면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

뉴런 간의 통신 시 냅 스 라는 전문된 연락처 사이트에서 발생 합니다. 시 냅 스 통합 하는 시 냅 스 전송 하는 다른 단백질의 무수를 포함 합니다. 그 단백질의 일부는 신경 시스템을 통해 다른 유형의 분포를 표시 하 고 모든 시 냅 스¹에 존재 하지 않습니다. 이러한 단백질에 대 한 한 예로 시 냅 스 소포 프라이 밍 과정에 포함 되는 Munc13 이다. heterogeneously 뇌²전체 분포, Munc13의 다른 isoforms 그리고 존재 또는 부재 특정 isoforms의 영향을 미칠 수 단기 시 냅 스가 소성 및 시 냅 스 소포 역학^{3, 4 , 5}. 따라서 뇌 분야에 걸쳐 다른 시 냅 스 단백질의 존재를 식별할 수에 중요 한 중요성의 이다.

-지금까지-시 냅 스 단백질의 정량화에 대 한 선택의 메서드는 질량 분석 및 서 부 럽, 보다는 오히려 immunohistochemistry^6,7,,89. 경우에 따라 여러 가지 방법은 모두 수량과 특정 단백질 (즉, 빌헬름 외 의 지역화를 평가 하기 위해 서로 보완 하 되 ¹⁰). 여기 설명 하는 방법 지역화 하 고 정량화 없이 단순히 채용 immunofluorescent stainings 어떤 생 화 확 적인 방법을 사용 하 여 관심사의 단백질의 수 있습니다. 또 다른 장점은 여기은 훨씬 작은 지역에는 정량화를 할 수 있습니다, 따라서, 그 보다 더 구체적인 다른 방법으로 달성. 그러나, 하나의 신뢰할 수 있는 레퍼런스 단백질 관심사의 단백질의 분포를 평가 하는 데 필요한은 고려 하고있다.

Immunohistochemistry 여 형광 얼룩 다른 신경 구획 내에서 뿐만 아니라 뇌 영역에 걸쳐 정기적으로 단백질의 지역화를 식별할 수 있습니다. 다른 구획을 식별 하기 위해 특정 마커 사용 됩니다. 일반적으로, synapsin 및 synaptophysin¹¹ 에 대하여 항 체 바 순에 대 한 항 체는 연 접 터미널¹²의 활성 영역 레이블을 동안 시 냅 스 소포 라벨을 사용할 수 있습니다. 기공을 전송기, 기공을 조미료 전송기 (vGluT) 또는 기공을 GABA 운송업 자 (vGAT), 같은 라벨을 흥분 성의¹³ 및 금지¹⁴ 연 접 맨끝 각각 사용 됩니다. Postsynaptic 측면에서 호머 단백질에 대 한 항 체 postsynaptic 터미널과 postsynaptic 밀도 단백질 95 (PSD95)^15,,1617 또는 gephyrin¹⁸ 에 대 한 항 체를 채택 될 수 있다 ^{, 19 , 20} 흥분 성의 또는 금지 postsynaptic 단말기를 각각 레이블을 수 있습니다. 관심 및 위에서 설명한 것과 같은 표시자의 단백질에 대하여 항 체를 사용 하 여 하나 이러한 단백질의 지 방화를 결정할 수 있습니다. 날짜에 많은 연구 질적 방법²¹에이 일을. 그러나, 특정 시 냅 스 단백질의 차등 분배를 안정적으로 결정 하려면 하나 결정 해야 합니다 하지만 그것의 존재 또는 부재 뿐만 아니라 그것의 상대 농도. 시 냅 스의 밀도 크기의이 시 냅 스 마커 및 관심사의 단백질 간의 비율을 설정 하는 것이 중요 합니다. 그렇지 않으면, 해 마의 비 피라미드 층 및 소 뇌의 분자 층 등 냅 풍부한 지역 시 냅 스 단백질, 시 냅 스의 높은 밀도 인해만 하지만 그 단백질의 강한 존재 때문에의 높은 밀도 표시 됩니다. (예를 들어, Wallrafen 및 Dresbach¹) 각 시 냅 스. 신경 소마 (예를 들어, TGN38²²)에 단백질이 hippocampal 피라미드 셀 레이어 또는 hippocampal 또는 소 뇌과 립 세포 층 신경 셀 시체의 높은 농도 때문에 강한 존재를 보여줄 것 이다 일반적으로 다른 한편으로, 에 그 지역. 따라서,이 비 균질 유통 구조,이 경우 synapses, 자체는 관심사의 단백질의 분포의 잘못 된 추정으로 이어질 수 있습니다. 또한, 샘플 immunohistochemical stainings에 걸쳐 휘도 얼룩에 본질적인 변화가입니다. 여기에 설명 된 프로토콜 고려이 고 immunohistochemical 방법에서 발생 하는 다른 주의 사항으로 그런 편견을 피 한다.

