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방법 논문

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

10K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58942

⸱

2019년 3월 5일

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, Yale School of Medicine

이 논문에서

요약

여기, 우리는 3 개의 생체 외 분석 실험을 사용 하 여 인간의 trophoblast 셀에 셀 운동 평가 위한 매우 액세스할 수 있는 프로토콜 제시: 스크래치 분석 결과, transwell 침략 분석 결과 및 세포 확산 분석 실험.

초록

셀 운동은 placental 개발 및 임신 초기 동안 trophoblasts의 중요 한 속성 이다. 적절 한 trophoblast 마이그레이션 및 침략의 중요성 모성 맥 관 구조의 부적당 한 trophoblast 침공과 관련 된 사전 eclampsia 및 자궁내 성장 제한 같은 임신 장애에 의해 증명 됩니다. 불행히도, 메커니즘의 우리의 이해는 태에서 마이그레이션 개발 trophoblasts 제한 됩니다. 스크래치 분석 결과 통해 셀 이동의 생체 외 분석 trophoblast 철새 용량을 조절 하는 요소 식별에 유용한 도구입니다. 그러나, 혼자이 분석 결과 변경 된 셀 이동에서 발생할 수 있는 세포 변화를 정의 하지 않습니다. 이 프로토콜 설명 trophoblast 셀 운동 평가를 공동으로 사용 되는 세 가지 다른 생체 외 분석 실험: 스크래치 분석 결과, 침공 분석 결과 및 확산 분석 결과. 여기에 설명 된 프로토콜 계량 셀 운동 자극에 대 한 응답에서을 다른 셀 라인에 사용 하기 위해 수정할 수 있습니다. 이 메서드는 셀 운동에 기여 하 고 기본 셀 마이그레이션에 명백한 변경 잠재적인 메커니즘의 철저 한 검사를 제공 하는 개별 요소 식별에 조사 수 있습니다.

서론

Placental 발달은 임신, 산 모와 태아 모두 건강에 영향을 미치는의 설립에 중요 한 단계 이다. 그러나, 기계적으로이 프로세스는 발생 합니다 완전히 이해 하지는. 셀 마이그레이션 임신 중의 태 반 기능과 설립에 기여 하는 중요 한 생물 학적 과정 이다. Blastocyst 주입, 다음은 trophectoderm villous trophoblasts 융 villi의 표면을 커버 하 고 가스 및 영양소 교환에 관련 된, 그리고는 villi에서 마이그레이션할 extravillous trophoblasts (EVTs)으로 차별화 그리고 침략 모성 decidua 및 맥 관 구조1. EVTs의 마이그레이션 모성 나선형 동맥을 개장 하 고 태아 성장2를 지 원하는 uteroplacental 순환 설정에 대 한 필수적입니다. 임신 중 부족 trophoblast 침공 비정상적인 태 반 개발 결과 자간 전 증, 임 신성 고혈압, 자 궁 내 성장 제한, 조산3, 등 임신 합병증에 기여할 수 있습니다. 4. 따라서, trophoblast 운동에 영향을 주는 요소를 이해 정상적인 placentation에 필요한 경로 결정 하는 것이 필수적입니다.

Trophoblast 마이그레이션 신호 분자, 성장 인자, cytokines, 호르몬, 신생 요인5등의 복잡 한 네트워크에 의해 제어 됩니다. Vivo에서 태 반 연구의 제한으로 인해 활용 생체 외 분석 실험 불후 인간의 trophoblast 셀 라인 trophoblast 운동에 기여 하는 요소를 식별 하는 중요 한 되었습니다. 스크래치 및 침입 분석 양적 trophoblast 셀 마이그레이션6,,78에 개별 분자의 역할을 평가 하기 위해 광범위 하 게 사용 되었습니다. 그러나, 어떻게 변화 마이그레이션에 의해 발생할 수 있습니다 변경 셀 침입에 조사에 유용한,이 두 개의 분석 셀 마이그레이션 변경 된 요금에 기여할 수 있는 추가적인 메커니즘에 대 한 계정을 하지 않습니다. 예를 들어 마이그레이션할 수 적은 세포 세포 확산의 속도를 감소 발생할 수 있습니다.

