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방법 논문

면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

8.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58940

⸱

2019년 1월 29일

 ,  , 
1Institute of Anatomy and Embryology, University Medical Center Göttingen

이 논문에서

요약

여기, 우리 면역 형광 염색 법을 사용 하 여 마커 단백질, confocal 현미경 검사 법 및 컴퓨터 기반 분석 시 냅 스 단백질의 분포를 결정 하는 양적 접근 방식을 설명 합니다.

초록

존재, 결핍, 또는 특정 시 냅 스 단백질의 수준을 심각 하 게 시 냅 스 전송을 좌우할 수 있다. Elucidating 단백질의 기능, 뿐만 아니라 또한 그것의 배급을 결정에 필수적입니다. 여기, 우리는 면역 형광 검사, confocal 현미경 검사 법, 및 시 냅 스 단백질 발동기 (TPRGL 또는 SVAP30 라고도 함)의 분포를 확인 하기 위해 컴퓨터 기반 분석 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 따라서 발동기의 분포 synaptic vesicles의 풍부에 상대적인 양적 방식 결정 시 냅 스 소포 단백질 synaptophysin의 발동기의 분포를 비교 합니다. 특히,이 방법은 잠재적으로 다른 연구를 통해 또는 다른 항 체 또는 현미경을 사용 하 여 단백질의 분포의 비교 있도록 구현 수 있습니다. 우리의 방법은 절대 형광 수준 보다는 오히려 비율을 양보 하 여 immunofluorescent stainings의 고유의 가변성 circumvents. 또한, 우리가 설명 하는 방법 다른 수준에 단백질의 분포를 분석 하는 연구원을 가능: 전체 뇌 조각 한 두뇌 지역, 다른 레이어는 해 마의 또는 감각에서 오는 다른 아구에 뇌 영역에서 외피가입니다. 움직이는 시 냅 스 소포와 연결 되는 척추 관련 단백질 이다. 이 방법으로 우리는 발동기입니다 heterogeneously 뇌 영역, 상부 복 부 마, septal 핵에는 편도 해 마의 다른 레이어 같은 단일 뇌 영역 내에서 분산을 보여줍니다.

서론

뉴런 간의 통신 시 냅 스 라는 전문된 연락처 사이트에서 발생 합니다. 시 냅 스 통합 하는 시 냅 스 전송 하는 다른 단백질의 무수를 포함 합니다. 그 단백질의 일부는 신경 시스템을 통해 다른 유형의 분포를 표시 하 고 모든 시 냅 스1에 존재 하지 않습니다. 이러한 단백질에 대 한 한 예로 시 냅 스 소포 프라이 밍 과정에 포함 되는 Munc13 이다. heterogeneously 뇌2전체 분포, Munc13의 다른 isoforms 그리고 존재 또는 부재 특정 isoforms의 영향을 미칠 수 단기 시 냅 스가 소성 및 시 냅 스 소포 역학3, 4 , 5. 따라서 뇌 분야에 걸쳐 다른 시 냅 스 단백질의 존재를 식별할 수에 중요 한 중요성의 이다.

-지금까지-시 냅 스 단백질의 정량화에 대 한 선택의 메서드는 질량 분석 및 서 부 럽, 보다는 오히려 immunohistochemistry6,7,,89. 경우에 따라 여러 가지 방법은 모두 수량과 특정 단백질 (즉, 빌헬름 외 의 지역화를 평가 하기 위해 서로 보완 하 되 10). 여기 설명 하는 방법 지역화 하 고 정량화 없이 단순히 채용 immunofluorescent stainings 어떤 생 화 확 적인 방법을 사용 하 여 관심사의 단백질의 수 있습니다. 또 다른 장점은 여기은 훨씬 작은 지역에는 정량화를 할 수 있습니다, 따라서, 그 보다 더 구체적인 다른 방법으로 달성. 그러나, 하나의 신뢰할 수 있는 레퍼런스 단백질 관심사의 단백질의 분포를 평가 하는 데 필요한은 고려 하고있다.

