(37°C, 5% CO2).
   2. 콜라겐 용액을 제거하고 멸균 된 PBS로 플라스크를 부드럽게 씻으십시오. 미리 온난hCMEC/D3 배지 10 mL를 새 플라스크에 넣고 플라스크를 인큐베이터에 넣습니다(37°C, 5% CO2).
   3. 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내고 상 대비 현미경으로 hCMEC/D3 세포를 검사하여 세포가 100% 동급인지 확인합니다.
   4. 세포를 함유한 플라스크에서 hCMEC/D3 세포 배지를 제거하고 10 mL의 PBS로 hCMEC/D3 세포를 세척합니다.
      참고: 성장 배지에 첨가된 FBS에는 α1-안티트립신 및 α2-마크로글로불린과 같은 프로테아제 억제제가 함유되어 있다. 이들은 트립시니화 과정을 억제합니다. 따라서, 트립시니화 과정의 억제를 방지하기 위해 FBS의 흔적을 제거하기 위해 PBS로 세포를 세척하는 것이 필수적이다.
   5. 0.02% EDTA를 함유한 0.25% 트립신 용액 1mL를 추가하고 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 2-5분 동안 트립시니화(플라스크를 옆으로 가볍게 두드려 분리를 돕습니다).
      참고: 트립신/EDTA에 세포를 6분 이상 두지 마십시오.
   6. 미리 데운 hCMEC/D3 배지 10mL를 추가하여 트립시네화 과정을 중단하고 hCMEC/D3 셀을 여러 번 위아래로 파이펫팅하여 다시 일시 중단합니다. 이어서, 플라스크로부터 전체 세포 현탁액을 15 mL 튜브로 제거한다.
   7. 15 mL 튜브로부터 세포 현탁액의 1 mL을 미리 데운 신선한 배지(분할 세포 1:10)로 새로운 플라스크로 옮기고 새로운 플라스크를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.
      참고: 새로운 플라스크로 옮기기 전에 셀 서스펜션을 여러 번 위아래로 피펫하여 세포 농도 구배를 최소화합니다.

2. 셀 도금

1. 미세 다공성 멤브레인 (공극 크기 : 0.4 μm, 재료 : 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET))을 가진 조직 배양 삽입물을 24 웰 배양 판에 넣습니다.
2. 콜라겐 타입 I(0.15 mg/mL)을 각 조직 배양 삽입에 400 μL을 넣고 CO2 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 1시간 동안 배양한다. 24웰 플레이트를 부드럽게 흔들어 조직 배양 삽입물에서 미세다공성 멤브레인 위에 콜라겐 용액을 퍼지게 한다.
3. 콜라겐 용액을 제거하고 1x PBS 완충액0.4 mL로 미세 다공성 멤브레인을 부드럽게 세척합니다.
4. 세포 삽입에서 50,000 셀 / cm 2의 밀도를 가진 플레이트 hCMEC / D3 세포 (배지의 500 μL에서 15,000 셀).
   참고: 각 조직 배양 삽입에서 세포 수의 차이를 최소화하기 위해, 세포 현탁액을 삽입에 세포를 추가하기 전에 10 mL 파이펫으로 재중단하였다.
5. 세포 부착 및 증식을 허용하기 위해 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 조직 배양 셋업을 가진 24웰 플레이트를 놓는다.
6. 세포가 100 % 동률에 도달 할 수 있도록 7 일 동안 플레이트를 배양. 격일로 성장 배지를 제거하고 미리 온난한 신선한 배지0.5 mL를 조직 배양 인서츠로 옮김을 전달한다.
7. 도금 절차(단계 2.2-2.6)를 12웰 플레이트, 48웰 플레이트 및 96웰 플레이트에서 반복합니다. ZO-1 발현의 변화를 결정하기 위해 웨스턴 블로팅에 12웰 플레이트를 사용합니다. DNA NP 형질전환에 48웰 플레이트를 사용한다. ATP 분석에 대한 96 웰 플레이트를 사용하여 형질감염된 세포에서 세포 생존 가능성을 결정합니다.

3. 세포 성장의 역학.