여기, trophoblast 마이그레이션 스크래치, 세포 증식, 세포 침입 분석 실험을 사용 하 여 평가 하기 위한 정량 생체 외에서 방법을 설명 합니다. 스크래치 분석 결과에서 균일 한 상처 셀 단층에서 만들어지고 격차를 채우기 위해 셀의 마이그레이션 자동화, 시간 경과 상처 크기의 영상과 상처 내의 세포의 조밀도 의해 측정 된다. 셀 확산 분석 결과 셀의 알려진된 시작 수량에 비해 각 시간 지점에서 세포의 비율을 계산 기준으로 합니다. 셀 침공 분석 결과, 세포는 세포 외 매트릭스 코팅 셀 문화 삽입 챔버 (예: Transwell), 위에 시드 그리고 항 암 치료-유인에 기질을 통해 침입 하는 셀의 수 계산 됩니다.

스크래치 분석 결과 어떻게 다른 환경 조건을 결정 하는 데 사용할 수 있는 간단 하 고 효과적인 도구 셀 마이그레이션에 영향을 미칠 것 이다. 침공과 확산 분석 실험 이후에 세포 확산과 침입 셀 마이그레이션에 전반적인 변화에의 기여를 확인 하려면 사용할 수 있습니다. 샨 다, 이러한 분석 셀 운동에 기여할 수 있는 생물 학적 프로세스의 강력한 측정을 제공 합니다. 2 개의 불멸 하 게 첫 임신 trophoblast 셀 라인 HTR-8/SVneo9,10, Swan.71 (Sw.71) 기술된 분석에서 사용 되었다. 그러나, 이러한 분석 셀 이동과 침략의 주요 변조기를 식별 하기 위해 다른 셀 형식에 사용 하기 위해 최적화 또한 수 있습니다.

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프로토콜

1. 세포 준비

  1. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도에서 표준 성장 미디어 T-75 플라스 크에 세포를 유지 합니다.
    참고: 이 실험에 사용 된 세포는 불멸 하 게 했다 처음 임신 trophoblast 셀 라인 Swan.71 (Sw.71) 및 HTR-8/SVneo9,10. Sw.71 셀 DMEM/F-12와 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1.0 m m 나트륨 pyruvate, 10 mM HEPES, 0.10 m m MEM 비필수 아미노산, 100 단위/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 보충에 유지 되었다. HTR-8/SVneo 셀 RPMI-1640 년 5%로 보충 유지 되었다 열 비활성화 FBS.
  2. 90-100%의 합류를 도달할 때까지 복제를 셀 수 있습니다. 메 마른 조직 문화 흐름 후드를 사용 하 여 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x의 10 mL로 플라스 크 및 세척 세포에서 미디어 발음.
  3. PBS를 발음 하 고 1x (0.05%)의 5 mL을 추가 트립 신-EDTA 셀 트립 신에 의해 보호 됩니다 확인 하 고 플라스 크에. 모든 세포는 플라스 크 (약 5-10 분)의 하단에서 분리 될 때까지 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도 유지 실험실 인큐베이터에 플라스 크를 배치 합니다.
  4. 트립 신-EDTA를 비활성화 하려면 플라스 크를 미리 데워 진된 성장 매체의 10 mL를 추가 합니다.