Immunohistochemistry 여 형광 얼룩 다른 신경 구획 내에서 뿐만 아니라 뇌 영역에 걸쳐 정기적으로 단백질의 지역화를 식별할 수 있습니다. 다른 구획을 식별 하기 위해 특정 마커 사용 됩니다. 일반적으로, synapsin 및 synaptophysin11 에 대하여 항 체 바 순에 대 한 항 체는 연 접 터미널12의 활성 영역 레이블을 동안 시 냅 스 소포 라벨을 사용할 수 있습니다. 기공을 전송기, 기공을 조미료 전송기 (vGluT) 또는 기공을 GABA 운송업 자 (vGAT), 같은 라벨을 흥분 성의13 및 금지14 연 접 맨끝 각각 사용 됩니다. Postsynaptic 측면에서 호머 단백질에 대 한 항 체 postsynaptic 터미널과 postsynaptic 밀도 단백질 95 (PSD95)15,,1617 또는 gephyrin18 에 대 한 항 체를 채택 될 수 있다 , 19 , 20 흥분 성의 또는 금지 postsynaptic 단말기를 각각 레이블을 수 있습니다. 관심 및 위에서 설명한 것과 같은 표시자의 단백질에 대하여 항 체를 사용 하 여 하나 이러한 단백질의 지 방화를 결정할 수 있습니다. 날짜에 많은 연구 질적 방법21에이 일을. 그러나, 특정 시 냅 스 단백질의 차등 분배를 안정적으로 결정 하려면 하나 결정 해야 합니다 하지만 그것의 존재 또는 부재 뿐만 아니라 그것의 상대 농도. 시 냅 스의 밀도 크기의이 시 냅 스 마커 및 관심사의 단백질 간의 비율을 설정 하는 것이 중요 합니다. 그렇지 않으면, 해 마의 비 피라미드 층 및 소 뇌의 분자 층 등 냅 풍부한 지역 시 냅 스 단백질, 시 냅 스의 높은 밀도 인해만 하지만 그 단백질의 강한 존재 때문에의 높은 밀도 표시 됩니다. (예를 들어, Wallrafen 및 Dresbach1) 각 시 냅 스. 신경 소마 (예를 들어, TGN3822)에 단백질이 hippocampal 피라미드 셀 레이어 또는 hippocampal 또는 소 뇌과 립 세포 층 신경 셀 시체의 높은 농도 때문에 강한 존재를 보여줄 것 이다 일반적으로 다른 한편으로, 에 그 지역. 따라서,이 비 균질 유통 구조,이 경우 synapses, 자체는 관심사의 단백질의 분포의 잘못 된 추정으로 이어질 수 있습니다. 또한, 샘플 immunohistochemical stainings에 걸쳐 휘도 얼룩에 본질적인 변화가입니다. 여기에 설명 된 프로토콜 고려이 고 immunohistochemical 방법에서 발생 하는 다른 주의 사항으로 그런 편견을 피 한다.

우리 16 서로 다른 뇌 영역1에 걸쳐 발동기 (TPRGL23 또는 SVAP3024라고도 함)의 차동 식을 설명 하기 위해이 메서드를 사용 해야, 우리의 최근 연구. 움직이는 척추 관련 시 냅 스 단백질 시 냅 스 소포에 협회에서 찾을 수 있습니다 및 영향 신경 전달 물질 방출25,,2627이다. 우리 시 냅 스 소포 참조 표식으로 synaptophysin에 대 한 얼룩에 의해 시 냅 스 소포의 풍요에 발동기 식을 관련 있다. 우리는 특히 septal 핵, 복 부 마와 편도 체에 발동기의 높은 수준을 발견. 해 마, 내 우리 레이어 내부 hippocampal 계산와 입력 및 출력 계층의 낮은 수준에서에서 높은 수준으로 발동기의 다른 유형의 분포를 발견.