우리 16 서로 다른 뇌 영역¹에 걸쳐 발동기 (TPRGL²³ 또는 SVAP30²⁴라고도 함)의 차동 식을 설명 하기 위해이 메서드를 사용 해야, 우리의 최근 연구. 움직이는 척추 관련 시 냅 스 단백질 시 냅 스 소포에 협회에서 찾을 수 있습니다 및 영향 신경 전달 물질 방출^25,,2627이다. 우리 시 냅 스 소포 참조 표식으로 synaptophysin에 대 한 얼룩에 의해 시 냅 스 소포의 풍요에 발동기 식을 관련 있다. 우리는 특히 septal 핵, 복 부 마와 편도 체에 발동기의 높은 수준을 발견. 해 마, 내 우리 레이어 내부 hippocampal 계산와 입력 및 출력 계층의 낮은 수준에서에서 높은 수준으로 발동기의 다른 유형의 분포를 발견.

이 프로토콜은 실험 동물에 포함 되지 않습니다. 뇌 샘플을 얻기 위해 동물의 euthanizing 관련 실험 승인 번호 T 10/30 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin 괴팅겐) 현지 동물 보호 당국에 의해 승인 되었다.

참고:이 프로토콜에 대 한 3 성인 남성 C57BL/6 마우스 사용 되었다.

1. 샘플 준비

1. 정착 액 및 0.1 M 인산 버퍼 (PB; 표 1참조)를 준비 합니다.
2. 게이지 외 에 설명 된 대로 transcardial 관류 하 여 동물을 해결 ²⁸. 먼저 0.9로 혈액을 씻어 %NaCl 해결책, 다음 4 %paraformaldehyde (PFA)의 30 mL와 함께 perfuse.
3. 가 위 두개골을 열고 뇌 조직 손상을 방지 하려면 무딘 가장자리와 숟가락을 사용 하 여 조심 스럽게 분리 합니다.
4. 정착 액 50 mL 반응 관 작성 및 4%에서 뇌를 후 위 PFA 하룻밤에 4 ° C에서.
5. 정착 액을 제거 하 고 30 분 통에 0.1 m M PB의 50 mL에 뇌 세척.
6. 세척, 후 48 h 또는 cryoprotection 4 ° C에서 튜브에 싱크까지 0.1 m M 샌드위치에 30% 자당에서 50 mL 반응 관에 뇌를 품 어.
7. 날카로운 블레이드와 cryoprotected 뇌를 손질 하 고는 cryomold에 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물 포함. 거품을 하지 마십시오. 두뇌를 동양 및 cryomold-80 ° C 냉장고에서 동결.
8. 단면에 대 한 냉동된 조직을 탑재 합니다. 구분 하기 전에 적어도 15 분 동안 cryomicrotome 온도 조직 equilibrate.
9. 25 µ m 두께 코로나 조각으로 두뇌를 섹션. 뇌 조직을 건드리지 않고 신중 하 게 유리 걸이로 10 월을 터치 합니다. 24 잘 접시에 잘 당 3 인접 한 조각을 수집 하 고 얼룩까지 4 ° C에서 0.1 M PB에 저장.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기까지 2 주 동안. 긴 저장 시간 조직 품질을 방해 하 고 따라서 실험의 결과 영향을 미칠 수 있습니다.