2. 스크래치 시험

  1. 다음 단계 1.4, 씨 48 h 합류 점 100%를 달성 하는 24-잘 접시로 셀의 적절 한 수 있습니다.
    참고: 그것은 다양 한 다른 접시 레이아웃 스크래치 시험을 수행할 수입니다. 웰 스 상처 메이커 도구에 의해 허용의 최대 수는 96-잘 형식입니다.
  2. 다음날 (전날 스크래치 분석 결과), 페 놀 레드 무료 미디어를 필요에 따라 보충 열 비활성화, 숯불 dextran 박탈 FBS를 포함 하 여 미디어를 변경 합니다.
    참고: 다른 연구는 낮은 농도 FBS (예를 들어, 1%)와 미디어를 사용 하 여를 추천 했습니다. 하이 프로토콜11에 안으로 사용 될 수 있는 세포 증식을 최소화 합니다.
  3. 스크래치 시험 당일 각 우물에서 미디어를 원하는 치료를 추가 하 여 30 분에 대 한 셀을 pretreat. 개요 실험 차량 (1 x PBS) 및 1 x PBS에 희석 100 nM dexamethasone 활용.
  4. 균일 한 상처를 만들 상처 메이커 도구의 핀에 살 균 10 µ L 피 펫 팁을 배치 합니다. 웰 스의 첫 번째 행에는 팁 낮은 고 피 펫 팁 우물의 반대편에 도달 될 때까지 상처 메이커의 트랙을 따라 격판덮개를 이동 합니다.
    1. 우물의 직경에 걸쳐 상처 상수를 보장 하기 위해 접시의 바닥을 터치 지속적으로 피 펫 팁을 수 있도록 시작 위치로 다시 접시를 이동 합니다. 제거 및 살 균 10 µ L 피 펫 팁을 교체 하 고 우물의 다음 행에는 팁 낮은.
  5. 2.4 단계를 반복 하 여 모든 우물 긁힌.
    참고: 상처 메이커 도구를 사용할 수 없는 경우 수동으로 10 µ L 피 펫 팁 우물의 센터를 된다고 하 여 상처를 만들 수 있습니다.
  6. 미디어를 신중 하 게 발음 하 고 부드럽게 씻어 1 x PBS로 두 번 셀. 최종 세척 후 보충된 페 놀 레드 무료, 박탈 또는 원하는 치료 또는 차량 (으로 단계 2.3에서에서 지시 되는) 낮은 FBS 미디어를 추가 합니다.
    참고: HTR-8/SVneo 세포로 분리 하려면 셀 1 x PBS로 세척 하면 보충 페 놀 레드 미디어, 세척 되어야 한다.
  7. 시간 경과 영상 ( 재료의 표참조) 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도 유지 실험실 인큐베이터에 보관 되어, 포함 하는 자동화에 긁힌된 웰 스 24-잘 접시를 놓습니다. 상처 치유 (예를 들어, 모든 2 h 72 h에 대 한) 완료를 셀 수 있도록 필요에 따라 일정 한 간격의 이미지 우물
  8. 자동, 시간 경과 영상와 관련 된 소프트웨어에 의해 상처 밀도 너비를 계산 ( 재료의 표참조). 시작 상처의 크기에 비해 상처 크기의 백분율 변화를 계산 하려면 설정 상처 폭 시간 0에서 100%. 시간 0에 상처 크기에 의해 각 후속 timepoint에 상처 크기를 분할 하 고 백분율 (그림 1)를 100을 곱하십시오.

