여기, 우리가 생산 하는 효율적이 고 재현 가능한 전략, titer, 및 품질 관리 일괄 adeno 관련 바이러스 벡터의 설명 합니다. 그것은 높은 titer로 벡터 준비를 하면 (13 벡터 게놈/10ml x ≥1)와 고 순도, 생체 외에서 또는 vivo에서 사용에 대 한 준비.
방법 논문
생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Adeno 관련 바이러스 (AAVs)에 따라 유전자 전달 도구는 유전자 치료 응용 프로그램을 포함 하 여 중앙 신경 시스템 (CNS)에 transgenes의 배달에 대 한 인기 있는 선택입니다. AAV 벡터는 비 복제, 분열 및 비 분열 세포를 감염 하 고 장기 transgene 식을 제공할 수 있습니다. 중요 한 것은, 일부 serotypes, 새로 설명된 PHP 같은. B, 수는 혈액-뇌-장벽 (BBB) 동물 모델에서 교차 조직 배달 다음. AAV 벡터는 실험실에서 효율적으로 생산 수 있습니다. 그러나, 강력 하 고 재현할 수 프로토콜은 충분 한 레벨을 순도 및 생체 내에서 응용 프로그램에 대 한 충분히 높은 titer 값 AAV 벡터를 얻기 위해 필요 합니다. 이 프로토콜 AAV 벡터 생산, iodixanol 그라데이션 정화 전략에 따라 효율적이 고 재현 가능한 전략을 설명 합니다. Iodixanol 정화 방법 다른 정화 방법에 비해 높은 순도의 높은 titer AAV 벡터의 일괄 처리를 얻기 위해 적당 하다. 또한, 프로토콜은 일반적으로 현재 설명 하는 다른 방법 보다 빠릅니다. 또한, 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)-기반된 전략은 신속 하 고 정확한 결정 방법 얼룩은 벡터 titer의 벡터 일괄 처리의 순도 확인에 대 한 설명. 마지막으로, CNS, AAV-PHP의 체계적 관리를 다음에 유전자 배달의 대표적인 결과. B, 제공 됩니다. 이러한 결과이 문서에서 설명 하는 프로토콜을 사용 하 여 모든 실험실에서 가능 해야 합니다.
서론
지난 30 년 동안 야생-타입 AAVs 입증 CNS1,2,,34로 유전자 전송 위한 매우 유용한 도구, 재조합 형 AAV 벡터를 만드는 설계 되었습니다. 5,6 , 유전자 치료 접근 (를 포함 하 여 FDA 및 EMA 승인 요법) 질병4,7. CNS에 사용 하기 위해 그들의 적합성은 크게 비 나눈, 포스트 mitotic 세포 감염, CNS8에서 일반적으로 발견에 그들의 능력에서 파생 됩니다. 그러나, AAV 근거한 벡터는 또한 다른 바이러스 성 벡터7에 비해 온화한 면역 응답을 도출 하는 동안 어떤 주어진된 치료 transgene4,9 장기 표현의 허용의 이점이 있다 8,10,,1112.
어떤 AAV 벡터의 주요 요소는 게놈과는 capsid. 야생-타입 AAVs는 단일 가닥 (ss) 약 5 kilobases (kb)13의 게놈 DNA 바이러스. 재조합 형 AAV 벡터의 생산에 대 한 (게놈 복제 및 바이러스 성 capsid의 조립에 필요한) 담당자 와 모자 유전자는 강포한 유형 AAV 게놈에서 삭제 하 고 트랜스에위해 제공 된 식 카세트 transgene14,15를 포함 하. 원래 바이러스 성 게놈의 거꾸로 단말기 반복 시퀀스 (ITRs) 복제 및3,,1014포장을 위해 필수적으로 AAV 벡터에 유일한 유지 요소입니다. AAV 벡터는 transgene 식;을 향상 시키기 위해 설계 될 수 있다 하나는 ITRs의 돌연변이 효과적으로 보완 DNA 가닥3,,715의 생성을 허용 하는 머리 핀 루프의 형성에 지도 한다. 자체 보완 (sc) 게놈 불리는이 구성의 주요 장점은 AAVs transgene 식 의 수준과 속도 상당히 증가의 전통적인 라이프 사이클에 전형적인 2 가닥 합성에 대 한 필요를 무시 1. 그럼에도 불구 하 고, 약 2.4 kb 벡터의 화물 용량 감소 scAAV 게놈을 사용 하 여. 발기인 또는 예측에 관한 바인딩 사이트, 특정 세포 유형16식 제한 등 규제 어떤 순서 뿐만 아니라 transgene 시퀀스 포함 됩니다.