1. 콜라겐 코팅 된 24 웰 조직 배양 플레이트에서 50,000 세포 / cm 2의 밀도로 세포를 시드.
2. 실험의 매일, 성장 배지를 제거하고 1x PBS의 500 μL로 세포를 두 번 부드럽게 세척하였다. 이어서, 0.02% EDTA를 함유하는 0.25% 트립신 용액의 30 μL을 첨가하고 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에 약 2-5분 동안 플레이트를 남긴다.
   참고 : 부유 한 단층의 점진적 형성은 세포 분리의 정도에 영향을 미칠 수 있으며 여기에 표시된 대로 트립신 / EDTA의 양을 증가시킬 필요가있다 : 1-5 일 후 시딩 30 μL, 6-7 일 후 파종 및 8-10 일 후 시딩100 μL .
3. 3.2단계에서 첨가된 트립신/EDTA 용액의 부피에 기초하여 470 μL, 440 μL 또는 400 μL의 성장 배지를 추가하여 각 웰에서 500 μL의 세포 현탁액을 준비한다.
4. 각 우물에서 위아래로 파이펫팅하여 세포를 중단하고 모든 세포가 성장 배지에 매달려 있는지 확인하기 위해 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 일부 세포가 여러 번 파이펫팅 한 후에도 플레이트 바닥에 부착된 경우, 세포 분리를 용이하게하기 위해 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 부드럽게 긁어 냅니다.
5. 3.3단계에서 500 μL 셀 현탁액으로부터 0.1 mL의 세포 현탁액을 제거하고 1.5 mL 튜브를 첨가합니다. 그런 다음 0.1 mL의 0.4% Trypan blue 용액을 셀 서스펜션에 넣고 잘 섞습니다.
6. 70% 이소프로필 알코올로 헤마시토미터를 청소하십시오. V-홈의 각 측면에 3.5 단계에서 혼합물 20 μL을 추가하고 현미경 아래 16 사각형을 찾습니다. 16개의 사각형은 하나의 그리드로 간주됩니다. hemacytometer의 각 측면에 두 개의 임의의 격자를 찾아 모든 살아있는, 비 파란색 세포를 계산합니다.
   참고: 카운트에서 제외된 파란색으로 나타난 셀은 모든 시점에서 파란색으로 염색된 셀입니다.
7. 다음 수식을 기준으로셀 밀도(셀/cm2)를 계산합니다.
   평균 셀/그리드 = (Eq.1)
   희석 계수 = (Eq.2)
   세포 밀도 (생존세포 / cm2) =
   
   (Eq.3)
   방정식 1-3. 생존 세포는 각 그리드에 카운트된 셀의 수, 격자 수가 현미경 아래에 위치한 그리드의 수에 해당하며, 셀 현탁액과 0.4% 트리판 블루의 혼합물의 부피는 3.5단계에서 제조된 부피이며, 세포 현탁액의 부피는 제거된다. 500 μL 세포 현탁액으로부터 제거된 부피는 3.5단계에서, 각 웰에서 세포 현탁액의 부피는 3.3단계에서 500 μL 세포 현탁액이며, 조직 배양판의 성장 영역은 24웰 플레이트에서 단일 웰의 성장 영역이다.

