기본 Murine 골격 근육 Microvascular 내 피 세포의 고립

혈 류를 통해 , 세포와 장기 산소, 기판 및 다른 필요한 분자와 함께 제공 됩니다. 이 교환 모 세관, 작은 혈관에서에서 일어난다. 모 세관 내부 내 피 세포 (EC) 층이 누구의 무결성 유지 혈관 내 고 중간 공간 사이의 근육 항상성의 성공적인 규제에 조건 형성 된다. 수용 성 요소와 세포의 선택적 전환할 수 있도록, EC 꽉 연결 되어 단층 및 외화 접속점 ¹을 구성 합니다. 영양소 또는 대사 제품에 대 한 장벽으로 서의 역할 외 EC 염증 과정에서 백혈구의 채용을 통제 한다. 염증이 나 조직 손상 접착 분자의 최대 규정 EC 표면에 발산 촉진 백혈구 첨부 파일 및 대상 조직 ²로 환생의 생산 리드. 따라서, EC 비판적으로 병원 체 또는 조직 복구에 대 한 방어와 같은 염증 성 프로세스의 규칙에서 포함 된다.

EC의 장애는 직접 관련 혈관 질환, 만성 신부전, 정 맥 혈전 증 심한 병원 체 감염 된. 또한, EC는 거의 항상 당뇨병 mellitus 또는 다 발성 경화 증 ³같은 기관 특정 면역에 관여 하 고. 혈 류 및 기관 사이의 장벽 기능 따라서 다른 종류의 공동된 작용에 의해 제어 됩니다. 골격 근육 microvascular 내 피 세포 (MMEC) 근육 세포와 섬유 아 세포와 pericytes 형성 기능 단위, "myovascular 단위" (MVU). 따라서,는 MVU의 부전 myopathies의 이상에서 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 그러나, 이러한 규제 메커니즘에 대 한 깊은 이해는 여전히 누락 이며 현재 myopathies에 새로운, 긴급 하 게 필요한, 치료 대상의 식별을 방해.

복잡 한 생리 적 및 병 태 생리 기계 장치를 조사, 동물 모델은 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 생체 외에서 모델 제외 혼동 요인의 다양 한 관심 주제에 초점을 이점을 제공 합니다. 프로세스를 조사 하기 위해 생체 외에서 그것은 순수 하 고 가능한 1 차 셀을 분리 하는 데 필요한입니다. 셀 라인, 달리 1 차 셀 유전자 변형 동물에서 분리 가능 유전 수정은 체 외의 결과 조사

여기, 뒤에 자석 활성화 된 셀 정렬 기법 (MCS) 정화 기계 및 효소 분리를 사용 하 여 기본 murine MMEC를 분리 하는 방법을 설명 합니다. 이 목적을 위해 특정 표면 표식에 대 한 자석 구슬 사용 됩니다. 혈소판 내 피 성장 세포 접착 분자-1 (PECAM1, CD31)은 주로 EC에 표현 하 고이 셀 종류를 풍부 하 게 사용할 수 있습니다. 높은 셀 순도 보증 하기 위하여 원래 조 혈 모 세포 (PTPRC, CD45) 단백질 티로신 인산 가수분해 효소 수용 체 유형 C에 대 한 부정적인 선택에 의해 제외 됩니다. 또한, 품질 컨트롤, 기본 murine MMEC, 잠재적인 응용 프로그램 제한 뿐만 아니라 특별 한 고려의 재배 되 게 됩니다.

모든 동물 실험 했다 지방 기관에 의해 승인 및 독일 동물 복지 법 (84-02.05.20.13.097) 실시.

1. 일반 발언 동물 실험에

1. 각 기관 동물 관리의 지침에 따라 모든 마우스 실험을 수행 하 고 위원회를 사용 하 여.
2. 마우스 및 실험실 동물 과학 협회 (FELASA)에 대 한 연맹 같은 국제 지침에 따라 표준화 된 조건에서 유지.
   참고: 일반적으로이 절연 기술은 마우스의 연령, 성별, 유전적 배경 독립에 대 한 사용할 수 있습니다. 충분 한 핸드폰 번호를, 4-10 주 오래 된 남성은, 생물 학적 속성 연령과 성별 따라 달라질 수 있기 때문에.

