Microvascular 내 피 세포 골격 근육 (MMEC)의 근육 모세 혈관의 안 벽을 형성 하 고 둘 다 조절 근육 조직과 혈액 사이 (면역) 세포의 마이그레이션 및 체액/분자의 교환. 기본 murine MMEC의 격리, 여기에 설명 된 대로 "myovascular 단위"의 종합 체 외 조사 수 있습니다.
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방법 논문
기본 Murine 골격 근육 Microvascular 내 피 세포의 고립
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
골격 근육의 모세 혈관 (근육 microvascular 내 피 세포, MMEC)의 내 피 세포 혈 류 감염에 대 한 면역 반응 뿐만 아니라 체액과 영양분의 교류를 통제 하는 골격 근육 사이 장벽을 구축합니다 면역 세포 이동 제어 하 여 대리인입니다. 이러한 기능에 대 한 MMEC 형성 기능 "myovascular 단위" (MVU), 더 세포 유형, 섬유 아 세포, pericytes 및 골격 근육 세포 등으로. 따라서, MMEC 및 MVU는의 역 기능 다양 한 myopathies에 기여 한다. 그러나, 건강과 질병에 있는 MMEC의 규제 메커니즘 충분 이해 남아 있고 그들의 설명 앞 myopathies에 대 한 좀 더 구체적인 치료. 분리와 기본 MMEC 함수는 MVU의 맥락에서의 심층 조사 이러한 프로세스의 더 나은 이해를 용이 하 게 수 있습니다.
이 문서는 골격 근육의 기본 murine MMEC 정화 및 문화 유지 보수 단계를 포함 하 여 기계 및 효소 분리 하 여 격리 프로토콜을 제공 합니다.
서론
혈 류를 통해 , 세포와 장기 산소, 기판 및 다른 필요한 분자와 함께 제공 됩니다. 이 교환 모 세관, 작은 혈관에서에서 일어난다. 모 세관 내부 내 피 세포 (EC) 층이 누구의 무결성 유지 혈관 내 고 중간 공간 사이의 근육 항상성의 성공적인 규제에 조건 형성 된다. 수용 성 요소와 세포의 선택적 전환할 수 있도록, EC 꽉 연결 되어 단층 및 외화 접속점 1을 구성 합니다. 영양소 또는 대사 제품에 대 한 장벽으로 서의 역할 외 EC 염증 과정에서 백혈구의 채용을 통제 한다. 염증이 나 조직 손상 접착 분자의 최대 규정 EC 표면에 발산 촉진 백혈구 첨부 파일 및 대상 조직 2로 환생의 생산 리드. 따라서, EC 비판적으로 병원 체 또는 조직 복구에 대 한 방어와 같은 염증 성 프로세스의 규칙에서 포함 된다.
EC의 장애는 직접 관련 혈관 질환, 만성 신부전, 정 맥 혈전 증 심한 병원 체 감염 된. 또한, EC는 거의 항상 당뇨병 mellitus 또는 다 발성 경화 증 3같은 기관 특정 면역에 관여 하 고. 혈 류 및 기관 사이의 장벽 기능 따라서 다른 종류의 공동된 작용에 의해 제어 됩니다....
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프로토콜
모든 동물 실험 했다 지방 기관에 의해 승인 및 독일 동물 복지 법 (84-02.05.20.13.097) 실시.
1. 일반 발언 동물 실험에
- 각 기관 동물 관리의 지침에 따라 모든 마우스 실험을 수행 하 고 위원회를 사용 하 여.
- 마우스 및 실험실 동물 과학 협회 (FELASA)에 대 한 연맹 같은 국제 지침에 따라 표준화 된 조건에서 유지.
참고: 일반적으로이 절연 기술은 마우스의 연령, 성별, 유전적 배경 독립에 대 한 사용할 수 있습니다. 충분 한 핸드폰 번호를, 4-10 주 오래 된 남성은, 생물 학적 속성 연령과 성별 따라 달라질 수 있기 때문에.
2. 솔루션, 미디어 및 코팅의 준비
- 200 μ와 2.2 mL의 Dulbecco´s 수정이 글 중간 (DMEM)를 혼합 하 여 소화 솔루션 (DS)를 준비 콜라-Dispase 및 45 μ Desoxyribonuclease (DNase).
- DMEM 50 mL FCS와 (약 10%), 0.25 mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 bFGF (20 μ g/mL; 약 0.05%)의 450 mL를 혼합 하 여 내 피 세포 매체 (E....