4. 루시퍼 노란색 명백한 투과성 (LY P _응용 프로그램) 분석

1. 매일 시드 후 LY P_앱을 확인보려면 4.3부터 단계를 따르십시오. 형질감염 hCMEC/D3 세포에서 P_어플을 결정하기 위해, 형질감염 제제의 8.3 μL을 첨가(그림1)완전한 성장 배지의 50 μL과 혼합하고 4 시간 동안 배양한 형질감염 제형은 섹션 5에 기재되어 있다.
2. 4 시간 형질 감염 후 멸균 1x PBS 버퍼를 사용하여 상피 면을 두 번 부드럽게 씻어 잔류 형질 감염 혼합물을 제거합니다. 제거 후 남겨진 PBS 버퍼의 다양한 부적은 정점 측의 LY 농도에 영향을 줄 수 있습니다. 조직 배양 삽입물에서 잔류 PBS 버퍼가 완전히 제거되었는지 확인하십시오. 조심스럽게 세포 분리를 최소화하기 위해 잔류 시약 및 매체를 흡인합니다.
   참고: 이 단계는 hCMEC/D3 셀의 매일 명백한 투과성(P_앱)을측정할 때 건너뜁니다.
3. 성장 배지를 제거하고 미리 온난(37°C) 수송 완충액(25 mM HEPES, 145 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM CaCl_2,0.5 mM MgCl_2,1 mM NaH₂PO_4,5 mM 포도당, pH 7.4)을 basolater측에 첨가한다.
   참고: 모든 basolateral 구획의 전송 버퍼 의 부피는 투과성 계수 계산의 정확성을 보장하기 위해 동일해야 합니다.
4. 각 트랜스웰 인서트의 정점 면에 58.3 μL의 20 μM LY 용액을 추가합니다. 형광 측정을 위해 20 μM LY 솔루션의 50 μL을 절약하십시오. 잔류 PBS 버퍼를 정점 쪽에서 완전히 제거한 후, HCMEC/D3 셀이 건조되지 않도록 가능한 한 빨리 LY 용액을 추가하십시오. 정점 측면에서 LY 솔루션의 정확한 볼륨을 보장합니다.
   참고: LY 형광 강도의 감쇠를 최소화하려면 빛 노출을 제한해야 합니다. LY 분말이 재구성되면 용액을 4 °C에 보관하여 빛으로부터 보호해야합니다.
5. 회전판 셰이커(37°C, 100 rpm)를 60분 동안 인큐베이션합니다. 이어서, 각 정점 구획에서 LY 샘플의 30 μL을 제거한다. 그런 다음 20 μM LY 용액과 정점 측 샘플을 미리 표지된 튜브로 옮기고 운반 버퍼를 사용하여 샘플을 10배 희석합니다.
   참고: 이러한 샘플의 높은 형광 강도가 잠재적으로 과부하및 형광 마이크로 플레이트 리더의 형광 검출기를 손상시킬 수 있기 때문에 20 μM LY 스톡 용액 및 정점 측 샘플을 희석하는 것이 요구됩니다.
6. 각 basolateral 구획에서 500 μL을 제거하고 미리 표지된 튜브로 샘플을 옮김을 옮김을 옮니다.
   참고: 샘플은 표시된 시점에서 별도의 트랜스웰에서 제거됩니다. 시간은 1일째부터 10일째까지 의 식후 시드를 매일 시작합니다.
7. 표준 곡선(39.00 nM, 78.13 nM, 156.25 nM, 312 nM, 625 nM, 1250 nM, 2500 nM)에 대한 일련의 LY 표준을 준비합니다.
8. 각 표준(중복), 정점 및 바소측 샘플을 검정 96웰 플레이트에 각각 100μL을 추가합니다(그림 1).
   참고: 블랙 플레이트는 빛을 흡수하고 웰 간의 배경 및 형광 크로스오버를 줄입니다.
9. 형광 마이크로플레이트 리더(set points: 여기 428 nm, 방출 536 nm)를 사용하여 LY 형광 강도를 측정하여 P_앱을계산한다. 형광 플레이트 판독기가 본 연구에 사용된다.
10. 원고 텍스트에 설명된 대로 P_앱 및 %LY 복구 값을 계산합니다.
    방정식 4. P_앱 값을 계산하기 위한공식입니다.
    다음 방정식을 사용하여 명백한투과성(P 앱) 계수와 %LY 복구를 계산합니다. P_앱 값은 질량²⁵ 또는 LY 농도를 기준으로 계산할 수 있습니다.
     또는
    V_A - 상피 컴파트먼트의 볼륨
    V_B - 바소측 구획의 부피
    A - 트랜스웰 인서트 멤브레인의표면적(0.3 cm 2)
    M_A0 - 상판 구획의 초기 질량
    ΔM_B/Δt - basolateral 구획에서 시간이 지남에 따라 질량의 변화
    CA0 - 정점 구획의 초기 농도
    ΔC_B/Δt - basolateral 구획에서 시간이 지남에 따라 농도의 변화.
    방정식 5. % LY 복구를 계산하기위한 공식.
    복구 (%) = 
    M Af는 종점 지점에서 의 상체 구획내의 질량이고, M_Bf는 종점 지점에서 의 basolateral 구획내의 질량이고, M_A0은 정점 구획내의 초기 질량이다. ²⁶ 주: 초기 질량은 4.5단계에서 20 μM LY 용액의 부피를 기준으로 계산됩니다. 본 실험은 항상 통로 번호 35 의 밑에 세포를 사용하여 행해진 4개의 독립적인 시간을 행하였다.