2. 솔루션, 미디어 및 코팅의 준비

1. 200 μ와 2.2 mL의 Dulbecco´s 수정이 글 중간 (DMEM)를 혼합 하 여 소화 솔루션 (DS)를 준비 콜라-Dispase 및 45 μ Desoxyribonuclease (DNase).
2. DMEM 50 mL FCS와 (약 10%), 0.25 mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 bFGF (20 μ g/mL; 약 0.05%)의 450 mL를 혼합 하 여 내 피 세포 매체 (ECM)의 500 mL를 준비 그리고 5 mL 페니실린-스 (약 1%). 유리 튜브에 살 균 여과 수행 (필터 구멍의 직경: 0.2 μ m). 나중에 4 ° c.에 솔루션 저장
3. 아래 설명 된 대로 세포 배양 배지를 코트.
   1. 갓 격리 기본 murine 멕 커버의 재배에 대 한 6의 당 1 mL와 함께 전체 표면 잘 문화 판 젤라틴 기반 속도 코팅 솔루션 셀 ( 재료의 표참조) 룸에서 3-5 분에 대 한 제조업체의 지침에 따라 온도 (RT)입니다.
   2. 발음 하 고 코팅 솔루션을 삭제. 2 mL 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS), pH 7.1-7.5 두 연속 세척 단계에서 각 잘을 헹 구 십시오.
   3. 발음 하 고 PBS를 삭제. ECM의 1 mL 볼륨 우물 위로 채우십시오.

3. 격리의 기본 Murine 근육 Microvascular 내 피 세포 (MMEC)