2입니다. 면역 형광 검사

1. 블로킹 버퍼, 항 체 버퍼, 세척 버퍼 1, 및 세척 버퍼 2 ( 표 1참조)를 포함 한 솔루션을 준비 합니다.
2. 초과 10 월을 제거 하는 PB와 한 번 분할 영역을 씻어.
   1. 두뇌 조각에서 빠는 없이 플라스틱 피 펫과 솔루션을 제거 합니다. 1000 µ L 피 펫과 신선한 PB의 250 µ L를 추가 합니다.
      주의: 분할 영역 해야 하지 밖으로 건조, 그래서 제거 하 고 체액 잘에 의해 잘 추가.
3. 플라스틱 피 펫으로 PB를 제거 하 고 250 µ L 당 1000 µ L 피 펫 잘 차단 버퍼의 추가. 셰이 커에 실 온 (RT)에서 3 h에 대 한 품 어.
4. 인큐베이션 기간 동안, 항 체 반응 튜브에 버퍼에서 기본 항 체 희석. 잘 당 250 µ L 항 체 버퍼를 사용 하 고 항 체의 적절 한 금액을 추가 ( 표 2참조) 2 µ L 피 펫을 사용 하 여 솔루션에 직접 pipetting으로. 부드럽게 몇 번 위아래로 pipetting으로 솔루션을 믹스. 소용돌이 후 적절 한 혼합 되도록 곧입니다.
   참고: 배경 형광을 확인 하려면 stainings 또한 수행 되어야 한다 1 차 항 체를 추가 하지 않고. 그에 대 한 항 체는 프로토콜에 따라 기본 항 체 없이 솔루션에서 슬라이스를 품 어.
5. 외피 시간 후 플라스틱 피 펫과 블로킹 버퍼를 제거 하 고 잘 당 1 차 항 체를 포함 하는 항 체 솔루션의 250 µ L를 추가 합니다. 통에 4 ° C에서 하룻밤 1 차 항 체로 분할 영역을 품 어.
6. 다음 날, 세척 버퍼 1 3 조각 씻어 통에 RT에서 10 분에 대 한 x.
   1. 플라스틱 피 펫과 매체를 제거 하 고 잘 당 버퍼 1 세척의 300 µ L를 추가 합니다. 10 분 반복 3 번 RT에서 품 어.
7. 세척 단계 동안 반응 관에서 항 체 버퍼에 fluorophore 결합 보조 항 체 희석. 잘 당 250 µ L 항 체 버퍼를 사용 하 고 항 체의 적절 한 금액을 추가 ( 표 2참조) 2 µ L 피 펫을 사용 하 여 솔루션에 직접 pipetting으로. 부드럽게 몇 번 위아래로 pipetting으로 솔루션을 믹스. 소용돌이 후 적절 한 혼합 되도록 곧입니다.
   주의: 항 체는 빛에 민감한, 때문에이 시점에서 모든 단계 어둠 속에서 수행 해야 합니다.
8. 세척 단계, 세척 플라스틱 피 펫을 버퍼링 하 고 잘 당 2 차 항 체를 포함 하는 항 체 솔루션의 250 µ L를 추가 제거 후. 어둠 속에서 RT에서 90 분에 대 한 2 차 항 체로 슬라이스를 품 어.
9. 버퍼 2 3의 세척 조각 씻어 실시간에서 10 분 x
10. 세척 단계 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0.1 M 샌드위치 1: 2000의 농도에서 희석.
11. 플라스틱 피 펫으로 세척 버퍼 2를 제거 하 고 잘 당 DAPI 솔루션의 250 µ L을 추가. 셰이 커에 RT에 5 분 동안 품 어.
12. 플라스틱 피 펫 DAPI 솔루션을 제거 하 고 1000 µ L 피 펫 잘 당 0.1 M PB의 500 µ L을 추가.
13. 현미경 슬라이드에 분할 영역을 탑재 합니다.
    1. 장소는 stereoscope 아래 현미경 슬라이드입니다. 정밀한 브러시와 함께 슬라이드에 0.1 m M PB의 세 가지 별도 방울을 추가 합니다. 현미경 슬라이드에 드롭 당 하나의 슬라이스를 놓습니다.
    2. 좋은 브러시를 사용 하 여 평평 하 고 방향을 현미경 슬라이드에서 조각.
    3. 모든 분할 영역을 올바르게 배치 하는 경우 초과 PB 화장지로 제거 하 고 신중 하 게 슬라이드를 건조.
       주의: 두뇌 분할 영역을 완전히 건조 하지 마십시오.
    4. 슬라이드에 매체를 포함 80 µ L를 추가 합니다. 신중 하 게 그로 인하여 뇌 조각 포함 슬라이드에 coverslip 낮은.
    5. 1-2 h에 대 한 증기 두건에서 건조 슬라이드를 두고 (빛에 노출을 피하기 위해 그들을 커버) 4 ° c.에 현미경 슬라이드 상자에 보관
       참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