5. 칼슘 고갈

1. 트랜스웰 인서트와 12웰 플레이트에서 성장 배지를 제거하고 미리 온난한 칼슘 프리 배지(최소 필수 배지 이글 스피너(S-MEM) 배지를 사용하여 상피면과 12웰 플레이트를 부드럽게 세척하여 트랜스웰 인서트에서 칼슘 이온을 제거합니다. 및 12 웰 플레이트.
2. 인서트 또는 12웰 플레이트에 500 μL 또는 2 mL의 미리 온화된 S-MEM 1xmedium를 넣고 인큐베이터에서 24시간동안 배양합니다(37°C, 5% CO2). 배양 후, S-MEM 1x 배지를 제거하고 미리 데운 1x PBS 버퍼를 사용하여 세포를 한 번 세척합니다.
3. LY 치료 및 후속 단계에 대해 섹션 4에 설명된 4.4-4.10 단계를 따르십시오. 8.1.2-8.2.4 단계는 섹션 8에 설명된 웨스턴 블로팅 및 후속 단계에 대해 설명합니다.

6. 감염

1. DNA 나노 입자 (DNA NPs)의 준비.
   1. 10 mM 나트륨 아세테이트 (NaAc) 완충액 (pH 5.0)에서 gWIZ-Luc 플라스미드의 스톡 용액을 희석하고 DNA 용액이 실온 (RT)에서 10 분 동안 방치되도록하십시오.
      참고: 우세하게 단 하나 DNA 분자를 포함하는 DNA NP는 DNA 농도 20-40 μg/mL^23에서준비될 수 있습니다. 따라서, gWIZ-Luc 플라스미드 스톡 용액은 희석될 필요가 있다. 얼어붙은 gWIZ-Luc 플라스미드 스톡은 온도 응력을 최소화하기 위해 얼음 위에서 완전히 해동되어야 합니다. 노브 위치 3-5에 설정된 표준 벤치탑 와류에 30s의 희석 된 DNA 스톡 솔루션을 부드럽게 소용돌이치십시오.
   2. NP 컴포지션을 반영하는 숫자 매개변수로 여기에 사용된 원하는 N/P 비율을 계산합니다.
      