AAV capsid 벡터 호스트 세포 상호 작용을 결정 하 고 세포 유형 또는 조직 차 있는 굴곡 운동 transgene 식 특정 위치로 제한 하도 개발 될 수 있는 AAV serotype에 대 한 학위를 수 여. 반면 다른 재조합 방법 (즉, PHP 통해 실험실에서 생산 된 여러 AAV serotypes 자연에서 찾을 수 있습니다. B). 또한, 일부 capsids 또한 조직의 관리 후 transgenes는 CNS에 걸쳐 배달 결과 BBB를 교차 하는 기능 등 다른 유용한 특성을 수 여. 이 AAV9, 뿐만 아니라 최근 설명된 PHP에 대 한 표시 되었습니다. B capsid17. 결과적으로, 이러한 serotypes는 특히 신경 질환1,,1718에 대 한 새로운 유전자 치료 접근에 대 한 관련성이 증명 하 고 있다.
이 프로토콜의 목적은 높은 titer와 순도 AAV 벡터의 소규모 생산을 위한 비용 효율적인 방법을 설명입니다. 비록 결과 여기에 제시 된 PHP를 사용 합니다. B capsid 그리고 scAAV 식 카세트, 프로토콜은 여러 AAV 벡터 serotypes 및 게놈 구성, 최대 실험 유연성을 허용의 생산에 적합. 그러나, 벡터 수율과 최종 순도 선택한 serotype에 따라서 달라질 수 있습니다.
프로토콜 자체 생산 바이러스 성 벡터에 대 한 고전적인 트라이-transfection 방법의 변형 이며 벡터 정리는, 세 슘 염화 물 (CsCl) 그라디언트를 사용 하 여 클래식 비교에 대 한 iodixanol 그라디언트를 사용 하 여 통합 생산 시간 효율적인 방식으로19,20,21에서 높은 순도의 AAV 벡터에 보고.
Transfection, 정화 및 농도 단계 바이러스 성 벡터 작업에 대 한 평가 조직 배양 실험실에서 좋은 연구실 관행 (GLP)에 따라 수행을 위한 것입니다. 각 작업 바이러스 성 벡터 생산에 관한 관련 지역 및 국가의 법률에 따라 수행 하 여 사용 해야 합니다. 일 층 흐름 후드와 살 균 조건에서 밖으로 실행 되어야 한다. 벡터 시설 내 일반 조직 배양 실험실 코트 뿐만 아니라 랩 앞치마를 착용 하는 것이 좋습니다. 또한, 장갑, 플라스틱 overshoes의 두 배 쌍 항상 착용 되어야 한다.
모든 필요한 장비 확인 벡터 생산을 시작 하기 전에 플라스 미드를 사용할 수 있습니다. 1) pCapsid 플라스 미드 복제, 즉 Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40, 필요한 4 개의 비 구조 단백질을 인코딩합니다 rep 유전자와 3 구조 capsid 단백질, 즉 VP1, VP2, 및 VP3 인코딩합니다 모자 유전자 포함 되어 있습니다. 2) pHelper 플라스 미드 유전자를 E4, E2A, 및 버지니아 에서 아 데 노 바이러스, HEK293T 세포에서 AAV 생산을 용이 하 게 포함 되어 있습니다. 3) pTransgene 플라스 미드에는 두 ITRs에 의해 형벌 transgene 식 카세트를 포함 되어 있습니다. 이 플라스 미드는 시퀀스 사용 가능한 온라인22를 사용 하 여 실험실에서 합성된 드 노 보 될 수 있습니다. 플라스 드 노 보를 만든에 대 한 특히 그들 포함 하는 소설 transgenes 시퀀싱은 transgene 및 ITRs 올바른지 있는지 확인 하는 데 필요한. 또는, premade 플라스 미드 플라스 미드 온라인 저장소를 통해 직접 취득 될 수 있다. 필요한 경우, 플라스 미드 증폭 될 수 있다 하 고 제조업체의 지침23에 따라 표준 키트를 사용 하 여 정화.