3입니다. 영상

1. 포함 매체 완전히 경화 된 후, confocal 현미경 현미경 슬라이드를 놓습니다.
   참고: Epifluorescence 현미경 deconvolution 소프트웨어와 함께 비슷한 이미지 품질을 양보 한다.
2. 증가 또는 감소 하는 모든 채널에 대 한 레이저 강도 몇 픽셀 회색 값의 최대 배포 되도록 과도 노출 레이저 설정을 조정 합니다.
3. 다른 채널에 대 한 전체 뇌 조각의 가상 조직 취득.
   1. 이미징 소프트웨어에서 ( 재료의 표참조), 타일 옵션을 선택 하 고 수동으로 타일 지역 설치뇌 조각 윤곽을 그리 다.
   2. 지원 포인트 타일 지역에 걸쳐 배포 하 고 확인 타일 지역/위치... 를 눌러 다른 지원 포인트에 대 한 초점을 조정
   3. 결과 이미지의 원하는 해상도 파일 크기에 따라 획득 모드 에서 설정을 조정 하 고 스캔을 시작.
4. 검사가 완료 되 면 가상 조직 처리를 바느질 함수를 사용 합니다. .Tif 이미지 내보내기기능으로 파일을 내보냅니다.

4. 컴퓨터 기반 분석

1. 파일을 클릭 하 여 피지²⁹ 으로 하나의 이미지에 대 한 모든 단일 채널 로드 | 오픈.
2. 자유형 선택 도구와 함께 한 반구를 DAPI 채널에 나타냅니다. 편집을 클릭 하 여 선택의 마스크를 만들기 | 선택 | 마스크 레이어 만들기.
3. 분석을 클릭 하 여 단일 채널 (발동기 및 synaptophysin)에 대 한 평균 형광 강도 결정 | 측정.
   참고: 각 채널에 대 한 평균 형광 강도 값을 결정 하는 다른 채널을 선택할 수 있는지 확인 합니다.
4. 단일 채널에 대 한 평균 형광 강도 스프레드시트에 복사 합니다.
5. 또한 자유 선택 도구로 영역을 묘사 하 여 관심의 영역에서 단일 채널에 대 한 평균 형광 강도 결정 합니다. 마우스 뇌 아틀라스를 사용 하 여 참조로.
6. 모든 관심 분야에 대 한 모든 반구 4.1-4.5 단계를 반복 합니다.
   참고: 별도로 나중에서 그 관심의 영역에 값을 비교 하기 위해 각 반구에 대 한 값을 결정 (단계 5.2 참조).