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프로토콜

이 프로토콜은 실험 동물에 포함 되지 않습니다. 뇌 샘플을 얻기 위해 동물의 euthanizing 관련 실험 승인 번호 T 10/30 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin 괴팅겐) 현지 동물 보호 당국에 의해 승인 되었다.

참고:이 프로토콜에 대 한 3 성인 남성 C57BL/6 마우스 사용 되었다.

1. 샘플 준비

  1. 정착 액 및 0.1 M 인산 버퍼 (PB; 표 1참조)를 준비 합니다.
  2. 게이지 외 에 설명 된 대로 transcardial 관류 하 여 동물을 해결 28. 먼저 0.9로 혈액을 씻어 %NaCl 해결책, 다음 4 %paraformaldehyde (PFA)의 30 mL와 함께 perfuse.
  3. 가 위 두개골을 열고 뇌 조직 손상을 방지 하려면 무딘 가장자리와 숟가락을 사용 하 여 조심 스럽게 분리 합니다.
  4. 정착 액 50 mL 반응 관 작성 및 4%에서 뇌를 후 위 PFA 하룻밤에 4 ° C에서.
  5. 정착 액을 제거 하 고 30 분 통에 0.1 m M PB의 50 mL에 뇌 세척.
  6. 세척, 후 48 h 또는 cryoprotection 4 ° C에서 튜브에 싱크까지 0.1 m M 샌드위치에 30% 자당에서 50 mL 반응 관에 뇌를 품 어.
  7. 날카로운 블레이드와 cryoprotected 뇌를 손질 하 고는 cryomold에 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물 포함. 거품을 하지 마십시오. 두뇌를 동양 및 cryomold-80 ° C 냉장고에서 동결.
  8. 단면에 대 한 냉동된 조직을 탑재 합니다. 구분 하기 전에 적어도 15 분 동안 cryomicrotome 온도 조직 equilibrate.
  9. 25 µ m 두께 코로나 조각으로 두뇌를 섹션. 뇌 조직을 건드리지 않고 신중 하 게 유리 걸이로 10 월을 터치 합니다. 24 잘 접시에 잘 당 3 인접 한 조각을 수집 하 고 얼룩까지 4 ° C에서 0.1 M PB에 저장.
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기까지 2 주 동안. 긴 저장 시간 조직 품질을 방해 하 고 따라서 실험의 결과 영향을 미칠 수 있습니다.