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결과
절연, 기본 murine MMEC 및 잔여 후에 1 일 다른 셀 대기업을 형성 하며 문화 요리 (그림 1A 주 1)의 하단을 준수 합니다. 제 7 일에,에서 평평 하 고 길쭉한 세포를 관찰할 수 있습니다. 그러나, 다른 사람, 주로 회전 타원 체 세포의 오염 여전히 표시 됩니다 (그림 1A 주 7). 따라서, CD31 긍정적인 선택을 통해 MCS가 필요의 다른 주기. 여기서 부터는, 기본 murine MMEC 약 80-90%의 밀도를 확산. 합류에 그들은 일반적으로 경도 정렬 셀 (그림 1A 하루 14) 겹치지 않는 단층을 형성합니다. 확산 합류 접촉 금지 때문에 중지합니다. 14 일에 대 한 후 5-10 105 셀 x 수 추가 수사를 위해 사용 될.
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토론
Microvascular 내 피 세포는 모든 조직에 장벽 기능과 관련된 장기 3의 질병에 그들의 기능 장애 결과 제공합니다. 또한, microvascular EC의 기관 특정 연구 새로운 치료 전략에 대 한 방법을 포장 수 있습니다. 따라서, microvascular EC 기능 생리 및 병 태 생리 조건 하에서 깊은 이해 큰 과학적인 관심입니다. 백혈구/endothelium 상호 작용의 모듈레이션 natalizumab, 림프 구 접착을 방지 하는 항 체와 다 발성 경화 증 환자를 치료 하는 성공적으로 및 그로 인하여 환생 6. 그러나, 여전히 염증 하위를 포함 한 다양 한 myopathies 남아만 날짜를 제대로 치료할 수 있다. 따라서, 골격 근육 endothelium에 특히 EC 속성의 myopathy 또는 소설 치료 접근에 결과를 사용할 수 있는 치료를 확장을 도울 수 있었다.
내 피 세포.......
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공개 사항
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
감사의 글
이 작품으로는 "다른 Kröner-Fresenius-재단"을 지원 했다 (2018_A03 TR), "혁신적인 Medizinische Forschung (IMF) Münster" (나-RU211811 TR에)와 독일 연구 재단 (DFG, INST 2105/27-1, 나 3283/5-1, 그리고 나 3283/6-1 SGM). 일러스트 이미지가 케 블 룸에서 제공 합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | 즉시 사용 가능한 |
| ACK 버퍼 | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA pH에서 pH 7.3 | ||
| 물에서 안티 마우스 CD31-FITC (클론 MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ 아이소타입 Ctrl |
| 안티 마우스 CD45-PE (클론 30-F11) | 바이오 레전 | 103106 | 아이소 타입 제어 : PE 쥐 IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 염기성 섬유아세포 성장 인자 |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads 마우스 | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads 마우스 | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | V. alginolyticus의 콜라겐분해효소, B. polymyxaCorning의 Dispase |
| Costar TC 처리 다중 6웰 플레이트 | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG 항체 | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI(DAPI를 사용한 ProLong Gold 퇴색 방지 시약) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | 소 췌장에서 Deoxyribonuclease I |
| Diethylpyrocarbonat 처리 된 물 | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, 글루타민 보충제 및 피루브 산염 함유 | Thermo Fisher | 31966-021 | 37 °까지 예열; C 사용 전 |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS 튜브 | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μ m 세포 여과기 | Corning | 352350 | |
| FC 버퍼 | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| 태아 송아지 혈청 | Sigma Aldrich | F6178 | 태아 송아지 혈청 |
| 고정 생존도 염료 eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| 집게(톱니, 직선, 12cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| 겸자(톱니형, 직선형, 12cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| 인슐린 주사기 100 솔로 1mL(Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| 대형 자기 컬럼(LS 컬럼) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | CD45-MACS-step |
| MCS 완충액 | 0.5% BSA, 2mM EDTA pH 7.2에서 PBS 중간 | ||
| 자성 컬럼(MS 컬럼) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, 바로 사용 가능한 | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µ g/mL |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 시그마 알드리치 | P4333 | |
| 일차 쥐 근육 세포 | 셀프로겐 | 66066-01 | |
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| 프라이머 Cldn5 (클라우딘-5) | 써모 피셔 | Mm00727012_s1 | FAM 라벨 |
| 프라이머 Ocln (오클루딘) | 써모 피셔 | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (진핵생물 내인성 대조군) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; 각 200회 반응의 |
| 경우, 단일 가닥 프라이머의 무작위 혼합물 | Thermo Fisher | SO142 | 무작위 헥사머 프라이머 |
| 역전사 효소(200 U/μ L) + PCR 완충액 (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
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| 가위(절삭날 42mm, 날카로움/뭉툭한) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| 스피드 코팅 솔루션 | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
참고문헌
- Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720(2015).
- Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
- Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S.
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