벡터 titer 고 순도의 벡터 변환 능력을 저하 수 있습니다. 추가 프로토콜 생산된 벡터의 품질을 평가 하기 위해 제공 됩니다. 마지막 벡터의 생체 외에서 그리고 vivo에서 응용 프로그램에 CNS 세포 기능 연구에 대 한 유용할 것 이다.
결과
AAV9 고려 되었고, 최근까지 가장 효과적인 AAV 벡터 serotype BBB를 건너와 주변 관리를 다음 CNS의 세포를 시험 하. Capsid 디자인에서 중요 한 사전 달성 했다 때 Deverman 그 외 여러분 보고 Cre AAV 대상 진화 재결합 기반 (만들기)17라는 capsid 선택 메서드를 사용 하 여. 이 방법을 사용 하 여, 그들은 PHP 라는 새로운 capsid를 식별 합니다. B 그들은 조직의 주입17다음 이다와 여러 CNS 영역에 있는 뉴런의 대부분 transduce 수로 보고. 이 시점에서, 그것은 해야 비록 주의 PHP. B C57/Bl6 마우스 (이 초기 격리 실험에 사용 된 변형)에 긍정적인 결과 제공, 예비 보고서 제안 효율성 스트레인 종속 방식으로 다를 수 있습니다. 추가 실험, 의심의 여지가, 더 많은 빛이 문제31에 창.
그러나, 불구 하 고 이러한 문제에는 PHP. B-의 증거-개념 유전자 치료 실험을 포함 하 여 질병 모델에서 생쥐의 CNS에 비 침 투 적인 유전자 조작에 대 한 흥미 진 진한 가능성을 제공 합니다. 따라서, 우리는 PHP를 사용 하 여 transgene 식의 효율성을 평가 하기로 결정 했습니다. B 대 AAV9, CNS 변환 다음 20092이후 주변 관리에 대 한 ' 금 표준 ' 벡터 되었습니다. 두 serotypes transgene 식에 대 한 최적의 조건 하에서 직접적인 비교를 수행 하려면 우리는 sc 게놈 구성32를 사용 합니다. 두 벡터의 유비 쿼터 스 치킨 β-걸 (CBA) 발기인 통제 transgene 녹색 형광 단백질 (GFP)에 대 한 수행. 출생 후 하루 42 (무게에서 약 20 g)에서 여성 C57/Bl6 마우스 마우스 중 scAAV2/PHP의 당 1 x 1012 vg의 복용량을 받았다. B-CBA-GFP 또는 scAAV2/9-CBA-GFP. 벡터 행정 수행 통해 꼬리 정 맥 주입 했다. 실험 구 루벤의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
3 주 postinjection, 쥐 4% (w/v) 얼음 처럼 차가운 paraformaldehyde (PFA) 다음 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 transcardial 관류를 받았다. 그들의 두뇌는 수확 했다 하 고 0.01% (w/v) 나-아 지 드/PBS 저장에 대 한 추가 분석까지 전송 하기 전에 동일한 정착 액에 하룻밤 외피에 의해 postfixation를 더 받았다. 그 후, 두뇌 진동 톰을 사용 하 여 구분 했다 그리고 immunohistochemistry 50 µ m 두께 섹션에서 수행 되었다.
Transgene 식의 수준을 평가 하기 위해 섹션 형광 염료 (안티 토끼 알 렉 사 Fluor 488)에 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여 검출 GFP (토끼 안티-GFP)에 대 한 1 차 항 체로 얼룩진 했다 (그림 4A, B ). (임의의 단위 [au])에 형광 강도 측정 확인 GFP 식 때는 사우스 캐롤라이나에서에서 크게 증가 게놈 및 PHP. B capsid는 AAV9 기준으로 사용 되었다. GFP 증가 (2105 ± 161 대 1441 ± 99 au; 뇌에서 관찰 되었다 p = 0.0032), 소 뇌 (2601 ± 196 대 1737 ± 135 au; p = 0.0032), 그리고 brainstem (3082 ± 319 대 2485 ± 88 노 소; p = 0.0038) (그림 4C).