2입니다. 면역 형광 검사

  1. 블로킹 버퍼, 항 체 버퍼, 세척 버퍼 1, 및 세척 버퍼 2 ( 표 1참조)를 포함 한 솔루션을 준비 합니다.
  2. 초과 10 월을 제거 하는 PB와 한 번 분할 영역을 씻어.
    1. 두뇌 조각에서 빠는 없이 플라스틱 피 펫과 솔루션을 제거 합니다. 1000 µ L 피 펫과 신선한 PB의 250 µ L를 추가 합니다.
      주의: 분할 영역 해야 하지 밖으로 건조, 그래서 제거 하 고 체액 잘에 의해 잘 추가.
  3. 플라스틱 피 펫으로 PB를 제거 하 고 250 µ L 당 1000 µ L 피 펫 잘 차단 버퍼의 추가. 셰이 커에 실 온 (RT)에서 3 h에 대 한 품 어.
  4. 인큐베이션 기간 동안, 항 체 반응 튜브에 버퍼에서 기본 항 체 희석. 잘 당 250 µ L 항 체 버퍼를 사용 하 고 항 체의 적절 한 금액을 추가 ( 표 2참조) 2 µ L 피 펫을 사용 하 여 솔루션에 직접 pipetting으로. 부드럽게 몇 번 위아래로 pipetting으로 솔루션을 믹스. 소용돌이 후 적절 한 혼합 되도록 곧입니다.
    참고: 배경 형광을 확인 하려면 stainings 또한 수행 되어야 한다 1 차 항 체를 추가 하지 않고. 그에 대 한 항 체는 프로토콜에 따라 기본 항 체 없이 솔루션에서 슬라이스를 품 어.
  5. 외피 시간 후 플라스틱 피 펫과 블로킹 버퍼를 제거 하 고 잘 당 1 차 항 체를 포함 하는 항 체 솔루션의 250 µ L를 추가 합니다. 통에 4 ° C에서 하룻밤 1 차 항 체로 분할 영역을 품 어.
  6. 다음 날, 세척 버퍼 1 3 조각 씻어 통에 RT에서 10 분에 대 한 x.
    1. 플라스틱 피 펫과 매체를 제거 하 고 잘 당 버퍼 1 세척의 300 µ L를 추가 합니다. 10 분 반복 3 번 RT에서 품 어.
  7. 세척 단계 동안 반응 관에서 항 체 버퍼에 fluorophore 결합 보조 항 체 희석. 잘 당 250 µ L 항 체 버퍼를 사용 하 고 항 체의 적절 한 금액을 추가 ( 표 2참조) 2 µ L 피 펫을 사용 하 여 솔루션에 직접 pipetting으로. 부드럽게 몇 번 위아래로 pipetting으로 솔루션을 믹스. 소용돌이 후 적절 한 혼합 되도록 곧입니다.
    주의: 항 체는 빛에 민감한, 때문에이 시점에서 모든 단계 어둠 속에서 수행 해야 합니다.
  8. 세척 단계, 세척 플라스틱 피 펫을 버퍼링 하 고 잘 당 2 차 항 체를 포함 하는 항 체 솔루션의 250 µ L를 추가 제거 후. 어둠 속에서 RT에서 90 분에 대 한 2 차 항 체로 슬라이스를 품 어.
  9. 버퍼 2 3의 세척 조각 씻어 실시간에서 10 분 x
  10. 세척 단계 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0.1 M 샌드위치 1: 2000의 농도에서 희석.
  11. 플라스틱 피 펫으로 세척 버퍼 2를 제거 하 고 잘 당 DAPI 솔루션의 250 µ L을 추가. 셰이 커에 RT에 5 분 동안 품 어.
  12. 플라스틱 피 펫 DAPI 솔루션을 제거 하 고 1000 µ L 피 펫 잘 당 0.1 M PB의 500 µ L을 추가.
  13. 현미경 슬라이드에 분할 영역을 탑재 합니다.
    1. 장소는 stereoscope 아래 현미경 슬라이드입니다. 정밀한 브러시와 함께 슬라이드에 0.1 m M PB의 세 가지 별도 방울을 추가 합니다. 현미경 슬라이드에 드롭 당 하나의 슬라이스를 놓습니다.
    2. 좋은 브러시를 사용 하 여 평평 하 고 방향을 현미경 슬라이드에서 조각.
    3. 모든 분할 영역을 올바르게 배치 하는 경우 초과 PB 화장지로 제거 하 고 신중 하 게 슬라이드를 건조.
      주의: 두뇌 분할 영역을 완전히 건조 하지 마십시오.
    4. 슬라이드에 매체를 포함 80 µ L를 추가 합니다. 신중 하 게 그로 인하여 뇌 조각 포함 슬라이드에 coverslip 낮은.
    5. 1-2 h에 대 한 증기 두건에서 건조 슬라이드를 두고 (빛에 노출을 피하기 위해 그들을 커버) 4 ° c.에 현미경 슬라이드 상자에 보관
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