1. 안락사 한 성인 4-12 주 오래 된, 남성 마우스 어떤 마 취 없이 자 궁 경관 탈 구 여. 목표는 빠르고 고통 없이 죽음으로 동물을 제공 하기 위해 뇌에서 척수를 신속 하 게 분리 하는.
2. 사지 절단
   1. 수술 샤 프/블런트 (최첨단 42 m m, 직선)을 사용 하 여 고 샤 프/샤 프 (최첨단 23 m m, 직선)가 위, 직선 (톱니, 2 m m x 1.25 m m x 12 cm)와 곡선 (톱니, 1.3 m m x 1 m m x 13 cm) 포 셉.
   2. 70% 에탄올과 모든 수술 기구를 소독.
   3. 동물의 뒷면에 위치, 70% 에탄올과 다리를 축 축 하 게. 샤 프/블런트 외과 시저와 엉덩이 관절에서 절단 하 여 전체 다리를 끊다. 닫히는 세포 문화 접시 (35 m m x 10 m m)에 사지를 놓습니다.
      참고: 지금부터 살 균 층 류 두건 아래 모든 단계를 수행 하 고 소독된 장비를 사용.
3. 근육 조직 분리 (생쥐 quadriceps femoris 또는 두 다리에서 생쥐 삼 두 근 surae에 우선적으로 사용).
   1. 샤 프/샤 프가 위 및 곡선된 겸 자 사용 하 여 오픈 엉덩이에서 발가락 끝에는 피부를 잘라. 직선 겸 자와 발가락 또는 노상 강도 잡으십시오. 엉덩이 발가락 곡선된 집게로 피부를 벗기십시오.
   2. 생쥐 quadriceps femoris 무릎에서 힘 줄을 절단 하 여 분리 하 고 엉덩이 대 퇴 골을 따라 근육을 끊다. 아 킬 레 스 힘 줄을 severing 하 여 생쥐 삼 두 근 surae 를 격리 합니다. 여기서 부터는, 오 금 fossa을 경골을 따라 잘라 하 고 근육을 제거 합니다.
      참고: 대형 선박 (A. femoralis, A. tibialis 앞쪽, A. tibialis 후부, A. fibularis) 고립 된 근육에 표시 되는 경우 macrovascular endothelium에 의해 오염을 피하기 위하여 혈관을 제거.
   3. 큰 혈관을 제거 하려면 곡선된 겸 자와 큰 혈관을 포함 하지 않는 근육의 부분 누른 배 옆 그것을 잘라. 이 프로토콜에 대 한 1 g 또는 더 적은 근육 조직 quadriceps femoris 와 삼 두 근 surae 것이 좋습니다.
   4. 셀 문화 요리 (35 m m x 10 m m) (2.1 단계)에서 2,445 µ L DS를 추가 하 고 무게를 결정.
   5. 모든 근육 조각 2445 µ L DS를 포함 하이 셀 문화 접시에 전송 하 고 무게를 결정 합니다. 두 측정된 값의 차이 1 g을 초과 하지 않아야 합니다 근육 조직의 건조 중량을 제공 합니다.
   6. 샤 프/샤 프가 위를 사용 하 여 전체 근육 조직 (≤2 m m 큐브, 약 100 개) 작은 조각으로 잘라.
4. 근육 조직의 해리
   참고: 이 단계 약 120 분 소요.
   1. 스토어 근육/DS 정지 1.5 h. 위해 37 ° C (5% CO₂배양 기) 현 탁 액 1 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 약 5 분 20 분 마다 신중 하 게 믹스.
   2. 현 탁 액 70 μ m 나일론 셀 스 트레이너 50 mL 튜브에 배치를 전송 하 고 통해 흐름을 수집 합니다. DMEM의 8 mL와 셀 여과기를 세척을 통해 흐름을 수집 합니다.
   3. 20 ° c.에 300 x g 에서 10 분 동안 셀 여과기 및 분리기 정지 무시 조심 스럽게 상쾌한 제거.
      주의: 펠 릿을 잃게 하기 쉽습니다.
   4. 염화 염화 칼륨 (ACK) lysing 버퍼의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend (동봉 하는 재료의 표참조) 적혈구의 세포에 대 한 30 실시간 추가 9 mL DMEM에서 s + 10% 품 어 및 FCS는 반응 및 세포 현 탁 액 15 mL t 막으려고 우베입니다.
5. CD45 고갈⁺ 세포 CD45 microbeads 제조업체의 지침에 따라. CD45의 모든 다음 단계에 대 한⁺ 고갈 MCS 버퍼 사용 (동봉 하는 재료의 표 참조).
   참고: 이 단계 약 60 분 소요.
   1. 챔버 세 Neubauer 셀을 사용 하 여 셀 수를 결정 (g 근육 조직 당 약 5 x 10⁶ 세포 기대).
