방법 논문

마이크로어레이를 사용하여 암 세포 표현형에 대한 미세 환경적 영향을 심문

DOI:

10.3791/58957

⸱

2019년 5월 21일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 2Quantitative Imaging Systems LLC

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 방법의 목적은 미세 환경 마이크로어레이(MEMA)가 배양된 세포의 표현형에 대한 수천 개의 간단한 조합 미세 환경의 영향을 심문하기 위해 제조되고 사용될 수 있는 방법을 보여주는 것입니다.

초록

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미세 환경이 세포의 표현형에 미치는 영향을 이해하는 것은 생체 내 미세 환경에서 수용성 성장 인자와 매트릭스 관련 단백질의 복잡한 혼합물로 인해 어려운 문제입니다. 또한, 시험관 내 미세 환경의 모델링을 위해 쉽게 사용할 수 있는 시약은 일반적으로 불완전하게 정의되고 배치 가변성으로 고통받는 단백질의 복잡한 혼합물을 이용합니다. 미세 환경 마이크로어레이(MEMA) 플랫폼은 단일 분석에서 세포 표현형에 미치는 영향에 대해 수천 가지의 미세 환경 단백질 조합을 평가할 수 있습니다. MEMA는 배열된 세포외 매트릭스(ECM) 단백질을 포함하는 우물을 분리하기 위해 개별 리간드를 첨가할 수 있는 웰 플레이트에 제조됩니다. 각 인쇄 된 ECM과 수용성 리간드의 조합은 독특한 조합을 형성한다. 전형적인 MEMA 분석은 세포가 단 하나 분석에서 드러내는 2,500의 유일한 조합 마이크로환경을 포함합니다. 시험 사례로서, 유방암 세포주 MCF7은 MEMA 플랫폼에서 도금되었다. 이 분석법의 분석은 이 세포의 성장 그리고 증식을 강화하고 억제하는 둘 다 인자를 확인했습니다. MEMA 플랫폼은 매우 유연하며 암 연구 를 넘어 다른 생물학적 질문과 함께 사용하기 위해 확장 될 수 있습니다.

서론

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2차원(2D) 단층에서 플라스틱에 암 세포주를 배양하는 것은 암 연구자들의 주요 주력 중 하나입니다. 그러나, 미세 환경은 점점 세포 표현형에 영향을 미치는 그것의 기능에 대 한 인식 되 고. 암에서, 종양 미세환경은 성장, 생존, 침습 및치료요법에대한 반응 1,2를포함하는 다중 세포 행동에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 전통적인 단층 세포 배양은 전형적으로 미세 환경 영향이 결여되어, 이는 시판되는 정제된 지하 막 추출물을 포함하여 세포를 성장시키기 위해 보다 복잡한 3차원(3D) 어설법의 발달을 주도하고 있다. 그러나, 이러한 정제된 행렬은 전형적으로 사용하기가 복잡하고 배치 가변성3 및 복잡한 조성물3과같은 기술적 문제로 고통받고 있다. 그 결과, 세포 표현형 3에 영향을 미칠 수 있는 특정 단백질에기능을 할당하는 것은 어려울 수 있습니다.

이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 세포 외 매트릭스 (ECM) 및 수용성 성장 인자 단백질4,

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프로토콜

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참고: 예상 시간을 포함하여 전체 MEMA 프로세스의 개요는 그림1에 표시된 흐름 다이어그램에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 8웰 플레이트에서 MEMA의 제작에 대해 자세히 설명합니다. 프로토콜은 다른 플레이트 또는 슬라이드에 적용될 수 있다.

1. 단백질, 희석제 및 염색 완충제의 준비

  1. EPM, 리간드 및 사이토카인의 바이알을 실온(RT)에 평형화하고 잠시 원심분리기를 사용합니다. 제품 데이터 시트에 표시된 대로 적절한 RT 버퍼의 적절한 볼륨을 추가합니다. 재고 농도에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오.
    참고: 리간드 및 EPM의 전체 목록과 재고 및 최종 농도가 표 1 및 표2에 제공됩니다. 리간드와 EPM은 일반적으로 표준 2일 배양 어설슬에서 생물학적 효과를 유도하는 제조업체가 권장하는 범위의 가장 높은 농도로 사용됩니다. 오염을 방지하기 위해 라미나 흐름 아래의 생체 안전 캐비닛에서 단백질을 부드럽게 처리하십시오.
  2. 1 시간 동안 RT에서 부드러운 흔들림으로 바이알을 배양하십시오. 이 변성 그들을 일으킬 수 있습....