      수학식 6. N/P 비율 계산: 양이온 성 중합체의 아민 그룹의 두더지의 비율과 DNA의 인산염 그룹의 비율. 양이온 성 중합체의 질량은 양이온 중합체의 총 계량량을 의미한다; (질량/충전) _{양이온성 중합체는} 양이온성 중합체(폴리(ethyleneglycol)5k-블록-폴리아스파르타미드48디틸레네트리아민 측사슬(PEG-DET)의 분자량을 말하며, 양이온성 중합체 당 1차 아민(48)의 수로 정규화된다. 몰 /몰), 우리의 폴리머에 대한이 값은 306 Da; DNA의 질량은 mg/mL에 있는 양 및 농도를 곱하여 장악된 제형에서 사용된 DNA의 총 양을 의미합니다; (질량/충전) _DNA는 이중 가닥 DNA 당 인산염 군수로 정규화된 DNA의 분자량을 지칭한다(뉴클레오베이스당 325 Da).
      참고: DNA NP 제제표(표 1)는 실험에서 시험된 상이한 시료에 대한 제형 레시피를 함유하고 있다. DNA NP는 신속한 적정 기술을 사용하여 제조하였다. PEG-DET 폴리머 용액을 튜브의 벽을 따라 수평 위치에 튜브를 유지하면서 첨가하였습니다. 그런 다음 튜브를 수직 위치로 전환한 다음 10초 동안 최대 속도로 빠르게 소용돌이치게 했습니다. DNA NP는 사용 전에 RT에서 30분 동안 방치되었다. DNA NP 투약에 대한 엄지 손가락의 규칙은 ca. 1 cm2 성장 영역에 대한 0.5 μg DNA이다. 따라서 96웰 플레이트의 48웰 플레이트/각 웰의 트랜스웰 삽입/각 웰에 대해 gWIZ-Luc DNA의 0.157/0.5/0.195 μg/well을 포함하는 N/P 10에서 DNA NP를 준비합니다.
   3. 폴록사머 P84(P84)의 표시된 농도를 함유한 시료의 경우, DNA NP에 P84를 추가하고 5초 동안 소용돌이를 추가합니다. 각 샘플에서 P84의 최종 농도는 0.01% 또는 0.03% wt입니다.
2. 48웰 플레이트 설정에서 DNA NP 형질전환
   1. 48웰 플레이트에서 50,000 셀/cm2의 밀도를 가진 세포를 종자하고 인큐베이터에 합류할 때까지 성장한다(37°C, 5% CO2).
   2. 각 처리 군에 대해, 표시된 시료(형질감염 제제)의 25 μL과 150 μL의 완전한 성장 배지 및 175 μL의 혼합물을 각각 잘 혼합한다.
   3. 현미경으로 hCMEC/D3 세포를 관찰하여 세포가 건강하게 나타나고 실험 시 100% 수렴되었는지 확인합니다.
   4. 웰 및 175 μL 형질전환 혼합물로부터 성장 배지를 각각의 웰로 제거한다. 이어서, 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 4시간동안 플레이트를 배양한다.
   5. 4 시간 후, 형질 감염 혼합물을 제거하고 미리 온난 멸균 1x PBS 버퍼로 hCMEC / D3 세포를 세척하십시오.
      참고: 세척 단계 동안 플레이트/삽입 표면에서 hCMEC/D3 세포의 우발적인 분리를 최소화하려면 우물 벽을 따라 충분한 멸균 PBS를 조심스럽게 파이펫하고 잔류 배양 매체의 나노 입자를 제거합니다.
   6. 플레이트를 몇 번 부드럽게 흔들어 조심스럽게 흡인하고 PBS 세척을 폐기하고 hCMEC /D3 미리 온난화 배양 배지 500 μL을 추가하십시오.
   7. 현미경으로 세포를 검사하고 세포 형태와 형질전환의 가능한 효과에 대한 관찰을 기록합니다.
   8. 37°C 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하여 루시퍼라아제 생산을 허용하였다. 24 시간 후, 성장 매체를 완전히 제거하고 미리 데운 1x PBS로 세포를 한 번 씻으하십시오.
   9. 형질감염된 세포를 100 μL의 얼음-차가운 루시퍼라아제 세포 배양 용해 액을 웰당 1x 시약에 첨가하여 용해시킨다.
   10. 루시퍼라제 단백질 함량측정을 위해, 세포 용해액 20 μL과 루시퍼라제 분석 버퍼 100 μL(20 mM 글리실글리신(pH 8), 1 mM MgCl_2,0.1 mM EDTA, 3.5 mM DTT, 0.5 mM ATP, 0.27 mM 코임효소 A를 1m에 추가합니다.
   11. 단일 자동 인젝터를 사용하여 루미노미터에서 6.2.10 단계에 설명된 샘플의 발광을 읽어보십시오.
       참고 : 발광은 읽기 전에 10 s 이상 통합되어야합니다.
   12. 제조자의 프로토콜에 따라 비신코닌산 분석(BCA 분석) 키트를 사용하여 용해수제에서 세포 단백질의 총량을 측정하였다.
   13. 총 세포 단백질당 상대광 단위(RLU)로 루시퍼라아제 유전자 발현을 계산하고 발현한다.

7. 발광 ATP 분석

1. 96웰 플레이트에서 50,000 셀/cm2의 밀도를 가진 세포를 종자하고 인큐베이터에 합류할 때까지 성장한다(37°C, 5% CO2).
2. 형질감염 제제의 9.7 μL로 세포를 트랜스펙트(제제 상세는 섹션 6에 있음) 및 4 시간 동안 완전한 성장 배지의 58.4 μL.
3. 형질감염 혼합물을 제거하고 미리 가열된 PBS 1x 버퍼로 세포를 부드럽게 세척하여 처리 시약을 완전히 제거합니다.
   참고: 잔류 버퍼의 양이 다르면 ATP 분석 시약을 다른 범위로 희석시킬 수 있으며 데이터에 잠재적으로 영향을 줄 수 있습니다.
4. 다중 채널 파이펫을 사용하여 1:1 희석에 신선한 미리 온난배지 및 ATP 분석 시약의 75 μL을 혼합한다. 모든 멀티채널 파이펫 팁의 액체 레벨이 동일한지 확인합니다.
5. 접시를 영양 쉐이커에 실온에서 15분 동안 놓습니다. 시약을 첨가한 후 15분 후에 각 시료의 60 μL을 흰색 96웰 플레이트에 옮김을 옮김을 넣습니다.
   참고 : 흰색 플레이트는 투명 또는 검은 색 플레이트보다 출력 빛을 반사하는 것이 좋습니다.
6. 접시를 읽기 전에 바늘을 사용하여 기포를 팝. 1s 의 통합 시간으로 광도계에서 플레이트를 읽으십시오. ATP 분석 시약을 추가한 후 20분 이내에 플레이트를 판독합니다. 발광 신호가 빠른 감쇠 속도로 과도하기 때문에 타이밍은 다른 플레이트에서 비교하는 데 중요합니다.
7. 백분율 계산(%) 이 공식을 사용하여 세포 생존 : (형질 감염 된 세포의 발광 / 제어의 발광, 치료되지 않은 세포) x 100.