   2. 300 x g 4 ° c.에서 10 분 원심 분리기 정지 상쾌한 떨어져 완전히 고 90 µ L MCS 버퍼 (10⁷ 셀 당 또는 더 적은)에 셀 펠 릿 resuspend. CD45 microbeads (10⁷ 셀 당 또는 더 적은)의 10 μ를 추가 합니다.
   3. 세포 현 탁 액을 혼합 하 고 4-8 ° c.에 냉장고에 15 분 동안 품 어
   4. 1 mL MCS 버퍼 (10⁷ 셀 당 또는 더 적은)를 추가 합니다. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기 상쾌한을 완전히 제거 하 고 셀 500 μ MCS 버퍼에 resuspend.
   5. 마그네틱 셀 분리에 대 한 8 mL의 저수지 볼륨 및 최대 2 x 10⁹ 총 셀의 용량 큰 자석 열 (LMC)를 사용 합니다. 자기 필드 구분 기호에 LMC 위치.
   6. MCS 버퍼의 3 mL는 LMC의 저수지로 린스. Rinsing 후, 15 mL 원뿔 튜브를 통해 수집 열 아래 놓습니다. 전체 세포 현 탁 액 (500 µ L) 열에 적용 하 고 그것은 완전히 흐름을 통해 하자.
   7. 저수지에 MCS 버퍼의 3 mL를 추가 하 여 열 세 번 세척 하 고 세 단계를 수행 하기 전에 column´s 저수지 비어 때까지 기다립니다.
   8. 열 전달 레이블이 셀 추가 분리 단계 사용 수집 (대표는 CD45^- 분수). 셀 표시 (대표는 CD45⁺ 분수)에 축적 된 열이 삭제 될 수 있습니다.
6. CD31 축적⁺ 세포 다음 CD31 microbeads 제조 업체의 지침. CD31의 모든 다음 단계에 대 한⁺ MCS 버퍼를 사용 하 여 축적.
   참고: 이 단계 약 60 분 소요.
   1. 챔버를 세 Neubauer 셀을 사용 하 여 셀 수를 결정 (g 근육 조직 당 약 4 x 10⁶ 세포 기대).
   2. 원심 분리기 얻은 레이블이 없는 세포 현 탁 액 단계 3.5 4 ° c.에 300 x g 에서 10 분에서
   3. 상쾌한을 완전히 제거 합니다. 90 μ MCS 버퍼에 펠 릿을 resuspend 하 고 10 μ CD31 microbeads (10⁷ 총 셀 당 또는 더 적은)의 추가. 전체 현 탁 액을 혼합 하 고 4-8 ° c.에 냉장고에 15 분 동안 품 어
   4. 300 x g 4 ° c.에서 10 분에 1 mL MCS 버퍼와 원심 분리기를 추가 상쾌한 떨어져가지고 고 resuspend MCS 버퍼의 500 µ L에 셀.
   5. 마그네틱 셀 분리에 대 한 중간 자석 열 (MMC)를 사용 하 여 3.5 mL의 저수지 볼륨 및 최대 2 x 10⁸ 총 셀의 용량.
   6. MMC는 구분의 자기장에 위치. MMC MCS 버퍼의 500 µ L로 린스. Rinsing 후, 15 mL 원뿔 튜브를 통해 수집 열 아래 놓습니다.
   7. 전체 세포 현 탁 액 (500 µ L) 열에 적용 하 고 그것은 완전히 흐름을 통해 하자.
   8. MCS 버퍼의 500 µ L을 추가 하 여 열 세 번 세척 하 고 세 단계를 수행 하기 전에 열의 저수지 비어 때까지 기다립니다. 열을 전달 하는 레이블이 셀 대표는 CD45^- CD31^- 분수. 품질 컨트롤 추가 대 한 그들을 저장 합니다.
   9. 구분 기호에서 열을 제거 하 고 적당 한 컬렉션 튜브 (15 mL 튜브)에 배치. 피 펫 2 mL MCS 버퍼 열에. 즉시 단단히 열에 플런저를 추진 하 여 자석으로 레이블이 지정 된 셀에 밖으로 플러시. 이 CD45^- CD31⁺ 분수 나타냅니다 풍부한 기본 murine 적
   10. 350 x g 20 ° c.에에서 5 분 동안 원심 분리기 세포 현 탁 액 상쾌한을 완전히 제거 하 고 1 ml ECM (기대 약 0.6 x 10 g 근육 조직 당⁶ 셀) 셀 resuspend (단계 2.2 참조). 코팅된 6 잘 문화 판의 단일 우물에 셀 (0.5-0.7 x 10⁶ 셀) (2.3 단계)를 전송 ECM의 1 mL를 포함 하.
7. 재배, 무 균 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO₂ 세포를 품 어. 2 ~ 3 일 마다 ECM를 새로 고칩니다.