3입니다. 영상

  1. 포함 매체 완전히 경화 된 후, confocal 현미경 현미경 슬라이드를 놓습니다.
    참고: Epifluorescence 현미경 deconvolution 소프트웨어와 함께 비슷한 이미지 품질을 양보 한다.
  2. 증가 또는 감소 하는 모든 채널에 대 한 레이저 강도 몇 픽셀 회색 값의 최대 배포 되도록 과도 노출 레이저 설정을 조정 합니다.
  3. 다른 채널에 대 한 전체 뇌 조각의 가상 조직 취득.
    1. 이미징 소프트웨어에서 ( 재료의 표참조), 타일 옵션을 선택 하 고 수동으로 타일 지역 설치뇌 조각 윤곽을 그리 다.
    2. 지원 포인트 타일 지역에 걸쳐 배포 하 고 확인 타일 지역/위치... 를 눌러 다른 지원 포인트에 대 한 초점을 조정
    3. 결과 이미지의 원하는 해상도 파일 크기에 따라 획득 모드 에서 설정을 조정 하 고 스캔을 시작.
  4. 검사가 완료 되 면 가상 조직 처리를 바느질 함수를 사용 합니다. .Tif 이미지 내보내기기능으로 파일을 내보냅니다.

4. 컴퓨터 기반 분석

  1. 파일을 클릭 하 여 피지29 으로 하나의 이미지에 대 한 모든 단일 채널 로드 | 오픈.
  2. 자유형 선택 도구와 함께 한 반구를 DAPI 채널에 나타냅니다. 편집을 클릭 하 여 선택의 마스크를 만들기 | 선택 | 마스크 레이어 만들기.
  3. 분석을 클릭 하 여 단일 채널 (발동기 및 synaptophysin)에 대 한 평균 형광 강도 결정 | 측정.
    참고: 각 채널에 대 한 평균 형광 강도 값을 결정 하는 다른 채널을 선택할 수 있는지 확인 합니다.
  4. 단일 채널에 대 한 평균 형광 강도 스프레드시트에 복사 합니다.
  5. 또한 자유 선택 도구로 영역을 묘사 하 여 관심의 영역에서 단일 채널에 대 한 평균 형광 강도 결정 합니다. 마우스 뇌 아틀라스를 사용 하 여 참조로.
  6. 모든 관심 분야에 대 한 모든 반구 4.1-4.5 단계를 반복 합니다.
    참고: 별도로 나중에서 그 관심의 영역에 값을 비교 하기 위해 각 반구에 대 한 값을 결정 (단계 5.2 참조).

5. 데이터 처리

  1. 배경 형광은 높은 경우 ( 내용참조), 배경 빼기 필요. 그에 대 한 참조 단백질에 대 한 1 차적인 항 체 없이 처리 하는 조각에 대 한 평균 형광 강도 결정 (여기: synaptophysin) 뇌 영역 및 반구에 대 한 가져온 모든 값에서 해당 값을 뺍니다.
  2. 모든 반구와 관심의 모든 영역에 대 한 단일 채널에 대 한 평균 형광 강렬을 확인 한 때 ( 표 3참조), synaptophysin (에 대 한 값으로 발동기에 대 한 값을 분할 하 여 synaptophysin에 발동기의 비율을 계산 표 3에 노란색)입니다. 모든 반구와 관심의 모든 영역에 대 한이 작업을 별도로 수행할.
  3. 북반구에 관심 분야의 비율을 확인 하려면 해당 반구 ( 표 3에 오렌지) 획득 비율에 의해 얻은 관심의 한 영역에 대 한 비율을 나눕니다.
  4. 상대 발동기 풍부를 확인 하려면 1 ( 표 3에 빨간색)에서 편차를 확인 하 여 백분율에 5.2에서 얻은 비율을 번역 합니다. 1.25 비율 따라서 평균, 이상 25%의 상대 발동기 풍부 줄 고 0.75의 비율 평균 25%의 상대 발동기 풍부를 얻을 것 이다.