8. 단단한 접합 단백질 ZO-1의 측정을 위한 서쪽 블로팅

1. 세포 라 해 및 단백질 추출
   참고 : 세포에서 단백질 추출을위한 모든 단계는 2-8 °C에서 수행되어야합니다.
   1. 콜라겐 코팅 된 12 웰 조직 배양 플레이트에서 50,000 세포 / cm 2의 밀도로 세포를 시드.
   2. 3일째, 5일째, 7일째, 10일째에 파종 후 7일째(칼슘 프리 배지로 미리 배양된 세포)에, 성장 배지를 제거하고 2 mL의 얼음-차가운 1x PBS로 세포를 2회 부드럽게 세척한다. 그런 다음, 각 우물에 3 μg/mL 아프로티닌을 함유한 얼음-차가운 1x RIPA 용해 완충액의 300 μL 혼합물을 추가합니다.
      참고 : 혼합물은 신선하게 만들어 얼음에 보관해야합니다. 아프로티닌은 관심 있는 단백질을 저하시키는 용해제에 존재하는 프로테아제의 억제에 사용됩니다.
   3. 두 번의 동결 해동 주기(-80°C) 후, 차가운 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁어냅니다. 마이크로 퍼지 튜브에서 세포 가해를 수집합니다. 이어서, 튜브를 200 x g에서 4°C에서 30분 동안 원심분리한다.
   4. 깨끗한 튜브에 상급을 수집하고 얼음에 배치합니다. BCA 분석 키트를 사용하여 용해액에서 세포 단백질의 총량을 제조업체의 프로토콜에 따라 측정합니다.
2. 단단한 접합 단백질 ZO-1 검출을 위한 웨스턴 블로팅
   1. 총 균질40g을 함유하는 총 균질제의 변성 알리쿼트는 95°C에서 1x Laemmli 완충액을 함유하고 있으며, 5분 및 전기영영을 환원하여 6-7.5% 나트륨 도데실 설페이트 폴리아멜라미드 겔(SDS-PAGE)(90V, 스태킹 겔을 통해 10분, 10분)을 통해 젤을 해결).
      참고: 샘플 또는 표준을 적재할 때는 공정에서 잘 파손되지 않도록 주의하면서 각 차선에 천천히 조심스럽게 로드해야 합니다.
   2. 분리된 단백질을 192 mM 글리신, 25 mM 트리스 베이스, 10% 메탄올 및 0.1% SDS (실온에서 75 V, 110 분)를 포함하는 pH 8.5 전달 버퍼로 니트로 셀룰로오스 멤브레인에 옮니다.
      참고: 멤브레인을 만지지 마십시오. 70% 이소프로판올 세척 플라스틱 집게를 사용하여 멤브레인을 처리하십시오. ZO-1 단백질(MW 200 kDa)을 멤브레인으로 성공적으로 전달하려면 pH는 약 8.3-8.5여야 합니다. 전달 버퍼가 그보다 더 산성인 경우 전달이 발생하지 않습니다. 사다리 밴드가 젤에 여전히 보이는 경우, 전송 시간과 SDS 농도를 증가하는 것이 도움이 될 것입니다.
   3. 0.1% 트웬 20(T-TBS)를 함유하는 트리스 완충식염수를 사용하여 멤브레인을 세척한 후, 차단 용액(1:1 LiCOR-Odyssey Block: 1x Tris 완충 식염수)을 사용하여 멤브레인을 60분 동안 차단하였다.
   4. 조심스럽게 두 개의 스트립으로 멤브레인을 잘라. 2개의 1차 항체(ZO-1 단일클론 항체, 희석, 1: 900 및 글리세랄데히드 3-인산탈수소효소(GAPDH) 항체, 희석, 1: 10,000)을 4°C에서 밤새 배양한다. 이어서, ZO-1 및 GAPDH 멤브레인을 당나귀 항마우스 IgG(희석, 1:50,000)로 배양한다. T-TBS를 사용하여 멤브레인을 세척한 후, 16비트 이미저에 700 채널의 멤브레인을 이미지화합니다.