4. 기본 Murine MMEC 정화

1. CD31의 두 번째 사이클 수행⁺ 축적, 제조업체의 지침에 따라 (CD31 microbeads 프로토콜 마우스; 단계 3.6 참조.).
   1. 그들은 80-90% 합류에 (일반적으로 7 일 후) 때 트립 신/EDTA 솔루션에 포함 된 셀을 분리 합니다. 이 위해 두 연속 세척 단계에 2 mL 살 균 PBS 가진 각 잘 린스. 6 잘 당 800 μ 트립 신/EDTA 솔루션을 사용 하 고 1200 μ DMEM 10 %FCS 최소 포함을 사용 하 여 3-5 분 정지 효소 활동에 대 한 무 균 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO₂ 에서 품 어.
   2. 350 x g 20 ° c.에 5 분에 대 한 세포 현 탁 액을 원심
   3. 순도 (CD31 microbeads manufacturer´s 지침에 따라. 3.6을 참조 하십시오.) 증가 하는 두 번째 CD31 MCS 단계를 수행 합니다.
   4. 밝은 분야를 통해 셀 합류 또는 표준 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 관찰 한
      20 x 확대와 0.35 렌즈 수 가늠 구멍입니다. 그림 1을 참조 하십시오.
      참고: 셀 각각 실험을 위해 사용 하거나 뿌리고 문화에 보관 될 수 있습니다. 더 낮은 통로에 신속 하 게 실험에 대 한 셀을 사용 합니다. 통행 후에 세포를 사용 하 여 권장 하지 않습니다.
      8-10.