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결과

대표 다른 마커 패턴을 얼룩이 지는 그림 1에서 볼 수 있습니다. 패턴은 단백질의 분포에 따라 달라 집니다. 5 rostro 꼬리 수준의 예 열 (A)에 표시 됩니다-(E). 첫 번째 행에 표시 되는 대표적인 DAPI 얼룩: DAPI는 세포의 DNA를 준수 하 고 따라서 핵은 스테인드. 이 결과 punctate 패턴. 높은 세포 밀도 낮은 세포 밀도와 지역 보다 밝은. Heterogeneously 분산된 단백질에 대 한 예는 두 번째 행에서 볼 수 있습니다. 얼룩이 발동기 밝은 핫스팟 지역 및 주차 지역 두뇌에 걸쳐 차등 분배를 보여준다. 세 번째 행에서 더 균질 분산된 참조 마커 synaptophysin에 대 한 예가 표시 됩니다. 두 단백질의 오버레이 (4 행) 차동의 분포를 보여줍니다 발동기 (빨간색) 마커 단백질 synaptophysin (녹색)에 비...

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토론

메서드는 알려진된 분포와 마커 단백질의 풍부에 상대적인 관심사의 단백질의 분포를 측정 하는 겨냥 여기 제시. 면역 형광 염색 얼룩 다른 조각 사이 농도의 높은 다양성을 표시할 수 있습니다. 정량화 방법은 여기에 설명 된 북반구 전체 평균에 관심사의 단백질의 비율을 결정 하 여이 문제를 circumvents. 따라서, 분할 영역에 걸쳐 서로 다른 착 색 농도가 밖으로 취소 하 고 정량에 대 한 허용.

모든 면역 형광 검사 프로토콜에서와 마찬가지로 질적 또는 양적, 여러 가지 요인 성공에 영향를 분석 함으로써 혼동 됩니다. 따라서, 프로토콜의 중요 한 단계에 특별 한 주의 지불 합니다. 첫째, 조직의 적절 한 고정이 필요 합니다. 이 고정 일반적으로 성공적인 transcardial 관류에 의해 얻을 수 있습니다. 관류의 품질은 혈액에 밖으로 세척 후 간을 확인 하 여 확인할 수 있습니다. 성공적인 관류에 대 한 첫 번째 지표는28간 및 사지...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 우수한 기술 지원 Irmgard와 이즈를 감사합니다. 저자는 헤르메스 Pofantis / Andoniya Petkova 지원을 인정합니다. 저자는 또한 유럽 신경 과학 연구소의 LSM800 및 기술 지원, 특히 박사 Nils Halbsgut에 의해 사용에 대 한 감사합니다. 이 작품은 대학 의료 센터 괴팅겐에 의해 투자 되었다. JSV 인정 나노 현미경과 분자 생리학의 두뇌 (CNMPB)를 위한 센터에 의해 지원 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 반응 튜브Eppendorf30120094
50 mL 반응 튜브Greiner Bio-One227261
멀티웰 24 웰Fisher Scientific                                                                                                                                                                                              087721H
플라스틱 피펫 (일회용)Sarstedt861,176
1000 mL 피펫Rainin 
2 ml 피펫Eppendorf3123000012
Vortex Genius 3 IKA3340001
Menzel 현미경 슬라이드Fisher Scientific                                                                                                                                                                                  10144633CF
스테레오스코프Leica
LSM800Zeiss컨포칼 현미경
동결 마이크로톰Leica
PBS (10X)Roche                                                                                                                                                                           
PFA시그마                                                                                                                                                                                      P6148-1kg
NaClBioFroxx1394KG001
자당neoFroxx1104KG001
Tissue TekSakura 4583OCT
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
NaH2PO4Merck1,063,460,500
일반 염소 혈청Merck MilliporeS26-100ML
일반 당나귀 혈청MerckS30-100ML
Triton X-100Merck1,086,031,000
토끼 안티 무버시냅스 시스템RRID: AB_10804285
기니피그 항 시냅토피시냅스 시스템RRID: AB_1210382
당나귀 항 토끼 AF647잭슨 면역연구RRID: AB_2492288
염소 항 마우스 AF488잭슨 면역연구RRID: AB_2337438
Mowiol4-88Calbiochem                                                                                                                                                                                                   
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1701438211666789001신 475904, , ,

참고문헌

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