3. 침입 분석 결과

  1. 다음 단계 1.4, 시드 유지 셀 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도 설정 실험실 인큐베이터에 48 h. 합류 점 90%에 도달 하는 셀 수 있도록 6 잘 플레이트에 셀의 적절 한 수.
  2. 다음 날, 페 놀 레드 무료 미디어를 필요에 따라 보충 열 비활성화, 숯불 dextran 박탈 FBS를 포함 하 여 미디어를 변경 합니다.
    참고: 세포 실험 설계에 따라이 이번에 pretreated 될 수 있습니다.
  3. 이 시점에서 장소 10 mg/mL 세포 외 매트릭스의 유리병 ( 재료의 표참조)에 얼음 하 고 하룻밤 냉장고에서 해 동.
  4. 다음 날, 24-잘 접시를 배치 하 여 미리 멋진 침공 분석 결과 제공, 세포 배양, microcentrifuge 튜브, 그리고 피 펫 팁에에서 삽입 세포 외 매트릭스를 사용 하기 전에 적어도 2 시간 동안 냉장고 (4 ° C).
  5. 조직 문화 후드에 냉장된 장치를 사용 하 여, 10 mg/mL 기질 5 mg/mL의 최종 농도에 페 놀 레드 무료, 혈 청 무료 미디어와 1:1 희석.
    참고: 항상 주식 및 얼음에 희석된 기질 유지. 미디어 세포 외 매트릭스의 비율 분석 결과에 사용 되는 셀 라인의 속성에 따라 조정할 수 있습니다.
  6. 조직 문화 후드에 냉장된 장치를 사용 하 여, 24-잘 접시에 배치 된 삽입 ( 재료의 표참조)를 희석된 세포 외 매트릭스의 100 μ를 추가 합니다. 매트릭스는 어떤 거품 없이 다는 것을 확인 하십시오. 장소 매트릭스 코팅 24-잘 접시를 포함 하는 매트릭스를 확정할 수 있도록 37 ° c 배양 기에 삽입 합니다.
  7. 침공 분석 결과 대 한 셀을 준비 하 1 x PBS의 1 mL로 세포 세척, PBS, 발음 하 고 추가 1 x 트립 신-EDTA의 500 µ L 각 잘. 모든 세포는 접시의 바닥에서 분리 될 때까지 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도 유지 실험실 인큐베이터에 6-잘 접시를 놓습니다.
  8. 셀을 분리 했으면 일단 trypsinized 셀의 각 음에 페 놀 레드 무료, 혈 청 무료 미디어의 500 µ L를 추가 합니다.
  9. Microcentrifuge 튜브 및 4 ° c.에 400 x g 에 5 분 동안 다운 스핀 분리 된 세포의 1000 µ L를 전송
  10. 미디어를 발음 하 고 페 놀 레드 무료, 혈 청 무료 미디어에서 셀 resuspend (볼륨은 세포의 농도에 따라 달라 집니다). 자동화 된 셀을 사용 하 여 계산 셀 ( 재료의 표참조) 카운터 고 mL 당 5 x 105 셀의 최종 농도 대 한 셀 서 스 펜 션의 볼륨 조절.
    참고: Hemocytometer 및 현미경 셀도 사용할 수 있습니다.
  11. 침공 분석 결과 대 한 사용 될 24-잘 접시의 우물에 완전 한 성장 매체의 600 μ를 추가 합니다.
    참고: 추가 chemoattractants 또는 치료 잘 (더 낮은 약 실)에 완전 한 성장 매체에 추가할 수 있습니다. 개요 실험 차량 (1 x PBS) 또는 더 낮은 약 실에 1 x PBS에 희석 100 nM dexamethasone 추가.
  12. 장소 미리 코팅된 침공 분석 결과 대 한 사용 될 완전 한 성장 매체를 포함 하는 각 음에 삽입 합니다. 200 μ 1 x 105 셀의 총에 대 한 각 미리 코팅된 셀 삽입 (상단 챔버) 위에 셀을 추가 합니다.
    참고: 이 분석 결과 대 한 부정적인 컨트롤로, 상부 챔버에 (셀) 없이 페 놀 레드 무료, 혈 청 무료 미디어의 동일한 볼륨을 추가할 수 있습니다.
  13. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 24 h에 대 한 95% 습도 유지 실험실 인큐베이터에서 24-잘 접시를 놓습니다.
    참고: 24 시간 잠복기는 불멸 하 게 첫 임신 trophoblast 셀 최적화 되어 있으며 추가 테스트 해야 할 수 있습니다 다른 셀 라인에서 필요한 잠복기를 결정.
  14. 야간 보육, 다음 세포 외 매트릭스를 방해 하지 않고 위와 더 낮은 약 실에서 나머지 미디어를 흡입. 다음, 조심 스럽게 제거 기질 및 비-침략 세포 기질을 제거 하는 데 필요한 횟수 만큼 보라고 면봉으로 삽입의 상단 부분에서.
  15. 워시 각 3 x 1 x PBS, 우물의 위쪽과 아래쪽 챔버에 PBS를 추가 삽입. 각 세척 후 PBS를 발음.
  16. 4 ° c.에 30 분 동안 100% 얼음 메탄올에 삽입을 배치 하 여 삽입에 연결 된 셀을 수정 최종 세척 후 세척 PBS와 제거 PBS x 1 3 x를 삽입 합니다. 20% 에탄올에 0.2% 크리스탈 바이올렛과 10 분 동안 삽입에 연결 된 셀을 얼룩.
  17. 이온을 제거 된 물으로 배를 씻어 하 고 최종 세척 후 이온된 수를 발음.
  18. 실 온에서 1 h 공기 건조를 삽입 합니다. 집게와 면도날 사용 하, 주의 깊게 잘라 삽입의 하단 막 하 고 하단 면이 유리 슬라이드에 탑재. 설치 미디어 실 온에서 건조를 허용 합니다.
  19. 20 x 목표는 가벼운 현미경을 사용 하 여 샘플 당 침공된 셀의 적어도 4 독특한 이미지를 얻을. 각 이미지에는 셀의 총 수를 계산 하 고 샘플을 제어 하 고 데이터 (그림 2)는 셀의 수를 정상화.