5입니다. 품질 관리

1. 두 번째 CD31-MCS-단계 후 기본 murine MMEC의 cytometry를 수행 합니다.
   1. 1 mL 흐름 cytometry (FC) 버퍼를 추가 하 여 FACS 튜브를 준비 (동봉 하는 재료의 표참조).
   2. 때 그들은 100% 합류 (14 일) 후 보통 트립 신/EDTA 솔루션에 포함 된 셀을 분리 합니다. 이 위해 두 연속 세척 단계에 2 mL 살 균 PBS 가진 각 잘 린스. 6 잘 당 800 μ 트립 신/EDTA 솔루션을 사용 하 고 1200 μ를 사용 하 여 3-5 분 정지 효소 활동에 대 한 무 균 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO₂ 품 어 DMEM 10 %FCS 포함.
   3. Neubauer 챔버 및 준비 FACS 튜브를 최소 1 x 10⁵ 셀 추가 셀 계산을 사용 하 여 셀 수를 결정 합니다.
   4. 4 ° c.에 300 x g 에서 10 분 원심 분리기 세포 현 탁 액 제거는 상쾌한, 셀 1 mL FC 버퍼에 resuspending 및 4 ° c.에 300 x g 에서 10 분 동안 centrifuging 두 세척 단계를 수행
   5. 반대로 마우스 CD31 FITC 항 체 (1: 100) FC 버퍼와 반대로 마우스 CD45-PE (1: 100)을 추가 하 여 착 색 혼합을 준비 합니다.
   6. FACS 튜브에 믹스 얼룩의 100 μ 셀 resuspend 4 ° c.에 30 분 동안 품 어 FC 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에 300 x g 에 5 분 동안 원심 분리기 세포 현 탁 액 신중 하 게 상쾌한을 제거 하 고 FC 버퍼의 200 μ 셀 resuspend.
   7. 다음 제어 전략 교류 cytometer에서 측정 셀은 그림에 표시 됩니다. 2A입니다.
2. 또는 두 번째 CD31-MCS-단계 후 기본 murine MMEC의 면역 형광 염색을 수행 합니다.
   1. 코트는 coverslips입니다.
      1. 라운드 유리 coverslip 살 균 13 m m 직경 24 잘 접시의 우물으로 전송 합니다. 잘 당 속도 코팅 솔루션의 300 µ L을 추가 하 여 coverslip 코트. 실 온 (RT)에서 3-5 분 동안 품 어.
      2. 발음 하 고 코팅 솔루션을 삭제. 2 mL 살 균 PBS 2 연속 세척 단계에서 각 잘을 헹 구 십시오. 발음 하 고 PBS를 삭제.
      3. 씨앗 1 x 10⁵ 코팅된 coverslip에 1 mL ECM에에서 세포 그리고 세포 99% 합칠 때까지 무 균 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO₂ 에서 품 어.
   2. 고정과 면역 형광 염색 법을 수행 합니다.
      1. 5.2.1.3에서 경작 된 세포의 ECM 매체를 제거 합니다.
      2. 음, 4 ° c.에서 10 분 당 7.4의 pH와 300 µ L 4 %paraformaldehyde (PFA)를 추가 하 여 배양된 세포를 수정
         주의: PFA 독성 이며 관리와 처리 해야 합니다.
      3. 잘 당 1 mL PBS를 추가 하 여 3 세 단계를 수행 하 고 상쾌한 실시간 5 분 후 제거
      4. 차단 솔루션 포함 5 %BSA, 0.2% 트리톤 X와 1% 염소 혈 청 PBS에 준비 합니다.
      5. 각 잘을 차단 솔루션의 300 µ L을 추가 하 고 실시간에 1 시간에 대 한 품 어
      6. 제거는 상쾌한 고 5 %BSA, PBS에서 1% 염소 혈 청에서에서의 안티-PECAM-1 (CD31) 항 체 (1: 200) 당 200 µ L을 추가 하 고 하룻밤 4 ° C에서 품 어.
      7. 3 세척 단계 잘 당 1 mL PBS를 추가 및 제거 하 여 표면에 뜨는 각 단계에서 RT 5 분 후 수행 합니다.
      8. 1 %BSA PBS Cy3 활용 된 반대로 쥐 IgG 항 체 (1: 500)를 포함 하는 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다. 이차 항 체 솔루션의 당 300 µ L을 추가 하 고 어둠 속에서 RT에 1 시간에 품 어.
      9. 3 세척 단계 잘 당 1 mL PBS를 추가 및 제거 하 여 표면에 뜨는 각 단계에서 RT 5 분 후 수행 합니다.
   3. 집게와 함께 신중 하 게 둥근 유리 coverslips를 꺼내와 현미경 슬라이드에 그것을 전송. 셀 계층에서 중간 포함 DAPI 장착의 적절 한 금액을 추가 하 고 신중 하 게 커버 유리에 넣어 (동봉 된 재료의 표참조).
   4. 형광 광원 (120 승)을 갖춘 적절 한 형광 현미경으로 세포를 관찰 하 고 두 집합 필터링: 550/25는 여기/방출 필터 설정 및 감지 Cy3 540/562 nm에 605/70 nm 파장.