5. 데이터 처리

1. 배경 형광은 높은 경우 ( 내용참조), 배경 빼기 필요. 그에 대 한 참조 단백질에 대 한 1 차적인 항 체 없이 처리 하는 조각에 대 한 평균 형광 강도 결정 (여기: synaptophysin) 뇌 영역 및 반구에 대 한 가져온 모든 값에서 해당 값을 뺍니다.
2. 모든 반구와 관심의 모든 영역에 대 한 단일 채널에 대 한 평균 형광 강렬을 확인 한 때 ( 표 3참조), synaptophysin (에 대 한 값으로 발동기에 대 한 값을 분할 하 여 synaptophysin에 발동기의 비율을 계산 표 3에 노란색)입니다. 모든 반구와 관심의 모든 영역에 대 한이 작업을 별도로 수행할.
3. 북반구에 관심 분야의 비율을 확인 하려면 해당 반구 ( 표 3에 오렌지) 획득 비율에 의해 얻은 관심의 한 영역에 대 한 비율을 나눕니다.
4. 상대 발동기 풍부를 확인 하려면 1 ( 표 3에 빨간색)에서 편차를 확인 하 여 백분율에 5.2에서 얻은 비율을 번역 합니다. 1.25 비율 따라서 평균, 이상 25%의 상대 발동기 풍부 줄 고 0.75의 비율 평균 25%의 상대 발동기 풍부를 얻을 것 이다.

대표 다른 마커 패턴을 얼룩이 지는 그림 1에서 볼 수 있습니다. 패턴은 단백질의 분포에 따라 달라 집니다. 5 rostro 꼬리 수준의 예 열 (A)에 표시 됩니다-(E). 첫 번째 행에 표시 되는 대표적인 DAPI 얼룩: DAPI는 세포의 DNA를 준수 하 고 따라서 핵은 스테인드. 이 결과 punctate 패턴. 높은 세포 밀도 낮은 세포 밀도와 지역 보다 밝은. Heterogeneously 분산된 단백질에 대 한 예는 두 번째 행에서 볼 수 있습니다. 얼룩이 발동기 밝은 핫스팟 지역 및 주차 지역 두뇌에 걸쳐 차등 분배를 보여준다. 세 번째 행에서 더 균질 분산된 참조 마커 synaptophysin에 대 한 예가 표시 됩니다. 두 단백질의 오버레이 (4 행) 차동의 분포를 보여줍니다 발동기 (빨간색) 마커 단백질 synaptophysin (녹색)에 비해.

그림 2 는 프로토콜의 4 단계에 설명 된 정량화. 반구 (발동기, 그림 2A; synaptophysin, 그림 2B) 및 (발동기, 그림 2C; 관심 분야를 통해 서로 다른 채널에 대 한 평균 형광 강도 값은 synaptophysin, 그림 2D). 시 냅 스 소포 수를 감안 발동기 풍부를 확인 하려면 비율 synaptophysin 형광 값 게 발동기 형광 값의. 관심 분야에 대 한 이러한 비율 그림 2E에 표시 됩니다 및 발동기의 이질적인 배급의 표시를 제공 하는 이미, 분야와 높고 낮은 발동기 레벨 시 냅 스 소포에 상대적으로. 또한 고유의 기술 변화에 대 한 보상, (그림 2E) 한 지역에 비율 (표시 되지 않음) 반구 전체에 비해 이며 백분율으로 번역. 얼마나 많은 발동기의 측정이 상대 발동기 풍부 (그림 2F) 제공이 관심 상대 평균에 한 지역에 존재 합니다.

위에서 설명 했 듯이,이 기술은의 주요 장점 중 하나 아주 작은 지역, 심지어 오는 아구와 관심 분야의 레이어 관심사의 단백질의 풍부를 결정 하는 기능입니다. 이 응용 프로그램의 한 예는 그림 3, 상대 발동기 풍부 해 마의 하위에 여러 계층에 대 한 결정은에 표시 됩니다. 그림 3C, 그림 3E, 및 에 표시 된 계층에 해당 하는 다른 레이어에 그림 3D,F, 그림 3 그림 3H 정량화 그림 3G, 해당 색상으로. 해 마, 내 발동기 heterogeneously 배포, 레이어 내부 hippocampal 계산 (즉,가 이랑 [DG] 지층 radiatum의 변이 층과 관련 된 시 냅 스 소포에 상대적으로 높은 발동기 레벨 lucidum oriens 뿔 Ammonis 3의 [CA3] 지층 radiatum 그리고 뿔 Ammonis 1 [CA1]의 oriens), 및 입력 및 출력 계층의 낮은 수준 (DG, CA3와, CA1 피라미드 세포 층의 내부 및 외부 분자 층 및 지층 lacunosum-moleculare의 CA1)입니다.

