면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

Summary

여기, 우리 면역 형광 염색 법을 사용 하 여 마커 단백질, confocal 현미경 검사 법 및 컴퓨터 기반 분석 시 냅 스 단백질의 분포를 결정 하는 양적 접근 방식을 설명 합니다.

Abstract

존재, 결핍, 또는 특정 시 냅 스 단백질의 수준을 심각 하 게 시 냅 스 전송을 좌우할 수 있다. Elucidating 단백질의 기능, 뿐만 아니라 또한 그것의 배급을 결정에 필수적입니다. 여기, 우리는 면역 형광 검사, confocal 현미경 검사 법, 및 시 냅 스 단백질 발동기 (TPRGL 또는 SVAP30 라고도 함)의 분포를 확인 하기 위해 컴퓨터 기반 분석 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 따라서 발동기의 분포 synaptic vesicles의 풍부에 상대적인 양적 방식 결정 시 냅 스 소포 단백질 synaptophysin의 발동기의 분포를 비교 합니다. 특히,이 방법은 잠재적으로 다른 연구를 통해 또는 다른 항 체 또는 현미경을 사용 하 여 단백질의 분포의 비교 있도록 구현 수 있습니다. 우리의 방법은 절대 형광 수준 보다는 오히려 비율을 양보 하 여 immunofluorescent stainings의 고유의 가변성 circumvents. 또한, 우리가 설명 하는 방법 다른 수준에 단백질의 분포를 분석 하는 연구원을 가능: 전체 뇌 조각 한 두뇌 지역, 다른 레이어는 해 마의 또는 감각에서 오는 다른 아구에 뇌 영역에서 외피가입니다. 움직이는 시 냅 스 소포와 연결 되는 척추 관련 단백질 이다. 이 방법으로 우리는 발동기입니다 heterogeneously 뇌 영역, 상부 복 부 마, septal 핵에는 편도 해 마의 다른 레이어 같은 단일 뇌 영역 내에서 분산을 보여줍니다.

Introduction

뉴런 간의 통신 시 냅 스 라는 전문된 연락처 사이트에서 발생 합니다. 시 냅 스 통합 하는 시 냅 스 전송 하는 다른 단백질의 무수를 포함 합니다. 그 단백질의 일부는 신경 시스템을 통해 다른 유형의 분포를 표시 하 고 모든 시 냅 스¹에 존재 하지 않습니다. 이러한 단백질에 대 한 한 예로 시 냅 스 소포 프라이 밍 과정에 포함 되는 Munc13 이다. heterogeneously 뇌²전체 분포, Munc13의 다른 isoforms 그리고 존재 또는 부재 특정 isoforms의 영향을 미칠 수 단기 시 냅 스가 소성 및 시 냅 스 소포 역학^{3, 4 , 5}. 따라서 뇌 분야에 걸쳐 다른 시 냅 스 단백질의 존재를 식별할 수에 중요 한 중요성의 이다.

-지금까지-시 냅 스 단백질의 정량화에 대 한 선택의 메서드는 질량 분석 및 서 부 럽, 보다는 오히려 immunohistochemistry^6,7

Protocol

이 프로토콜은 실험 동물에 포함 되지 않습니다. 뇌 샘플을 얻기 위해 동물의 euthanizing 관련 실험 승인 번호 T 10/30 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin 괴팅겐) 현지 동물 보호 당국에 의해 승인 되었다.

참고:이 프로토콜에 대 한 3 성인 남성 C57BL/6 마우스 사용 되었다.

1. 샘플 준비

1. 정착 액 및 0.1 M 인산 버퍼 (PB; 표 1참조)를 준비 합니다.
2. 게이지 외 에 설명 된 대로 transcardial 관류 하 여 동물을 해결 ²⁸. 먼저 0.9로 혈액을 씻어 %NaCl 해결책, 다음 4 %paraformaldehyde (PFA)의 30 mL와 함께 perfuse.
3. 가 위 두개골을 열고 뇌 조직 손상을 방지 하려면 무딘 가장자리와 숟가락을 사용 하 여 조심 스럽게 분리 합니다.
4. 정착 액 50 mL 반응 관 작성 및 4%에서 뇌를 후 위 PFA 하룻밤에 4 ° C에서.
5. 정착 액을 제거 하 고 30 분 통에 0.1 m M PB의 50 mL에 뇌....