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결과

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세포 성장 및 증식에 대한 미세 환경적 영향을 단순화하고 세포 성장 및 증식을 촉진 또는 억제하는 조건을 식별하기 위해, 유방암 세포주 MCF7은 프로토콜에 기재된 바와 같이 8개의 8-well MEMA 세트에 시드되었다. 이 분석은 총 2736개의 조합 미세 환경 조건에 대해 48개의 상이한 EPM 및 57개의 다른 리간드에 세포를 노출하였다. 배양 에서 71 시간 후, 세포는 EdU, 고정, 투과 및 DAPI로 염색, EdU 검출에 대한 반응, 항-피브릴린 항체 및 항 H3K9me3 항체로 펄스하였다. 세포는 고함량 현미경으로 영상화하였다. 이미지는 오메로 서버10에업로드되었고, 셀프로파일러8을 사용하여 분할되었으며 R9에서정규화 및 분석되었습니다. 아래에 설명된 결과는 DAPI 및 EdU 신호에 중점을 둡니다.

MEMA의 이미지 분석 플랫폼은 DA.......

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토론

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"차원성"과 맥락의 중요성은 미세 환경(11)과의상호 작용을 통해 암세포의 특성화에 도구로서 시험관 내 배양 시스템의 개발에 동기 부여 요인이되었습니다 11, 및 생체 외에서의 능력 생체 내 환경을 모방하는 문화 시스템은 이러한 문화 시스템을 개선하기 위한 탐구의 원동력입니다. 그러나 체외 시스템은 복잡한 생체 내 상황을 단순화된 모델12로증류하는 능력 때문에 암 연구의 중요한 도구로 남아 있다.

2D 시스템에는 EPM과 리간드가 포함될 수 있지만, 전통적으로 광범위한 조합 관문 패널을 심문할 수 있는 처리능력이 부족했습니다. 인기있는 상업용 지하 막 추출물은 3D로 배양할 수 있지만 신중하게 정의된 단백질 패널의 출처가 부족합니다. 상업적 추출물은 전형적으로 불완전하게 정의된 조성물로 고통받아 분석을 혼동하고 상당한배치 대 배치 변동 3,