   5. 두 번째 필터는 여기/방출 파장 365/50의 세트를 사용 하 여 및 445/50 nm DAPI 350/440 nm를 감지. 40 x 확대를 사용 하 여 고 Cy3의 검출에 대 한 30 양의 수집 기간 DAPI 14.5 mW/cm² 의 80% 강도 60 ms의 인수 기간 67.5 mW/cm² 의 80%를 사용 합니다.
3. 정량 PCR을 수행 합니다.
   1. MRNA의 격리입니다.
      1. MRNA를 분리 하는 산 guanidinium 안산-페 놀 (AGTP) 시 약을 사용 하 여 표준 절차를 따릅니다. CD45에서 10⁶ 셀 x 0.5의 최소 사용^- CD31^- (단계 3.6.8 참조), CD45^- CD31⁺ (단계 3.6.9 참조.) 분수와 재배 기본 murine MMEC (4.1.3)
      2. 20 ° c.에 300 x g 에서 10 분 원심 분리기 세포 현 탁 액 상쾌한을 완전히 벗어. 2 mL 반응 관에 AGTP 시 약 및 세포 현 탁 액의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 실시간에서 5 분 동안 품 어
      3. 클로 프롬의 100 µ L을 추가 하 고 실시간에 3 분 15 미 품에 대 한 적극적으로 악수
      4. 4 ° c.에 12000 x g 에서 15 분 동안 원심 분리기 정지
      5. 위 수성 단계 (RNA 포함) 신중 하 게 떨어져 고 1.5 mL 반응 관으로 전송. 소 프로 파 놀의 250 µ L을 추가 하 고 실시간에 10 분 동안 품 어
      6. 12000 x g 에서 원심 분리 단계를 수행 하는 4 ° c.에서 10 분
      7. 오프는 상쾌한 고 신중 하 게 75% 에탄올의 1 mL을 추가. 4 ° c.에서 5 분 동안 7500 x g 에서 원심 분리기
         참고: 펠 릿을 잃게 하기 쉽습니다.
      8. 상쾌한을 완전히 제거 합니다. 5-10 분 동안 공기에 건조 하는 펠 릿을 하자.
         참고: 에탄올만 제거할 필요가 너무 많이 건조 하지.
      9. 펠 릿에 30 µ L diethylpyrocarbonate 처리 물에 포함 된 55 ° c.에서 10 분에 대 한 열 분해
         참고: 스펙트럼-photometer로 RNA 농도 순도 측정할 수 있습니다.
   2. CDNA 합성 (역전사 PCR)을 수행 합니다.
      1. 포함 하는 mastermix 준비: PCR 버퍼 (5 배), 2, 5 µ L desoxyribonucleosid-3 인산 염 (dNTP (10 m m)), 단일 가닥 뇌관의 0.5 µ L 무작위 혼합 10 µ L (0.2 µ g / µ L), RNase 억제제의 1 µ L (40 U / µ L, 0.4 반전 transcriptase (200 U / µ L)와 5.6 µ L의 diethylpyrocarbonat 물 처리 (동봉 참조 테이블의 재료).
      2. 500 ng RNA 0.2 ml PCR 튜브 및 전체 20 µ L mastermix 추가 30 µ L diethylpyrocarbonate 처리 물에 희석.
      3. 다음 단계를 수행 하는 PCR cycler 사용: 10 분 25 ° C, 30 분 50 ° C, 5 분 85 ° C 및 4 ° c.에서 개최
4. 정량 PCR (정량)을 수행 합니다.
   참고: 중복 또는 triplicates에서 샘플의 정량 Pcr을 수행 합니다.
5. 두 개의 서로 다른 형광 염료 뇌관을 사용 합니다. 495의 흡수와 뇌관 및 517의 방출 관심사의 유전자에 대 한 nm.
6. 위성 셀 표식 유전자 발현의 탐지를 사용 하 여 뇌관 쌍된 상자 단백질 7 (Pax7)과 M-cadherin (Cdh15) (동봉 하는 재료의 표참조).
7. 내 피 세포 마커 유전자 발현의 탐지를 사용 하 여 프라이 머 claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln) 및 zonula occludens-1 (Tjp1 또는 ZO1) (포함 하는 참조 테이블의 재료).
8. 18에 대 한 참조 유전자로 rRNA, 538의 흡수와 뇌관 사용 및 554 nm 파장의 방출.
9. 각각 뇌관의 각 유전자에 대 한 정량 mastermix를 준비 합니다. Mastermix 포함: 10µl 정량 버퍼 (2 배), 관심 (10 µ M), 18s 위한 뇌관의 1 µ L의 유전자에 대 한 뇌관의 1 µ L rRNA 및 4 µ L nuclease의 무료 물.
10. 96-잘 반응 판의 단일 잘 하는 mastermix의 16 µ L를 추가 합니다. 잘 포함 하는 mastermix 당 (5.3.2 단계에서 획득) cDNA의 4 µ L를 추가 합니다.
11. 다음 단계를 수행 하는 실시간 PCR cycler 사용: 1 분 동안 95 ° C 15 s의 60 ° C 10 분 사이클링 무대 40 주기 위한 50 ° C 2 분 동안 95 ° C와 무대를 들고.