그림 4: scAAV2/PHP의 조직 배달. B-CBA-GFP는 CNS에 높은 GFP 식으로 이어집니다. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP 또는 scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/마우스) 6 주 된 C57/Bl6 마우스 꼬리 정 맥 주입을 통해 관리 되었다. GFP은 immunohistochemistry 코로나 뇌 섹션 3 주 postinjection에 사용 하 여 검색 되었습니다. (A) 뇌 및 소 뇌와 brainstem 표시 됩니다 (B). 스케일 바 = 1 m m. (C) 상대 형광 농도의 정량화 GFP 신호 (마우스 당 10 섹션, 벡터 그룹 당 3 쥐) 각 벡터와 달성 수준을 결정 위해 수행 되었습니다. 일방통행 ANOVA 테스트 수행, 뒤에 양측 스튜던트 t-테스트; 데이터는 평균 ± 표준 편차;으로 표현 p < 0.01; au입니다. 임의 단위입니다. AAV 벡터 생산을 위해 사용 하는 pCapsid serotype 2에서에서 유전자 담당자 및 serotype PHP에서에서 유전자 모자 포함 되어 있습니다. B 또는 AAV9, 그에 따라. 이 그림에서 링 콘 수정 되었습니다 외.32. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
토론
재조합 형 AAV 벡터의 생산 여기 사용 재료와 장비 대부분의 분자 생물학 실험실 및 셀 문화 시설에 공통을 설명합니다. 그것은 사용자를 생체 외에서 그리고 vivo에서 응용 프로그램의 범위에 걸쳐 여러 세포 및 조직 유형을 대상으로 사용할 수 있는 순수 하 고, 전 임상 등급 AAV 벡터를 얻을 수 있습니다. (즉, CsCl 기반 정화), 다른 사람에 비해이 프로토콜의 가장 큰 장점 중 하나는 필요한 짧은 작업 시간입니다. 준비-사용 AAV 벡터 HEK293T 셀의 초기 transfection 후 6 작업 일의 최대에서 얻을 수 있습니다.
여러 가지 요인 부정적인 최종 수확량 또는 AAV 벡터의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 불 쌍 한 transfection 효율 낮은 바이러스 수익률33에 대 한 주요 이유 중 하나입니다. 주요 추천이 20 배 이상 passaged 하지 transfection21시간 90% 보다 큰 셀 합류 하지 않은 HEK293T 셀의 사용 이다. 또한, transfection 방법 선택 결과에 큰 영향을 있다. 이 프로토콜은 PEI의 사용을 기반으로 합니다. 페이 폴리머와 핵 산, 셀 및 매매 를 통해 endosomes34에 의해 촬영 되는 polyplexes로 알려진의 단지의 세대를 통해 세포 핵에 외 인 DNA를 제공 하는 능력으로 양이온 중합체 이다. 페이 기초를 둔 transfection은 쉽고 빠르게 다른 널리 사용 되는 방법, 칼슘 인산 염35와 DNA의 공동 강수량 등 달리 수행 하. 또한, 페이 기초를 둔 transfection는 양이온 지질과 자석 중재 transfection36의 사용 등 새로 도입된 된 다른 방법에 비해 훨씬 저렴 합니다.
정화 전략 프로토콜에 핵심 역할을 한다. 다른 방법에 비해, iodixanol 기반 담긴 빈 바이러스 성 입자 (20%)20의 더 높은 백분율을 포함 하는 경향이 있다. 이것은 오프셋, 정도, iodixanol 기반 정화 100의 입자 infectivity 비율 AAV 벡터 준비에 정기적으로 발생 하는 사실에 의해. 이는 입자 infectivity의 상당한 손실을 보고37은 기존의 CsCl 기반 절차에 비해 상당한 개선을 나타냅니다. 또 다른 일반적인 대체 AAV 벡터 정화 방법은 크로마토그래피 기반 정화입니다. 그러나,이 메서드는 특정 열이 사용 하는 각 벡터 capsid에 필요한 주요 단점: 예를 들어 AAV2 고전적인 덤플링을 열을 사용 하 여 격리 하는 동안이 방법을 작동 하지 않습니다 AAV4와 AAV5, 헤 파 린 바인딩을가지고 하지 않습니다 그들의 capsids38에 사이트입니다. 크로마토그래피 정화는 또한 비싼 고려 하 고, iodixanol 기반 정화는 일반적으로 더 작은 규모33,39, , AAV 벡터의 높은 품질 일괄 처리를 생성 하고자 하는 실험실에 적합 그러나 40. 최종 수율 및 순도 벡터의 극대화, 주의 필요 iodixanol 그라디언트를 만들 때. 다양 한 iodixanol 분수 누구의 팁 튜브의 벽에 닿아 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 ultracentrifugation 튜브에 전송 해야 합니다: 천천히 그리고 지속적으로 iodixanol는 피 펫에서 추방 되어야 한다. 40 %iodixanol 레이어, 벡터 입자 축적으로 케어 그라데이션 인터페이스20을 혼합 하지 않도록 주의가 필요 합니다. 마지막으로, 포함 하는 벡터 분수 하지 20 g. 보다 더 큰 계기와 스테인리스 무딘 바늘의 삽입으로 복구할 수 한다 벡터 복구를 최대화 하기 위해 분명 분수 전체에서 검색 해야 합니다. 이 단계 동안 타이밍이 중요 합니다. 준비의 순수성을 손상 시 키 지 않으려면 그라데이션 (오염) 다른 단계는 수집 하기 전에 컬렉션을 막으려고 필수적 이다.