그림 1 : DAPI의 대표적인 면역 형광 이미지 (첫 번째 행), 발동기 (두 번째 행), synaptophysin (3 행), 그리고 그들의 (4 행, 녹색에서 빨간색으로 synaptophysin에 발동기) 5 rostro 꼬리 수준 (A-E)에서 오버레이. 관심 분야는 패널의 위쪽 행에 회색으로 음영 처리 된. M1, 기본 모터 피 질; IoC, Calleja;의 섬 ACC, 전방 대상 피 질; 서울대, septal 핵; VPa, 복 부 마; 쿠의 루 하프, 핵 accumbens; CP, 꼬리가 putamen; S1, 기본 somatosensory 피 질; Hc, 해 마; 오전, 편도; MHa, 중간 habenula; PAG, periaqueductal 회색; SN, substantia nigra; VTA, 복 부 tegmental 지역; MLC, 소 뇌;의 분자 층 GLC, 소 뇌의 세분화 된 계층 눈금 막대 = 500 µ m. 이 그림은 Wallrafen 및 Dresbach1에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 5 rostro 꼬리 단계에 걸쳐 발동기 분포의 정량화. 움직이는 신호 (A)와 서로 다른 수준에서 synaptophysin 신호 (B)의 형광 강도 의미 한다. 16 수동으로 delineated 뇌 영역에서 동기 신호 (C)와 synaptophysin 신호 (D)의 형광 강도 의미 한다. (E) 비율의 발동기 그리고 관심의 16 뇌 영역에 synaptophysin. (F) 해당 반구의 비율을 각각 영역에 발동기/synaptophysin 비율 비교과 상대 발동기 풍부의 정량화. M1, 기본 모터 피 질; IoC, Calleja;의 섬 ACC, 전방 대상 피 질; 서울대, septal 핵; VPa, 복 부 마; 쿠의 루 하프, 핵 accumbens; CP, 꼬리가 putamen; S1, 기본 somatosensory 피 질; Hc, 해 마; 오전, 편도; MHa, 중간 habenula; PAG, periaqueductal 회색; SN, substantia nigra; VTA, 복 부 tegmental 지역; MLC, 소 뇌의 분자 층 검은 점 들에는 단일 데이터 지점을 나타냅니다. 막대는 평균 ± 표준 오차 (SEM) 의미의 표시 됩니다. 이 그림은 Wallrafen 및 Dresbach1에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : 마우스 해 마에서 발동기 배포. 면역 형광 검사 stainings 마우스 해 마의 코로나 조각의. 보여주는 이기종 발동기 정규식 패턴 (A)와 (B) 얼룩 해당 Synaptophysin 해 마의 개요. 관심 (DG, 그림 3C의 3 개 지역 CA3, 그림 3E; CA1, 그림 3G)는 흰색 점선으로 구분 된. (D,F,H) 부 량에 해당 하는 반구의 비율을 각각 레이어 비율을 비교. 막대 그래프에서 색상 C, E및 G패널에 각 음영에 해당합니다. 움직이는 식이 내부 hippocampal 계산 (즉, DG, 지층 radiatum, lucidum 고 CA3, 및 지층 radiatum oriens CA1 oriens의 변이 레이어)와에 주요 입력-출력 레이어 (낮은 수준에서 높은 DG, CA3와, CA1 피라미드 세포 층의 내부 및 외부 분자 층 및 CA1의 지층 lacunosum-moleculare). OML, 외부 분자 층; IML, 내부 분자 레이어; GrL, 세분화 된 계층; PmL, 변이 레이어/hilus; 그래서, 지층 oriens; 스파이, 지층 pyramidale; SLu, 지층 lucidum; SR, 지층 radiatum; SLM, 지층 lacunosum-moleculare 눈금 막대 500 µ m. 검은 점 대표 단일 데이터 포인트 =. 바 보여 평균 ± SEM. 이 그림은 Wallrafen 및 Dresbach1에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1: 솔루션이이 프로토콜에 사용입니다.

표 2:이 프로토콜에 사용 되는 항 체.

표 3: 데이터 처리의 예입니다.

저자는 공개 없다.