절연, 기본 murine MMEC 및 잔여 후에 1 일 다른 셀 대기업을 형성 하며 문화 요리 (그림 1A 주 1)의 하단을 준수 합니다. 제 7 일에,에서 평평 하 고 길쭉한 세포를 관찰할 수 있습니다. 그러나, 다른 사람, 주로 회전 타원 체 세포의 오염 여전히 표시 됩니다 (그림 1A 주 7). 따라서, CD31 긍정적인 선택을 통해 MCS가 필요의 다른 주기. 여기서 부터는, 기본 murine MMEC 약 80-90%의 밀도를 확산. 합류에 그들은 일반적으로 경도 정렬 셀 (그림 1A 하루 14) 겹치지 않는 단층을 형성합니다. 확산 합류 접촉 금지 때문에 중지합니다. 14 일에 대 한 후 5-10 105 셀 x 수 추가 수사를 위해 사용 될.

품질 관리를 통해 cytometry 고칠 수 생존 염료 (죽은 세포에 대 한 얼룩)를 FVD780를 사용 하 여 PECAM1 (CD31) 및 PTPRC (CD45, 원래 조 혈 모 세포에 대 한 표식으로) 보였다 생존 능력 및 순수성까지 약 70% 각 셀에 대 한 값을 직후 격리 (그림 2A). 셀 다른 CD31 긍정적인 선택을 통해 후 재배 MCS, 최대 95% (그림 2B)에 이르기까지 생존 능력에 관해서는 뿐만 아니라 순도 대 한 값을 만족 했다.

선택의 정확도 평가 하기 위해 단계, 세포를 얻은 추가 조사 되었다 (Pax7) 근육 위성 세포 마커 유전자 쌍이 된 상자 단백질 7의 유전자 발현 및 M-cadherin (Cdh15)에 대 한 mRNA 수준에서 정량 PCR (정량)에 의해. 기본 murine MMEC (pmMMEC)와 차별화 된 기본 murine 근육 세포 (pmMC) 각각 부정과 긍정적인 제어로 사용 되었다. Murine 근육 세포 상업적으로 구매 되었다. 예상 했던 대로, CD45만- CD31는 pmMC로 서- 분수 표현 Pax7 및 Cdh15, 반면 CD45- CD31+ 와 기본 murine MMEC 이러한 마커 (그림 2C)에 대 한 부정 했다.

EC의 골격 근육 표현 꽉 접합 단백질 4,5endomysium 모세 혈관에서 파생. 정량, 후 두 번째 CD31 MCS claudin-5 (Cld5), occludin (Ocln)와 zonula occludens-1 (Tjp1 또는 ZO1) confluent 기본 murine MMEC의의 식을 사용 하 여 단계 평가 했다. PmMC는 컨트롤 (그림 2D)으로 사용 되었다. 반면 pmMC Tjp1의 낮은 식만 기본 murine MMEC Cld5, Ocln 및 Tjp1, 높은 수준의 표현. 또한, 면역 형광 검사 품질 관리로 얼룩 확인 기본 murine MMEC (그림 2E)에서 endothelium 특정 마커 PECAM1의 표면 표현.

그림 1: 기본 murine MMEC의 형태. (A) 일 1 ~ 14에서에서 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 교양된 기본 murine MMEC의 대표 이미지. d1 = 하루 1, d7 = 하루 7, d14 = 하루 14. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 품질 관리의 기본 murine MMEC. 흐름 cytometric 분석을 위한 기본 murine MMEC 절연 (A) 직후와 날 15 (B) 금감위/SSC, (II) FVD780 (IIIa) CD45 (IIIb) CD31 (I)을 사용 하 여 전략 게이팅 (점선 라인 isotype 제어 =). (C) 식 수준 Pax7 및 M-Cadherin CD45에 (Cdh15)- CD31-, CD45- CD31+ 기본 murine MMEC (pmMMEC) 및 기본 murine 근육 세포 (pmMC 뿐만 아니라 MCS 격리 후 분수 ). 식 수준 ΔCt 값 (샘플-18S rRNA), 노스다코타 표시 됩니다 결정 =. (D) 식 꽉 접합 단백질 claudin-5 (Cldn5), occludin (Ocln) 또는 zonula occludens-1 (Tjp1 또는 ZO-1) pmMMEC와 pmMC, ΔCt 값으로 표시 된 수준. (E) 면역 형광 검사는 PECAM1에 대 한 (빨간) 두 번째 CD31 긍정적인 선택 후 재배 기본 murine MMEC 24 h에 얼룩. 핵 DAPI 포함 하는 (파란색) 장착 매체;와 얼룩 왼쪽 = 안티-PECAM1/DAPI, 오른쪽: 제어/DAPI 네거티브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.