가져온된 벡터 titer에 차이 포장된 입자를 생산 하는 벡터의 본질적인 기능을 또한 지정할 수 있습니다. 다른 AAV serotypes 비교 일부 AAV 벡터 더 어려운 다른 사람 (예를 들어, AAV2) 보다 더 높은 titer에서 생산 하는 보여주었다41. 강 수는 벡터의 염 단계 낮은 titer에 대 한 가능한 이유 고 쉽게 overconcentration33를 피 함으로써 막을 수 있습니다. 또한, 그것은 또한 iodixanol 그라데이션 기반 정화의 효율성은 serotypes 약간 다릅니다 있으며 따라서, 다른 serotypes 얻은 titer 불일치41관찰 될 수 있다.
마지막으로, 그것은 정량 Pcr는 DNA 정량화에 대 한 매우 정확한 방법 이지만 기술에서 몇 가지 고유의 가변성 관찰 될 수 있다 밖으로 지적 될 필요가 있다. 정확도 적정에 주로 정확한 pipetting 모든 솔루션의 적절 한 vortexing에 따라 다릅니다. 읽고 가장 정확한 titer를 보장 하는 정량 수 독립적으로 반복 하지, 그리고 얻은 값 평균. 이 프로토콜에서 제시 하는 뇌관의 선택 우리의 실험실에 사용 된 pTransgene 플라스 미드에 있는 CBA 발기인의 순서를 기반으로 합니다. CBA 발기인은 여러 세포 유형에 걸쳐 드라이브 식 벡터 필드에서 널리 이용 되는 강한 합성 발기인이 이다.입니다. 그것은 세포 (CMV) 초기 증강 요소;를 포함 하 여 여러 요소를 통합 발기인, 첫번째 exon 그리고 CBA 유전자;의 첫 번째 intron 그리고 토끼 β-globin 유전자의 결합 수락자. 그러나, 뇌관 식 카세트 (발기인, transgene, 및 규정 요소를 포함 하 여) 내에 있는 거의 모든 요소에 대 한 디자인할 수 있습니다. 일괄 처리를 통해 titer의 비교 뇌관에 벡터에 공통 영역에 대해 사용 되는 제공 가능, 이기도 합니다.
결론적으로,이 프로토콜 AAV 벡터 capsids, 게놈 구성, 발기인 유형 및 transgene 화물의 다양 한 생산에 사용할 수 있습니다. 이것은 쉽게 가장 실험적인 요구에 맞게 그들의 벡터의 마지막 특성에 맞게 사용자가 있게 됩니다. 예제 대표 결과는 PHP 사용 하 여 합니다. 효율적으로 BBB를 교차, B capsid CNS, 다음 꼬리 정 맥 주입32고효율 유전자 발현을 했다. CNS 침투 벡터의 체계적 관리 가능한 부작용2,,1732측면에서 상당한 장점이 있습니다. 침략 적 기법의 주의 피하고 있는 동안 주변 주입에 대 한 가능한 대안 intrathecal 배달, 배달 AAV 벡터의 중추 신 경계는으로 구성 된입니다. 이 배달 경로 효과적일, 주변 장기와 면역 응답42의 낮은 수준에 더 적은 오프 대상 효과 CNS에 걸쳐 transgene의 광범위 한 표현을 보여주는 입증 된다. 그러나, intrathecal 주사는 더 많은 도전, 그들은 꼬리 정 맥 주입 보다 높은 기술을 필요로.
이 기술은 수정 capsid 발전 AAV 벡터 사용 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 기회에 의해 구동 된다. 이러한 접근 등 루 경화 증, Charcot Marie이 질병, 파 킨 슨 병 알 츠 하이 머 병18현재 불 치 CNS 질환 치료에 매력적인 가능성을 제공.