4. 확산 분석 결과

  1. 다음 단계 1.4, 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 플라스 크에서 trypsinized 셀 및 씨앗으로 잘 표준 성장 매체에 당 2 × 105 셀의 밀도에서 6 잘 플레이트.
  2. 37 ° C, 5% CO2및 4 h 또는 셀은 준수까지 95% 습도 유지 실험실 인큐베이터에 셀을 배치 합니다.
  3. 페 놀 레드를 변경 미디어 무료 미디어 열 비활성화, 숯불 dextran 박탈 FBS를 포함 하 여 필요에 따라 보충 하 고 원하는 치료를 추가 합니다. 개요 실험 추가 차량 (1 x PBS) 또는 100 nM dexamethasone 1 x PBS에 희석. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도 유지 실험실 인큐베이터에 6-잘 접시를 놓습니다.
  4. 미디어를 제거 하 고 새로운 미디어와 치료 모든 48 h을 바꿉니다.
  5. 24, 48 또는 72 h 치료, 후 1 x PBS의 1 mL로 세포 세척 하 고 각 우물에 트립 신-EDTA의 500 µ L를 추가 합니다. 인큐베이터에 두고 6 잘 플레이트 세포 격판덮개에서 분리 했으면 때까지.
  6. 세포는 접시에서 분리 된, 일단 trypsin 비활성화 보충된 페 놀 레드 무료 미디어의 500 µ L를 추가 합니다.
  7. 별도 튜브에서 Trypan 파랑의 5 µ L을 trypsinized 셀의 5 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 혼합.
  8. 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 중복에서 각 우물에서 셀을 계산 합니다.
  9. (그림 3) 시간의 기능으로 각 시간 포인트와 플롯에 잘 당 셀의 수를 평균.

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결과

불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 trophoblast 셀 라인 Sw.71 및 HTR-8/SVneo trophoblast 셀 마이그레이션12스테로이드 제제의 역할을 결정 하기 위해이 실험에 사용 되었다. 그들은 최근에 보였다 trophoblast 기능 변경 대체 치료 사용된12수 있지만 스테로이드 제제가이 실험에 사용 했다. 두 셀 라인 차량 (1 x PBS) 또는 100로 치료 했다 모든 실험에 대 한 합성 glucocorticoid dexamethasone (덱 스)의 nM. 상처 밀도 크기는 자동화 된, 시간 경과 이미징 시스템을 사용 하 여 72 h에 대 한 모든 2 h를 측정 했다. 그림 1 에 이미지와 다른 timepoints에서 스크래치 분석 결과에서 얻은 결과의 예가 나와 있습니다. 두 치료에 대 한 0, 8, 및 18...