결과

첫째, 우리는 TJ 형성의 명백한 역학을 결정하기 위해 LY 투과성에 배양 시간의 효과를 결정했다. 1일째부터 10일까지의 평균 LY P_앱 값은 그림 2a에나와 있습니다. 1일차 의 평균 P 앱은 4.25 x 10^-4 cm/min이었고, 2일째에는 3.32 x 10 -4cm/min로 약간 떨어졌습니다. 평균 P_앱 값은 3일째에 3.93 x 10^-4 cm/min로 약간 증가했으며 6일째까지 큰 변동없이 변동했습니다. P_앱 값은 7일째(P< 0.05)에 비해 2.36 x 10^-4 cm/min으로 크게 감소하여 장벽이 더 엄격해졌을 것입니다. P_앱 값은 7일째부터 10일째까지 2.14 x 10^-4 및 2.36 x 10

토론

BBB의 주요 역할은 신경 미세 환경의 지혈을 유지하기 위해 전신 순환과 뇌 사이의 비 필수 이온 및 독성 물질의 교환을 방지하는 것입니다. BBB의 특징적인 특징 중 하나는 모세관 내피 세포가 수송의 파라셀룰러 경로를 효과적으로 밀봉하는 단단한 접합부(TJs)를 형성하는 능력이다. 우리는 배양 된 hCMEC / D3 단층에서 TJ 장벽 형성의 명백한 역학을 결정하는 정량적 방법으로 LY P_앱 분석법을 입증했습니다. 서양 블로팅을 통해 검출된 ZO-1 발현은 다음 단락에서 상세히 논의된 바와 같이 LY P_앱 연구에서 데이터를 정형화하여 검증했다. 개발된 분석법의 추가 유틸리티로서, 우리는 DNA NP 형질감염이 실험 설정에서 TJ 장벽 특성의 변화를 결정하기 위해 이 분석법의 적합성을 나타내는 LY P_앱을 측정 가능하게 변경하지 않았다는 것을 더 입증하였다.

웨스턴 블롯 데이터는 3일째, 5일, 7포스트 파종및 10일사후...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
hCMEC/D3 세포주	Cedarlane Laboratories	102114.3C-P25	인간 대뇌 미세혈관 내피 세포주
gWizLuc	알데브론	5000-5001	플라스미드 DNA 인코딩 루시퍼라제 유전자
루시퍼 옐로우 CH 디리튬 염	Invitrogen	155267
Transwell 인서트는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 트랙 에칭 멤브레인이 있는	Falcon	353095
Tissue Culture Flask	Olympus Plastics	25-207
24웰 플랫 바텀	Olympus Plastics	25-107
블랙 96-웰 면역 플레이트	Thermo Scientific	437111
S-MEM 1X	Gibco	1951695	Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2	Clonetics	CC-3156	Endothelial cell basal medium-2(EBM-2)
인산염 완충 식염수 1X	HyClone	SH3025601
콜라겐 타입 I	디스커버리 Labware, Inc.
Pierce BCA 단백질 분석 키트	Thermo Scientific	23227
세포 배양 용해 5X 시약	Promega	E1531
딱정벌레 루시페린, 칼륨 소금	프로메가	E1601
스펙트라맥스 i3	분자 장치		형광 플레이트 리더
Trypan 블루 솔루션, 0.4%	Gibco	15250061
ZO-1 다클론 항체	ThermoFisher	61-7300
항-GAPDH 항체	abcam	ab8245
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)	Jackson ImmunoResearch Inc	128817
12-well, Flat	Bottom Olympus Plastics	25-106
RIPA buffer (5X)	Alfa Aesar	J62524
Aprotinin	Fisher BioReagents	BP2503-10
Odyssey CLx 이미저	LI-COR Biosciences		웨스턴 블롯 멤브레인 스캐닝