공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
M.R.는 Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek 삼기엔 (FWO) 박사 친목 (133722/1204517N)에 의해 지원 되 고 인정 Fundación 심혈 관 드 콜롬비아 및 과학의 관리 부의 지속적인 지원 기술 및 혁신 (그랜트 CT-FP44842-307-2016, 프로젝트 코드 656671250485) Mm은 FWO 박사 친목 (1S48018N)에 의해 지원 됩니다. M.G.H.는 VIB 기관 그랜트와 외부 지원 티에리 Latran 재단 (잔디-VIP), 재단에서 알 츠 하이 연구 (상-FRA) (P #14006), FWO (그랜트 1513616N), 유럽 연구 회의 (ERC) (시작 그랜트에 의해 지원 되었다 281961-AstroFunc; 개념 그랜트 713755-광고-VIP의 증거). 저자는 Jeason Haughton 마우스 축산으로 그의 도움, 꼬리 정 맥 주사를 수행 그녀의 도움에 대 한 스테파니 Castaldo transfected HEK293T 셀의 이미지를 제공 하기 위한 캐롤라인 Eykens을 인정 합니다. M.G.H.는 마이클 던 롭, 피터 Hickman, 그리고 딘 해리슨을 인정 한다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Plasmid production | |||
| pTransgene plasmid | De novo design 또는 plasmid 저장소에서 획득 | N/A | 자세한 내용은 주 프로토콜의 1단계를 참조하십시오 |
| pCapsid | De novo 설계 또는 plasmid 저장소에서 획득 | N/A | 자세한 내용은 메인 프로토콜의 1단계를 참조하십시오 |
| pHelper | Agilent | 240071 | |
| Plasmid Plus maxi kit | Qiagen | 12963 | |
| QIAquick PCR 정제 키트 | Qiagen | 28104 | |
| AAV Helper-Free System | Agilent | 240071 | |
| 세포 배양 및 transfection | |||
| 둘베코' s DMEM(Modified Eagle Medium), 고포도당, 글루타민 없음 | Life Technologies | 11960-044 | FBS(1% 또는 10% v/v) 및 GlutaMAX 200mM(1% v/v)으로 DMEM을 보충한 다음 0.22 µ를 사용하여 배지를 여과 살균합니다. m 필터 |
| 소 태아 세럼 (FBS) | GIBCO | 10500-064 | |
| GlutaMAX 보충제 | GIBCO | 35050038 | |
| (200 mM) | |||
| 코닝 보틀 탑 진공 필터 시스템 | Sigma-Aldrich | CLS430769 | |
| Dulbecco ' 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS(Phosphate Buffered Saline) | GIBCO | 14190094 | |
| HEK293T 세포 | American Tissue Culture Collection CRL3216 | 수령 시 프로토콜에 설명된 대로 세포와 배양을 해동합니다. 최소한의 통과 후, 분취량에서 미래를 위해 부분 분획을 동결합니다. 항상 통로 번호 20 아래의 셀을 사용하십시오. 배양된 세포가 20회 이상 계대측정된 후에는 저장된 분취량에서 배양을 다시 시작합니다. | |
| 세포 배양 접시 | Greiner Cellstar | 639160 | 15cm 지름 배양 접시 |
| 세포 스크레이퍼 | VWR | 10062-904 | |
| 폴리에틸렌이민(PEI) | Polyscience | 23966-2 | 분말 형태의 PEI는 1 &마이크로에서 용해됩니다. g/&마이크로; L, pH=2에서 탈이온수(ddwater)의 L(HCl 사용). 비커에 넣고 2-3시간 동안 저어줍니다. 용해되면 NaOH로 pH를 다시 7로 가져옵니다. 여과, 멸균, 재현탁액을 -20°C의 1ml 분취량에 보관합니다. PEI 분취량은 여러 번 동결/해동하십시오. |
| Virkon 용액 | Fisher Scientific | NC9821357 | 로 조립된 벡터 입자와 접촉한 모든 물질을 소독 |
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| 페놀 레드 | 시그마-알드리치 | P0290 | 주의. 층류 후드 아래에서 사용 |
| 파스퇴르 피펫 | Sigma-Aldrich | Z627992 | 사용 전 살균 |
| OptiSeal 폴리프로필렌 튜브 | Beckman | 361625 | |
| Benzonase(250 U/µ L) | Sigma-Aldrich | E1014 | 즉시 사용 가능한 솔루션으로 공급 |
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| Omnifix 주사기 (5 mL) | Braun | 4617053V | |
| 블런트 주사기 바늘 | Sigma Aldrich | Z261378 | 스테인리스 스틸 316 주사기 바늘, 피펫팅 블런트 90°C; 팁 게이지 16, L 4 in. 텍스트에서는 뭉툭한 바늘 |