Results

대표 다른 마커 패턴을 얼룩이 지는 그림 1에서 볼 수 있습니다. 패턴은 단백질의 분포에 따라 달라 집니다. 5 rostro 꼬리 수준의 예 열 (A)에 표시 됩니다-(E). 첫 번째 행에 표시 되는 대표적인 DAPI 얼룩: DAPI는 세포의 DNA를 준수 하 고 따라서 핵은 스테인드. 이 결과 punctate 패턴. 높은 세포 밀도 낮은 세포 밀도와 지역 보다 밝은. Heterogeneously 분산된 단백질에 대 한 예는 두 번째 행에서 볼 수 있습니다. 얼룩이 발동기 밝은 핫스팟 지역 및 주차 지역 두뇌에 걸쳐 차등 분배를 보여준다. 세 번째 행에서 더 균질 분산된 참조 마커 synaptophysin에 대 한 예가 표시 됩니다. 두 단백질의 오버레이 (4 행) 차동의 분포를 보여줍니다 발동기 (빨간색) 마커 단백질 synaptophysin (녹색)에 비.......

Discussion

메서드는 알려진된 분포와 마커 단백질의 풍부에 상대적인 관심사의 단백질의 분포를 측정 하는 겨냥 여기 제시. 면역 형광 염색 얼룩 다른 조각 사이 농도의 높은 다양성을 표시할 수 있습니다. 정량화 방법은 여기에 설명 된 북반구 전체 평균에 관심사의 단백질의 비율을 결정 하 여이 문제를 circumvents. 따라서, 분할 영역에 걸쳐 서로 다른 착 색 농도가 밖으로 취소 하 고 정량에 대 한 허용.

모든 면역 형광 검사 프로토콜에서와 마찬가지로 질적 또는 양적, 여러 가지 요인 성공에 영향를 분석 함으로써 혼동 됩니다. 따라서, 프로토콜의 중요 한 단계에 특별 한 주의 지불 합니다. 첫째, 조직의 적절 한 고정이 필요 합니다. 이 고정 일반적으로 성공적인 transcardial 관류에 의해 얻을 수 있습니다. 관류의 품질은 혈액에 밖으로 세척 후 간을 확인 하 여 확인할 수 있습니다. 성공적인 관류에 대 한 첫 번째 지표는²⁸간 및 사지.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 반응 튜브	Eppendorf	30120094
50 mL 반응 튜브	Greiner Bio-One	227261
멀티웰 24 웰	Fisher Scientific	087721H
플라스틱 피펫 (일회용)	Sarstedt	861,176
1000 mL 피펫	Rainin
2 ml 피펫	Eppendorf	3123000012
Vortex Genius 3	IKA	3340001
Menzel 현미경 슬라이드	Fisher Scientific	10144633CF
스테레오스코프	Leica
LSM800	Zeiss		컨포칼 현미경
동결 마이크로톰	Leica
PBS (10X)	Roche
PFA	시그마	P6148-1kg
NaCl	BioFroxx	1394KG001
자당	neoFroxx	1104KG001
Tissue Tek	Sakura	4583	OCT
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
NaH2PO4	Merck	1,063,460,500
일반 염소 혈청	Merck Millipore	S26-100ML
일반 당나귀 혈청	Merck	S30-100ML
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
토끼 안티 무버	시냅스 시스템	RRID: AB_10804285
기니피그 항 시냅토피	시냅스 시스템	RRID: AB_1210382
당나귀 항 토끼 AF647	잭슨 면역연구	RRID: AB_2492288
염소 항 마우스 AF488	잭슨 면역연구	RRID: AB_2337438
Mowiol4-88	Calbiochem
ZEN2 블루 소프트웨어	, Zeiss	현미경 소프트웨어
FIJI	ImageJ		분석 소프트웨어
Microsoft Excel	Microsoft