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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이 작품은 네트워크 셀룰러 서명 (LINCS) 보조금 HG008100 (J.W.G., L.M.H., 및 J.E.K)의 NIH 공통 기금 라이브러리에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Aushon 2470Aushon BioSystemsArrayer 로봇 시스템
Nikon HCA,NikonHigh Content Imaging 시스템, Nikon Eclipse Ti 도립 현미경
BioTek Precision XS 액체 핸들러프로토콜에 사용되는BioTek
Trizma 염산염 완충 용액SigmaT2069
EDTAInvitrogen15575-038
글리세롤SigmaG5516
Triton X100SigmaT9284
Tween 20SigmaP7949
Kolliphor P338BASF50424591
384-well microarray plate, cylindrical wellThermo Fisherab1055
Nunc 8 우물 접시Thermo Fisher267062
파라포름알데히드 16% 용액전자 현미경 과학15710
BSAFisherBP-1600
아지드화 나트륨시그마S2002
셀 마스크분자 프로브H32713
Click-iTEdU Alexa FluorMolecular ProbesC10357
DAPI프로모션 KinePK-CA70740043
ALCAMR & D 체계656-ALECM
Cadherin-20 (CDH20)R & D 시스템5604-CAECM
Cadherin-6 (CDH6)R & D 시스템2715-CAECM
Cadherin-8 (CDH8)R & D 체계188-C8ECM
CD44연구 및 ; D 시스템3660-CDECM
CEACAM6R & D Systems3934-CMECM
콜라겐 ICultrex3442-050-01ECM
콜라겐 유형II MilliporeCC052ECM
콜라겐 유형 IIIMilliporeCC054ECM
콜라겐 유형 IV시그마C5533ECM
콜라겐 유형 VMilliporeCC077ECM
COL23A1R & D 체계4165-CLECM
Desmoglein 2연구 & D 체계947-DMECM
E cadherin (CDH1)R & D 시스템648-ECECM
ECM1R & D 시스템3937-ECECM
피브로넥틴R & D 시스템1918-FNECM
GAP43Abcamab114188ECM
HyA-500KR & D 시스템GLR002ECM
HyA-50KR & D 시스템GLR001ECM
ICAM-1R & D 체계720-ICECM
라미닌시그마L6274ECM
Laminin-5Abcamab42326ECM
LumicanR & D 시스템2846-LUECM
M-Cad (CDH15)R & D 시스템4096-MCECM
Nidogen-1R & D 시스템2570-NDECM
오스테오아데린/OSADR & D 시스템2884-ADECM
오스테오폰틴(SPP)R & D 체계1433-OPECM
P-Cadherin (CDH3)R & D 시스템861-PCECM
PECAM1R & D 시스템ADP6ECM
Tenascin CR & D 시스템3358-TCECM
VCAM1R & D 시스템ADP5ECM
비트로넥틴R & D 시스템2308-VNECM
BiglycanR & D 시스템2667-CMECM
데코린R & D 시스템143-DEECM
페리오스틴R & D 체계3548-F2ECM
SPARC/osteonectin연구 & D 시스템941-SPECM
트롬보스폰딘-1/2R & D 시스템3074-THECM
브레비칸R & D Systems4009-BCECM
엘라스틴BioMatrix5052ECM
피브릴린린 사카이 랩 OHSUN/AECM
ANGPT2RnD_Systems_Own623-AN-025리간드
IL1BRnD_Systems_Own201-LB-005리간드
CXCL8RnD_Systems_Own208-IL-010리간드
IGF1RnD_Systems_Own291-G1-200리간
TNFRSF11BRnD_Systems_Own185-OS리간드
BMP6RnD_Systems_Own 507-BP-020리간드
FLT3LGRnD_Systems_Own308-FK-005리간드
CXCL1RnD_Systems_Own275-GR-010리간드
DLL4RnD_Systems_Own 1506-D4-050리간드
HGFRnD_Systems_Own294-HGN-005리간드
Wnt5aRnD_Systems_Own645-WN-010리간
CTGFLife_Technologies_OwnPHG0286리간드
LEPRnD_Systems_Own398-LP-01M리간드
FGF2Sigma_Aldrich_OwnSRP4037-50UG리간드
FGF6RnD_Systems_Own238-F6리간드
IL7RnD_Systems_Own207-IL-005리간드
TGFB1RnD_Systems_Own246-LP-025리간드
PDGFBRnD_Systems_Own220-BB-010리간드
WNT10AGenemed_Own90009리간드
PTNRnD_Systems_Own252-PL-050리간드
BMP3RnD_Systems_Own113-BP-100리간드
BMP4RnD_Systems_Own314-BP-010리간드
TNFSF11RnD_Systems_Own 390-TN-010리간드
CSF2RnD_Systems_Own215-GM-010리간드
BMP5RnD_Systems_Own615-BMC-020리간드
DLL1RnD_Systems_Own1818-DL-050리간드
NRG1RnD_Systems_Own296-HR-050리간드
KNG1RnD_Systems_Own1569-PI-010리간드
GPNMBRnD_Systems_Own2550-AC-050리간드
CXCL12RnD_Systems_Own350-NS-010리간드
IL15RnD_Systems_Own247-ILB-005리간드
TNFRnD_ Systems_Own210-TA-020리간
IGFBP3RnD_Systems_Own675-B3-025리간드
WNT3ARnD_Systems_Own 5036-WNP-010리간드
PDGFABRnD_Systems_Own222-AB리간드
AREGRnD_Systems_Own262-AR-100리간드
JAG1RnD_Systems_Own1277-JG-050리간드
BMP7RnD_Systems_Own354-BP-010리간드
TGFB2RnD_Systems_Own 302-B2-010리간드
VEGFARnD_Systems_Own293-VE-010리간드
IL6RnD_Systems_Own206-IL-010리간드
CXCL12RnD_Systems_Own351-FS-010리간드
NRG1RnD_Systems_Own378-SM리간드
IGFBP2RnD_Systems_Own674-B2-025리간드
SHHRnD_Systems_Own1314-SH-025리간드
FASLGRnD_Systems_Own126-FL-010리간드
프로토콜에 사용되는 , , , 액체 핸들러, 에 사용되는 로봇드 드 드

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  2. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Med....

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