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| Tris Base ULTROL Grade | Merck | 648311 | 주의: 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 착용 장갑 |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher | 16500-500 | |
| Rotiphorese® 젤 30 (37,5 : 1) | Carl Roth | 3029.3 | 30 % 아크릴 아미드 및 비스 아크릴 아미드 수용액을 37.5 : 1의 비율로 사용합니다. 주의 : 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑을 착용 |
| Serva Blue G | Sigma-Aldrich | 6104-58-1 | |
| Precision Plus 사전 염색 마커 | Bio-Rad | 1610374edu | |
| 1-Butanol | Sigma-Aldrich | B7906 | 주의: 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 착용 |
| Immunohistochemistry | |||
| Rabbit anti-GFP | Synaptic Systems | 132002 | 1:300 dilution |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 1:1,000 dilution |
| Equipment | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| Vector production lab | |||
| Rotina 380 벤치탑 원심분리기 * | Hettich | 1701 | |
| Optima XPN 80 초원심분리기 * | Beckmann Coulter | A95765 | |
| Type 50.2 Ti 고정각 티타늄 로터 * | Beckmann Coulter | 337901 | |
| Entris digital 스케일 * | Sartorius | 2202-1S | |
| 온수 목욕 * | 37°C로 설정; C | ||
| 얼음 양동이 * | VWR | 10146-290 | 벡터 생산 실험실에서 사용되는 재료를 표준 실험실 영역에서 사용되는 재료와 분리하십시오 |
| Pipetboy pro * | Integra | 156,400 | |
| 눈금이 매겨진 파이펫: 셀 스타 * | Greiner bio-one | 606180 | 5 mL |
| 눈금 파이펫: 셀 스타 * | Greiner bio-one | 607180 | 10 mL |
| 의 용량눈금이 매겨진 피펫: Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | 용량 25 mL |
| CO2 incubator CB150 * | Binder | 9040-0038 | 37°C로 설정; C, 5% CO2 및 95% 습도 |
| Nuaire 안전 캐비닛 NU 437-400E * | Labexchange | 31324 | 사용 전후에 70% 에탄올과 Virkon으로 모든 표면을 청소 |
| Conventional lab | |||
| T100 thermal cycler * | Bio-Rad | 1861096 | |
| LightCycler 480 Instrument II * | Roche | 5015278001 | |
| ThermoMixer * | Eppendorf | C 5382000015 | |
| Nanodrop * | ThermoFisher Scientific | ND 2000 | |
| Mini-Protean Tetra Cell* | Bio-Rad | 1658001FC | 수제 또는 프리캐스트 겔 |
| ProteoSilver 실버 염색 키트 | Sigma-Aldrich | PROTSIL1 | 낮은 배경의 고감도 단백질 검출 |
| Centrifuge 5804 R * | Eppendorf | B1_022628045 | 중간 용량(최대 250 mL)을 위한 고속 원심분리기 |
| Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | 5 mL |
| Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | 25 mL |
| Graduated pipette Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | 25 mL |
| 필터 팁 * | Greiner bio-one | 750257 | 1250 &마이크로; L |
| 필터 팁 * | Greiner bio-one | 738257 | 300 µ L |
| 필터 팁 * | Greiner bio-one | 771257 | 10 µ L |
| 뚜껑이 있는 얼음 양동이 * | VWR | 10146-290 | |
| 미니 다이어프램 진공 펌프, VP 86 * | VWR | 181-0065 | |
| Pipetman P2 | Gilson | F144801 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P100 | Gilson | F123615 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| * 별표가 표시된 재료는 고가의 장비이며 일반적으로 여러 실험실에서 공유되는 중앙 인프라 항목입니다. 가능한 경우 이러한 항목을 동등한 항목으로 교체할 수도 있습니다. 다른 초원심분리기를 사용하는 경우 올바른 로터와 원심분리기 튜브를 선택하는 데 주의를 기울여야 합니다. |
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