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토론

이 절차는 마이그레이션 및 침략의 사용 trophoblast 셀 운동 측정된 차이에 잠재적인 참가자로 셀 확산의 속도 포함 분석 실험 바탕. 함께 사용이 생체 외 분석 실험은 trophoblast 마이그레이션 조절 세포 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있는 간단 하 고 효과적인 방법입니다. 위에서 설명한 대로 호르몬, cytokines, 성장 인자, 또는 다른 분자 trophoblast 운동에 미치는 영향을 확인 하려면 trophoblast 세포를 치료할 수 있습니다. 또는 대상 단백질 trophoblast 운동에 그들의 기능적인 역할을 명료 하 게 하는 세포에서 고갈 될 수 있습니다. Trophoblast 마이그레이션 키 변조기를 식별 하는 것은 임신의 기본 합병증 placental 결함, 자간 전 증, 조산, 자궁내 성장 금지 등와 관련 된 기본 메커니즘의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다.

정확한 결과 얻을 하는 데 필요한이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자 박사 길 Mor Sw.71 세포를 제공 감사 합니다. 이 연구는 남서에 앨버트 McKern 학자 포상에 의해 지원 되었다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.4% 트리판 블루 염색Thermo Fisher Scientific15250-061
0.5% 트립신-EDTALife Technologies15400-054
1.0 M HEPESAmericanBioAB06021-00100
10 mM MEM 비필수 아미노산Life Technologies11140-050
100 mM 피루브산 나트륨Life Technologies11360-070
24웰 플레이트 트랜스웰 인서트Corning34228 &mu의 폴리카보네이트 필터가 포함되어 있습니다. m 기공 크기
숯 덱스트란 박리 FBSGemini Bio-Products100-119
Countess II 자동 세포 계수기Thermo Fisher ScientificAMQAX1000
크리스탈 바이올렛시그마 AldrichC0775
Cytoseal 60Thermo Fisher Scientific8310-4
덱사메타손(Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥ 98% TLC)스테랄로이드P0500-000
DMEM/햄' s F12Life Technologies11330-032
소 태아 혈청시그마 AldrichF2442
IncuCyte 24웰 ImageLock 플레이트Essen BioScience4365IncuCyte Zoom 이미징 시스템을 사용하는 경우 세포를 IncuCyte ImageLock 플레이트에 시드합니다. 이 플레이트는 플레이트 바닥에 표준 마커가 있어 일정한 시야에서 반복 이미징을 위한 참조로 사용됩니다.
IncuCyte 소프트웨어Essen BioScience2010A Rev2
IncuCyte ZOOM 시스템, Essen BioScienceN/A스크래치 분석 이미지는 사전 설정 "를 사용하여 캡처 및 분석되었습니다. 긁힌 상처" IncuCyte ZOOM 시스템의 매개변수. 다른 타임 랩스 현미경도 사용할 수 있습니다.
Matrigel Membrane MatrixBecton Dickinson356231성장 인자 감소, 페놀-레드 프리
Micro SlidesVWR International, LLC48311-7003
현미경 커버 유리Fisher Scientific12-545-E
Olympus IX71 도립 현미경OlympusIX71
페니실린(10,000 units/mL)/스트렙토마이신(10,000 &마이크로; g/mL)Life Technologies151-40-122
페놀-레드 프리 DMEM/Ham's F12Life Technologies11039-021
반자동 상처 메이커 도구Essen BioScienceN/A
에는 , ,

참고문헌

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  14. Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).

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